油菜種子發(fā)育早期種皮顏色快速鑒定的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)應(yīng)用生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種油菜種子發(fā)育早期種皮顏色快速鑒定的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]研究表明，在相同遺傳背景下，黃色種皮油菜(簡稱黃籽油菜)與黑色種皮油菜(黑籽油菜)相比具有種皮薄、含油量高、油中色素和雜質(zhì)少、木質(zhì)素含量低等優(yōu)點(diǎn)。目前，黃籽油菜育種是目前油菜育種的熱點(diǎn)。油菜種皮顏色要到成熟是才能顯現(xiàn)出來，無論是黑籽還是黃籽，種子成熟后胚都是黃色。種子的顏色是由種皮顏色決定的，黑籽油菜的種皮為黑色;黃籽油菜的種皮為透明，黃籽油菜的種子表現(xiàn)出胚的黃色。無論是黃籽還是黑籽在種子發(fā)育早期，種皮都是綠色的，育種者在種子發(fā)育早期不能對種皮顏色進(jìn)行選擇，需要在種子成熟后才能對種皮顏色性狀進(jìn)行選擇，這樣存在著費(fèi)時、費(fèi)工、費(fèi)錢等問題。因此，找到一種快速鑒定種子種皮顏色的方法，可以在種子發(fā)育早期進(jìn)行種皮顏色的鑒定方法，對油菜黃籽育種有十分重要的意義。
[0003]原花色素是導(dǎo)致擬南芥種子顏色差異的關(guān)鍵物質(zhì)，油菜與擬南芥同屬十字花科，我們推測原花色素可能是油菜種子顏色差異的決定物質(zhì)。我們在研究油菜黃黑籽形成的生物途徑及組成成分時發(fā)現(xiàn)，二氫黃酮醇4-還原酶基因(DFR)、花色素合成酶基因(ANS)和花色素還原酶基因(ANR)在油菜黃黑籽種子發(fā)育早期表達(dá)有差異，DFR等基因在黃籽種皮中不表達(dá)，我們推斷導(dǎo)致黃黑籽差異可能是DFR等基因所控制合成的物質(zhì)(黃酮3，4_ 二醇等類似物，原花色素合成的前體物質(zhì))導(dǎo)致的，黃籽種皮中可能沒有黃酮3，4_二醇等物質(zhì)。通過實(shí)驗研究發(fā)現(xiàn)三氟乙酸、鐵銨礬等物質(zhì)在酸性和高溫條件下，能與油菜種皮中的原花色素合成的前體物質(zhì)結(jié)合，產(chǎn)生紫紅色物質(zhì)，溶液顏色變?yōu)樽霞t色。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種直觀、經(jīng)濟(jì)、簡便的油菜種子發(fā)育早期快速鑒定種皮色的方法，以便應(yīng)用于油菜的黃籽育種，并應(yīng)用于雜交油菜種子純度的鑒定，對于黃色種皮油菜的雜交種進(jìn)行純度的早期鑒定。
[0005]本發(fā)明采用的技術(shù)方案:一種在油菜種子發(fā)育早期快速鑒定種皮顏色的方法，其特征是把授粉8天后的種皮放入透明容器中，加入溶液A在常溫下浸泡15-20分鐘，然后加入染色試劑B，煮沸15-30分鐘后，在冰上冷卻20-25分鐘，根據(jù)反應(yīng)后液體顏色的變化來鑒定油菜種子的顏色，放入黑籽油菜種皮的容器中液體顏色變?yōu)樽霞t色，而放入黃籽油菜種皮的容器中液體顏色沒有紫紅色產(chǎn)生。
[0006]所述的溶液A與染色試劑B的體積比為I: 5-7。
[0007]所述的溶液A由甲醇、丙酮、水、三氟乙酸組成，其體積比為38-42: 30-34: 26-30: I。
[0008]所述的染色試劑B由正丁醇、6mol/L的鹽酸和3%鐵銨礬溶液組成，它們的體積比為89:10:1。
[0009]本發(fā)明提出的在油菜種子發(fā)育早期快速鑒定種皮顏色的方法，其步驟如下:
(I)配置溶液A:由甲醇、丙酮、水、三氟乙酸組成，其體積比依次為38-42: 30-34: 26-30:1，混勻。
[0010](2)配置染色試劑B:由正丁醇、6mol/L的鹽酸和3%鐵銨礬溶液組成，它們的體積比依次為89:10:1，混勻。
[0011](3)取10-20粒授粉8天后的種皮，放入透明的容器中。
[0012](4)加入I毫升溶液A，使種皮完全浸泡在液體中，常溫下放置15-20分鐘。
[0013](5)加入5-7毫升染色試劑B，煮沸15-30分鐘。
[0014](6)在冰上冷卻20-25分鐘，觀察液體顏色的變化。放有黑籽油菜種皮的容器中液體變?yōu)樽霞t色;而放有黃籽油菜種皮的容器中的液體沒有紫紅色產(chǎn)生。
[0015]本發(fā)明人從油菜種皮顏色形成的生物學(xué)等途徑入手，深入研究了種皮顏色形成途徑中的關(guān)鍵酶的作用機(jī)理、酶作用的產(chǎn)物及其相互關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在油菜黃黑籽種皮發(fā)育過程中差異的物質(zhì)是黃酮3，4_ 二醇及類似物等(這些物質(zhì)是無色的)。本發(fā)明用化學(xué)染色法，加入試劑與種子中黃酮3,4-二醇等物質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)生紅色物質(zhì)，從而能簡便、直觀在種子發(fā)育早期區(qū)分黃黑籽。該方法操作簡單，分析速度快，使用試劑價格低廉。
【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例1:
(I)配置溶液A:由甲醇、丙酮、水、三氟乙酸組成，其體積比依次為38:30:26:1，混勻備用。
[0017](2)配置染色試劑B:由正丁醇、6mol/L的鹽酸和3%鐵銨礬溶液組成，它們的體積比依次為89:10:1，混勻備用。
[0018](3)分別取10粒授粉8天后的黑籽芥菜型油菜紫葉芥、平陸芥菜、棱角6號和黃籽芥菜型油菜四川黃籽、內(nèi)蒙大黃的種皮放入透明的容器中。
[0019](4)加入I毫升溶液A，使種皮完全浸泡在液體中，常溫下放置15分鐘。
[0020](5)加入5毫升染色試劑B，煮沸20分鐘。
[0021 ] (6)在冰上冷卻20分鐘，觀察液體顏色的變化。
[0022](7)結(jié)果發(fā)現(xiàn)放有紫葉芥、平陸芥菜、棱角6號黑籽油菜種皮的容器中液體變?yōu)樽霞t色;而放有黃籽油菜四川黃籽、內(nèi)蒙大黃的種皮的容器中的液體沒有紫紅色產(chǎn)生。
[0023]實(shí)施例2:
取四川黃籽與紫葉芥雜交獲得自交獲得F2代植株(80株，分別編號，成熟后觀察植株上油菜種子的顏色)授粉后8天種子的種皮20粒分別放在透明的試管中；加入2毫升實(shí)施例1中的溶液A，使種皮完全浸泡在液體中，常溫下放置20分鐘;再加入實(shí)施例1中的7毫升染色試劑B，煮沸25分鐘；在冰上冷卻25分鐘，觀察各試管顏色的變化。結(jié)果表明在試管中溶液變?yōu)樽霞t色對應(yīng)的71株種子成熟后種子全部為黑色，試管中溶液未變紅色對應(yīng)的9株種子成熟后種子全部為黃色。因此根據(jù)溶液顏色的變化可以早期鑒定油菜種子的顏色。
[0024]實(shí)施例3:
(I)配置溶液A:由甲醇、丙酮、水、三氟乙酸組成，其體積比依次為42:30:34: 30:1,混勻備用。
[0025](2)配置染色試劑B:由正丁醇、6mol/L的鹽酸和3%鐵銨礬溶液組成，它們的體積比依次為89:10:1，混勻備用。
[0026](3)分別取10粒授粉后8天的黑籽甘藍(lán)型油菜湘油15號、98C40和取授粉后8天的黃籽甘藍(lán)型油菜Bny4 ,Bny6的種皮的放入試管中。
[0027](4)加入I毫升溶液A，使種皮完全浸泡在液體中，常溫下放置20分鐘。
[0028](5)加入5毫升染色試劑B，煮沸20分鐘。
[0029](6)在冰上冷卻20分鐘，觀察液體顏色的變化。
[0030](7)結(jié)果發(fā)現(xiàn)放有黑籽油菜甘藍(lán)型油菜湘油15號、98C40種皮的容器中液體變?yōu)樽霞t色;而放有黃籽油菜Bny4、Bny6種皮的容器中的液體沒有紫紅色產(chǎn)生。
[0031]實(shí)施例4:
分別取授粉8天后的埃塞俄比亞芥黑籽和埃塞俄比亞芥黃籽的種皮15粒放入試管中；加入2毫升實(shí)施例3中的溶液A，使種皮完全浸泡在液體中，常溫下放置25分鐘;再加入施例3中的5毫升染色試劑B，煮沸30分鐘;在冰上冷卻15分鐘，觀察試管顏色的變化。結(jié)果表明在試管中放有埃塞俄比亞芥黑籽的溶液變?yōu)樽霞t色，而試管中放有埃塞俄比亞芥黃籽的溶液未出現(xiàn)紫紅色。
【主權(quán)項】
1.一種在油菜種子發(fā)育早期快速鑒定種皮顏色的方法，其特征是把授粉8天后的種皮放入透明容器中，加入溶液A在常溫下浸泡15-20分鐘，然后加入染色試劑B，煮沸15-30分鐘后，在冰上冷卻20-25分鐘，根據(jù)反應(yīng)后液體顏色的變化來鑒定油菜種子的顏色，放入黑籽油菜種皮的容器中液體顏色變?yōu)樽霞t色，而放入黃籽油菜種皮的容器中液體顏色沒有紫紅色產(chǎn)生。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在油菜種子發(fā)育早期快速鑒定種皮顏色的方法，其特征是，所述的溶液A與染色試劑B的體積比為I: 5-7ο3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在油菜種子發(fā)育早期快速鑒定種皮顏色的方法，其特征是，所述的溶液A由甲醇、丙酮、水、三氟乙酸組成，其體積比為38-42: 30-34: 26-30: I。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的在油菜種子發(fā)育早期快速鑒定種皮顏色的方法，其特征是，所述的染色試劑B由正丁醇、6mol/L的鹽酸和3%鐵銨礬溶液組成，它們的體積比為89:10:1。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種在油菜種子發(fā)育早期快速鑒定種皮顏色的方法，利用化學(xué)染色法，加入與類黃酮特異結(jié)合的染料對黃黑籽油菜種皮進(jìn)行染色，取授粉8天后油菜種子的種皮，放入含有甲醇、丙酮、三氟乙酸正丁醇、鐵銨礬的酸性溶液的透明容器中，在常溫下放置15-20分鐘，然后煮沸15-30分鐘，在冰上冷卻20-25分鐘。盛有黑籽種皮的容器中的溶液變?yōu)樽霞t色，而盛黃籽種皮的容器中的溶液沒有紫紅色產(chǎn)生，從而達(dá)到鑒定油菜種皮顏色的目的。
【IPC分類】G01N21/78
【公開號】CN105510319
【申請?zhí)枴緾N201510887008
【發(fā)明人】嚴(yán)明理, 李隆, 劉麗莉, 丁素萍, 王營
【申請人】湖南科技大學(xué)
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年12月7日