專利名稱：細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)固定劑組合物及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種固定劑組合物，該固定劑組合物在細(xì)胞學(xué)方法中的用途，和制備顆粒狀物體，如細(xì)胞學(xué)、血液學(xué)和微生物學(xué)標(biāo)本，用于細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)檢查的方法，包括將顆粒狀物體收集在均一的層，優(yōu)選單層中，并將顆粒固定于本發(fā)明的組合物中。
背景技術(shù)：
在各種各樣的技術(shù)中，從液體中分離物質(zhì)(通常是顆粒物)的能力和/或方便性是測(cè)試液體中物質(zhì)存在能力的關(guān)鍵。與樣品制備有關(guān)的干擾太常見，甚至達(dá)到分不清細(xì)胞的程度，使得該過程不是充分可靠的，或者太昂貴。在涉及檢查和/或診斷的許多其它領(lǐng)域，包括環(huán)境測(cè)試，放射性研究，癌癥篩選，細(xì)胞學(xué)檢查，微生物學(xué)測(cè)試，和有害廢料污染(在此僅舉幾例)也遇到這樣的問題。
樣品的細(xì)胞學(xué)檢查的全部要求，是從病人獲得細(xì)胞樣品，通常可使用任何一種熟知的技術(shù)進(jìn)行，包括下列技術(shù)的任一種直接刮，刮或拭抹某區(qū)域(如子宮頸樣品)，刷，用標(biāo)準(zhǔn)制備級(jí)離心收集并濃縮液體樣品，細(xì)針吸取或任何其它已知的方法，或收集體液(如從胸腔、膀胱，或脊柱管中獲得的體液)。在常規(guī)手工細(xì)胞學(xué)檢查中，然后將液體中的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一張載玻片上以觀察。在常規(guī)的自動(dòng)細(xì)胞學(xué)檢查中，將一組濾片置于懸液中，該濾片組可分散細(xì)胞，并將細(xì)胞捕獲在濾片上，取出濾片。并將其置于一片顯微鏡載玻片上。在所有這些努力中，樣品制備方法的限制因素是充分將固態(tài)物質(zhì)與其液體載體(如各種液體，例如生理性、生物性和環(huán)境性液體)分開，和簡(jiǎn)便有效的收集和濃縮固態(tài)物，使其成為易于用顯微鏡檢查的形式。
最佳制備顆粒物，用于顯微鏡檢查中的另一個(gè)限制因素，涉及用來將顆粒物固定在顯微鏡載玻片等之上的溶液和/或幾種溶液。
已開發(fā)了存放尿或其它生物性液體標(biāo)本的許多容器，以便不需除去尿液或生物液容器的蓋子就可測(cè)試液體生物學(xué)標(biāo)本?，F(xiàn)有技術(shù)無一解決了如何將在均勻?qū)又械募?xì)胞轉(zhuǎn)移到載玻片上供檢查，而同時(shí)在取得細(xì)胞后保留液體的問題。
現(xiàn)在，采用特別的容器來收集體液樣品，供細(xì)胞學(xué)檢查。這些容器常含有保存溶液，供從樣品采集點(diǎn)運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室的途中保存細(xì)胞學(xué)標(biāo)本。另外，還用拭子、涂片、沖洗或刷子將從體腔收集的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本保存在裝有固定劑(如乙醇或丙酮固定劑)的特別容器內(nèi)，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到載玻片或膜上染色或檢查。
診斷微生物學(xué)和/或細(xì)胞學(xué)(尤其是在臨床病理學(xué)領(lǐng)域中)，是基于顯微鏡檢查細(xì)胞和其它顯微鏡分析。通常診斷的準(zhǔn)確度和最佳的可判斷標(biāo)本的制作取決于恰當(dāng)?shù)臉悠分苽?。免疫?xì)胞化學(xué)和圖象分析的新方法要求制備物可重復(fù)制取、快速、無生物危害、和便宜。本發(fā)明的不同細(xì)胞制備技術(shù)著重于解決不一致的細(xì)胞密度、不均勻的細(xì)胞分布和空氣干燥的人工制備物等問題。這些制備方法已導(dǎo)致具有優(yōu)良形態(tài)學(xué)的細(xì)胞均勻分布，從而改進(jìn)了光學(xué)顯微鏡的可視性，并可使用圖象細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。
本發(fā)明的固態(tài)物質(zhì)制備技術(shù)致力于解決不一致的物質(zhì)密度、不均勻的物質(zhì)分布和因樣品制備步驟過多造成的樣品損失等問題。本發(fā)明的制備物導(dǎo)致固體均勻分布，其具有優(yōu)良的形態(tài)，改進(jìn)的可視性，而且易于定位和采用光吸收分析，而不需要對(duì)樣品作進(jìn)一步操作和制備。
適當(dāng)固定(即保存)衍生自人或動(dòng)物組織細(xì)胞收集物的細(xì)胞材料(如細(xì)胞、細(xì)胞積聚物和小組織片斷)是準(zhǔn)確診斷疾病，尤其是癌癥的先決條件。在獲得材料后，必須盡可能快的固定細(xì)胞材料，防止細(xì)胞變形。
可通過熟知的涂片或液體技術(shù)制備構(gòu)成細(xì)胞學(xué)材料的可檢查形式的細(xì)胞標(biāo)本。由于這些標(biāo)本在收集后到進(jìn)一步染色，加蓋玻片等之前有相當(dāng)?shù)拈g隔時(shí)間，因此給細(xì)胞材料使用一種固定劑，來保存并固定細(xì)胞是重要的。
空氣干燥和四色染色的細(xì)胞標(biāo)本雖然在外國(guó)很流行，但在美國(guó)不常使用。當(dāng)然，將載玻片浸入醇溶液，或噴灑固定劑來浸透載玻片，或直接將細(xì)胞材料置放入醇溶液的濕固定法，是細(xì)胞固定的已知方法。細(xì)胞固定是可解釋的帕帕尼科拉氏染劑(Papanicolaou)，蘇木精(Hematoxylin)和伊紅(Eosin)或其它染色的細(xì)胞標(biāo)本載玻片的先決條件。
一般含有或不含有其它添加劑(如聚乙二醇)，濃度范圍在50％到95％的醇溶液(v/v甲醇、乙醇、異丙醇)，是濕法固定所用的已知溶液。然而當(dāng)使用高于50％(v/v)的醇溶液來收集和固定富含蛋白質(zhì)的液體時(shí)，會(huì)形成蛋白沉淀，其隨后會(huì)變硬。蛋白沉淀使固定的細(xì)胞材料難于轉(zhuǎn)移到載玻片上供檢查，不論轉(zhuǎn)移是通過直接涂到載玻片上，還是通過小孔濾膜細(xì)胞過濾，或?qū)⒓?xì)胞離心到涂有粘合劑(如鉻鋁明膠)的載玻片上都有困難。
一個(gè)多世紀(jì)以來，用來保存和制備組織，供分析評(píng)估的組織固定劑組合物，一直是以甲醛為基礎(chǔ)的。用于組織保存和制備精細(xì)切碎的組織，供顯微鏡檢查的標(biāo)準(zhǔn)組合物是福爾馬林。福爾馬林是3-10％的甲醛水溶液，通常含有約15％的甲醇。醇能改善溶液的保存性能。盡管具有許多缺點(diǎn)，最突出的是其高毒性和刺激性，但福爾馬林仍是實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用中通常所選的固定劑，因?yàn)樗苎杆倥c接觸的組織表面反應(yīng)，并使細(xì)胞保存最大化。甲醇可能對(duì)組織的質(zhì)地有副作用，使組織太脆或更常見的是太軟，因而在載玻片制作中不易切成片。它還可產(chǎn)生著色的人為制品或干擾染色的雜質(zhì)。但含甲醇的福爾馬林提供了能滿意的切片和染色，供顯微鏡檢查的保存良好的組織。
組織學(xué)家經(jīng)長(zhǎng)期努力已開發(fā)出有效的免疫組織化學(xué)固定劑和形態(tài)學(xué)固定劑。另外，需要保存形態(tài)學(xué)細(xì)節(jié)，保存組織抗原，以便進(jìn)行免疫組織學(xué)檢查和對(duì)組織中的抗原定位。
這些固定劑使蛋白質(zhì)不溶。例如，可用甲醛作為交聯(lián)劑，在醛基和特定氨基酸之間形成共價(jià)鍵，來穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，并將細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化成凝膠，從而限制了自溶性酶的運(yùn)動(dòng)。另外，可用醇作為固定劑，通過變性來沉淀蛋白質(zhì)。
優(yōu)選固定劑必須阻止自溶和腐敗，并保存形態(tài)學(xué)細(xì)節(jié)和抗原性。不幸的是，有效的形態(tài)學(xué)固定劑不一定是有效的免疫組織化學(xué)固定劑。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明涉及一種固定劑組合物和保存細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)標(biāo)本的方法。本發(fā)明的組合物和方法特別適用于從生物性、生理性和環(huán)境性液體中分離物質(zhì)，并以改進(jìn)的方式提供顆粒狀物質(zhì)用于檢查。
本發(fā)明針對(duì)含有醛交聯(lián)劑、多元醇和去污劑的細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)固定劑。該組合物的醛通常是C1-C6鏈烷基或C1-C8亞烷基二醛，如戊二醛、甲醛、多聚甲醛、乙醛、丙醛或丁醛。通常，組合物的多元醇可是乙二醇、丙二醇、甘油、山梨醇和甘露醇。優(yōu)選的去污劑是非離子去污劑，如Triton X-100、Nonidet P40、IgepalCa-630、Tween85、Tween80或Tween65。
本發(fā)明的固定劑組合物還可包含下列任何一種物質(zhì)維持溶液pH在約4和約7之間的緩沖液，如Tris或磷酸緩沖鹽；核蛋白沉淀劑，如乙酸；溶血?jiǎng)?，如乙酸；同滲容摩維持劑，如葡萄糖或氯化鈉；溶劑，如乙醇，異丙醇，甲醇和水；酮，如丙酮或甲基乙基酮；細(xì)胞包裹物質(zhì)，如聚乙二醇(PEG)或Carbowax和溶粘蛋白劑，如二硫蘇糖醇(DTT)或乙?；腚装彼?。
本發(fā)明的固定劑組合物優(yōu)選含有濃度約0.2-4.0％的醛，濃度約0.5-2.0％的甘油，和濃度約0.01-0.05％的去污劑。本發(fā)明的組合物還可包含濃度約35-45％的醇，濃度約2.0-3.0％的丙酮，濃度約1.0-3.0％的聚乙二醇和緩沖液。
本發(fā)明還介紹通過用有效量的本發(fā)明的組合物固定標(biāo)本，來保存細(xì)胞學(xué)或組織學(xué)標(biāo)本的方法。
本發(fā)明還提供一種組織固定劑組合物，用于組織病理學(xué)用途，該組合物能迅速滲入組織表面，而最大程度的保存細(xì)胞，留下最少的著色人為制品，并允許準(zhǔn)確染色。本發(fā)明還提供一種細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)固定劑配方，來固定并保存懸液中的細(xì)胞、細(xì)胞積聚物和小組織片段。
本發(fā)明還提供一種固定劑配方，其可保存偶然與細(xì)胞學(xué)材料一起收集的組織樣品，用于進(jìn)一步組織學(xué)加工。
本發(fā)明還提供一種固定劑配方，其使細(xì)胞、細(xì)胞積聚物和組織片段的懸液能在郵政運(yùn)輸遇到的條件下運(yùn)輸，使得遙遠(yuǎn)的用戶在沒有細(xì)胞學(xué)家、細(xì)胞技師、醫(yī)師或其它對(duì)制備細(xì)胞樣品有經(jīng)驗(yàn)的人員存在時(shí)，能固定細(xì)胞標(biāo)本用于以后的加工，并可制備技術(shù)上滿意的細(xì)胞樣品玻片。
本發(fā)明在另一方面涉及制備組織用于切片、染色和/或顯微鏡觀察的方法，其中在脫水前，用本發(fā)明儲(chǔ)藏穩(wěn)定的組織固定劑溶液保存標(biāo)本組織。
本發(fā)明公開了一種獨(dú)特的細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)固定劑配方和使用該配方的方法。該配方能固定并保存懸液中的單個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞積聚物和小組織片段；使蛋白質(zhì)在該懸液中的沉淀最小化；選擇性除去或減少細(xì)胞材料和細(xì)胞學(xué)標(biāo)本玻片中的紅血細(xì)胞的污染；保存和細(xì)胞材料一起偶然收集的組織樣品，用于進(jìn)一步組織學(xué)加工；并使細(xì)胞材料能在通常的郵政運(yùn)輸中碰到的條件下運(yùn)輸，從而使遙遠(yuǎn)的用戶在不能遇到細(xì)胞學(xué)家、細(xì)胞技師或其它對(duì)制備細(xì)胞樣品有經(jīng)驗(yàn)的人員時(shí)，能制備技術(shù)上滿意的細(xì)胞樣品玻片。
發(fā)明詳述本發(fā)明的組合物包含一種或多種溶劑，優(yōu)選是烷基醇，在約35％和約45％體積之間；酮，約2％和約3％體積之間；稀釋劑，優(yōu)選二醇或三醇，從約1％到約3％體積；交聯(lián)劑，優(yōu)選醛，約0.2％-4％體積；甘油，約0.5％-2％體積；一種或多種去污劑和/或分散劑，優(yōu)選非離子型，約0.01％-0.05％體積；和緩沖液，約45-65％體積。在本發(fā)明的優(yōu)選例中，該組合物的pH是約4-7。
本發(fā)明還包括如上所述的固定劑組合物在細(xì)胞學(xué)和/或組織學(xué)方法中的用途。本發(fā)明的組合物特別適合與顆粒物收集裝置一起使用，其選自下列公開的美國(guó)專利5,471,994；美國(guó)專利5,301,685；1997年8月4日提交的美國(guó)系列號(hào)(USSN)08/905,833；1997年11月4日提交的USSN 08/963,873；1998年3月13日提交的USSN 09/052,005,1998年4月1日提交的USSN 09/053,010,USSN08/963,873；PCT/US/16349 USSN 09/050,010；PCT/US98/17524；USSN 09/185,606和PCT/US98/23222。
本發(fā)明還包括制備細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)標(biāo)本的方法，和制備顆粒物，如細(xì)胞學(xué)、血液學(xué)和微生物學(xué)標(biāo)本的方法，用于通過收集顆粒物，通過將顆粒物收集在均勻?qū)印?yōu)選單層中，并將顆粒固定在本發(fā)明的組合物中，供檢查。
表1總結(jié)了本發(fā)明固定劑配方的組分范圍和優(yōu)選濃度
本發(fā)明組合物的示范性配方包含；約40％體積的醇(如異丙醇和甲醇)，約2-3％的丙酮，約1.0-3.0％的聚乙二醇，約2％體積的甲醛(如商業(yè)可購(gòu)得的福爾馬林，3-37％v/v水溶液，有時(shí)含甲醇)；和約58％體積的緩沖液(如Tris)。該配方的優(yōu)選pH是約5.0±0.5。實(shí)施例1顯示了另一種有用的配方。
本發(fā)明的組合物包含一種或多種能滲入組織或細(xì)胞，使細(xì)胞脫水，和/或抑制細(xì)菌和病毒活性的溶劑。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，溶劑是鏈烷基醇的混合物，它能緩慢滲透，并當(dāng)與其它試劑聯(lián)用時(shí)，迅速固定樣品。它通過沉淀使蛋白變性，沉淀糖元，并溶解脂肪和脂類。鏈烷基醇可以是任何熟知的具有1到4個(gè)碳原子的醇，如甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇和各種分枝的丁醇。最優(yōu)選的溶劑是甲醇和異丙醇的混合物，通常分別是約30％和10％體積。
酮是與醇具有相似作用的固定劑，除了糖元保存不太好。酮起固定劑的作用，另外使全部組合物滲入細(xì)胞。優(yōu)選的酮是丙酮。
標(biāo)本上的涂層幫助保護(hù)細(xì)胞或組織免受干燥的影響。優(yōu)選的涂層是聚乙二醇(PEG)或Carbowax。涂層對(duì)防止細(xì)胞皺縮和保持核細(xì)節(jié)是重要的。
甘油等多元醇在樣品加工中防止細(xì)胞干燥。在固定劑溶液中已放置了一段長(zhǎng)時(shí)間后的細(xì)胞通常會(huì)由于固定過程而變硬，從而較難于在玻片上分散開。多元醇幫助細(xì)胞在載玻片上變得平坦。優(yōu)選的多元醇是7二醇、丙二醇、甘油、山梨醇和甘露醇，最優(yōu)選的是甘油。
交聯(lián)劑與蛋白質(zhì)末端基團(tuán)反應(yīng)，來交聯(lián)分子并產(chǎn)生不溶性產(chǎn)物。蛋白基團(tuán)涉及氨基、亞氨基和酰氨基、肽、羥基、羰基和巰基。在相似基團(tuán)NH2和NH之間也常形成亞甲基橋，但認(rèn)為它經(jīng)過水洗是可逆的。一些交聯(lián)劑，如甲醛，是抗菌劑。
優(yōu)選的交聯(lián)劑是醛，如C1-C6鏈烷醛或C1-C8亞烷基二醛。優(yōu)選的醛類交聯(lián)劑是戊二醛、甲醛、多聚甲醛、乙醛、丙醛或丁醛。最優(yōu)選的是甲醛。
去污劑，如非離子型去污劑，被用作分散劑，并使蛋白質(zhì)和膜組分溶解，來減少細(xì)胞的積聚。優(yōu)選去污劑是Triton X-100,Nonidet P40,Igepal Ca-630,Tween85,Tween80，和Tween65。
緩沖液將溶液pH維持在約4-7之間，并提供運(yùn)輸?shù)幕|(zhì)。優(yōu)選的緩沖液是Tris，一種熟知的緩沖液。根據(jù)本發(fā)明，緩沖液還可包含使核蛋白沉淀的固定劑，和一種或多種同滲容摩維持劑。優(yōu)選核蛋白沉淀基是乙酸，它也起溶血?jiǎng)┑淖饔茫闪呀饧t血細(xì)胞。通常乙酸以約0.2％-2.0％體積存在。優(yōu)選的同滲容摩維持劑是葡萄糖，通常范圍在約0.1％-0.2％重量，和氯化鈉，通常范圍是約0.7％-0.8％重量。
在本發(fā)明的固定劑組合物中包括一種溶粘蛋白劑，用于從粘液樣標(biāo)本，如痰、支氣管肺泡洗液和灌洗液、胃洗液和灌洗液制備的顆粒單層。用于本發(fā)明的溶粘蛋白劑的例子包括二硫蘇糖醇(DTT)、乙?；腚装彼?、溴芐環(huán)己銨、羰基半胱氨酸、磺胺嘧啶、酸性甲酯(letosteine)、溶菌酶、鹽酸、半胱甲酯、巰乙磺酸鈉、水合蒎醇、硬脂酰甘氨酸(stepronin)、巰丙酰甘氨酸和四丁酚醛Tyloxapol。優(yōu)選溶粘蛋白劑是二硫蘇糖醇(DTT)或乙?；腚装彼?，通常以范圍0.1-1.0％克使用。優(yōu)選范圍是0.2-0.5％。DTT是水溶性試劑，完美適用于保護(hù)巰基。DTT易于滲透細(xì)胞膜并以其低氧化還原電勢(shì)防止蛋白質(zhì)的氧化。DTT還將單硫醇維持在還原態(tài)，并減少二硫化物的數(shù)量。
在優(yōu)選例中，所述活性固定劑成分可溶于合適的溶劑，如蒸餾水中，然后可以許多本領(lǐng)域技術(shù)人員明白的方式使用該溶液作為固定劑。例如，可用固定劑溶液來保存待運(yùn)輸或攜帶到檢查點(diǎn)的組織樣品。在該過程中，用本發(fā)明的試劑裝滿具有液體緊密密封的小試管或罐，并將組織樣品置于含該試劑的小管中，來保存樣品，直到它們到達(dá)能進(jìn)行進(jìn)一步加工的地方。還可用約80-0％體積的水和其它溶劑。可使用任何不改變配方的重要化學(xué)和物理學(xué)特征的任何合適稀釋劑。
可用任何已知常規(guī)方法，如用石蠟、切片裝置、染色、制成玻片標(biāo)本，或在顯微鏡或其它檢查前所用的其它一般步驟，制備用于組織學(xué)研究的、使用本發(fā)明固定劑的用于研究的組織。因此本發(fā)明提供了安全、便利和有效的固定劑溶液，可用于許多使用這類溶液的已知組織學(xué)程序中。
本發(fā)明還包括收集液體，如生物性、生理性或環(huán)境性液體，不經(jīng)離心從液體中取出所要的物質(zhì)，并診斷和測(cè)試該物質(zhì)的裝置和方法。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，在一個(gè)收集點(diǎn)上收集顆粒物。在本發(fā)明的最優(yōu)選例中，將顆粒物收集在單層中，通常以預(yù)先確定的空間排列。
本發(fā)明還包括如上所述的固定劑組合物，優(yōu)選與使樣品容器繞著固定攪拌器等旋轉(zhuǎn)來分散樣品中的顆粒的儀器和方法一起使用。
本發(fā)明還如上所述，與改進(jìn)的收集和加工液體(通常是生物液)的裝置一起使用固定劑組合物；該裝置包括具有一個(gè)或多個(gè)下列部分的顆粒物收集室收集點(diǎn)；從液體中分離顆粒物的膜；多孔支持物；具有至少一個(gè)完全鉆孔，優(yōu)選鉆孔位置靠近多孔支持物周圍的多孔支持物，所述鉆孔提供了額外的表面張力，從而當(dāng)框架開放時(shí)，使濾膜能保持在多孔支持物上，而使膜暴露，用于進(jìn)一步加工；在收集室中至少建立了兩條液體流動(dòng)通道的多孔排列；將收集的顆粒物裝置成預(yù)先確定的圖案的多孔排列底座；具有同心管道的收集室；具有一種或多種有彈性成員的管道；具有一種或多種有彈性成員的收集室底座；具有柱的收集室底座或基座；具有一種或多種預(yù)先確定的表面修飾的收集室底座；具有一個(gè)或多個(gè)促進(jìn)顆粒物在收集點(diǎn)上按預(yù)先確定的空間排列的元件的底座；和促進(jìn)液體流過該室的結(jié)構(gòu)。
與本發(fā)明的固定劑組合物一起使用的儀器還可包括適合于在收集室中混合收集的標(biāo)本，和/或使之成形的結(jié)構(gòu)。示范性結(jié)構(gòu)包括但不限于具有可轉(zhuǎn)動(dòng)的蓋，或蓋子的一部分可轉(zhuǎn)動(dòng)的收集室；與收集容器相結(jié)合的，可移動(dòng)的蓋或蓋的一部分；和伸入收集室的管道等，所述管道包括一或多個(gè)能混合標(biāo)本的部件。蓋子的一部分與液體密封墊中蓋子的一部分緊密接合。蓋子還可包含一部分，它與液體密封但不是流體密封墊中蓋子的一部分緊密接合。
本發(fā)明的組合物、裝置和方法可安裝在半自動(dòng)系統(tǒng)或結(jié)構(gòu)，或全自動(dòng)系統(tǒng)或結(jié)構(gòu)中或用于手動(dòng)的系統(tǒng)或結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明還包括制備用于顯微鏡檢查的、用本發(fā)明的裝置加工樣品，并在該裝置中的收集點(diǎn)上收集顆粒物，從而制備樣品。
本發(fā)明還包括分析物質(zhì)的方法，該方法包含將樣品收集在收集容器中，將物質(zhì)收集在收集元件上，并將收集在收集元件上的物質(zhì)轉(zhuǎn)移到顯微鏡載玻片上等。優(yōu)選兩個(gè)收集步驟都在同一儀器中進(jìn)行。
在本發(fā)明的優(yōu)選例中，一個(gè)標(biāo)本杯包括收集液體標(biāo)本的室，和在與該室流動(dòng)聯(lián)系中，用于分離液體中顆粒物，并將分離的顆粒物收集在收集區(qū)上的顆粒物分離室或艙。在本發(fā)明的最優(yōu)選例中，將分離的顆粒物收集在收集區(qū)上的單層中。本發(fā)明的優(yōu)選例還包括與顆粒物分離室流動(dòng)聯(lián)系的空心管。更優(yōu)選的，該空心管包括混合標(biāo)本和/或分散標(biāo)本中的顆粒物的裝置。示范性裝置包括但不限于攪拌器、翼片、刷子、抹、帚、刮勺等。本發(fā)明的優(yōu)選例包括具有刷子的管。示范性的刷子公開于美國(guó)專利4,759,376，在此引入以供參考。
如本文所用，“樣品”指任何與固體物質(zhì)，如與顆粒物質(zhì)聯(lián)合的液體，而且可理想的從樣品中收集顆粒成分，來確定樣品中物質(zhì)的身份或存在。通常，樣品的流體成分是液體。然而，流體也可以是空氣或氣體。比如，測(cè)定生物性液體，如尿中癌癥細(xì)胞或某些蛋白的存在可能是理想的。在另一個(gè)例子中，對(duì)于評(píng)估電力工業(yè)中使用的超純水中的污染物，如分子污染物的性質(zhì)可能是理想的。其它示范性液體包括但不限于體液，如血液、脊髓液、或羊水；支氣管灌洗液；痰；細(xì)針抽吸液；地下水；工業(yè)處理液；和電子或醫(yī)藥透析液，僅列出一些。本發(fā)明應(yīng)不受要處理的液體類型限制。
如本文所用，顆粒物質(zhì)指任何液體中的物質(zhì)，該物質(zhì)能被收集并優(yōu)選用細(xì)胞學(xué)，血液學(xué)或微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)作評(píng)估。示范性顆粒物質(zhì)包括但不限于細(xì)胞或細(xì)胞碎片、細(xì)菌、血液成分、蛋白質(zhì)、分子、聚合物、橡膠、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、促進(jìn)劑、聚硅酮、醇酸、硫醇、煤油、熱塑塑料、細(xì)菌、殺蟲劑和除草劑。特別的示范性聚合物包括但不限于聚乙烯、聚丙烯、聚異丁烯、聚丙烯腈、聚乙二醇、聚乙烯氯、聚硬脂酸、多硫化物、聚甲基丙烯酸甲酯、聚對(duì)苯二酸乙烯酯、乙基纖維素、硝基纖維素、聚氨基甲酸乙酯，和尼龍。一種特別的示范性的環(huán)境污染物是雙酚A。特別的示范性生物物質(zhì)包括癌癥細(xì)胞、包括轉(zhuǎn)移性和正常癌癥細(xì)胞之間的鑒別；蛋白質(zhì)，核酸，抗體等。本發(fā)明應(yīng)不限于要處理的物質(zhì)類型。
當(dāng)將細(xì)胞學(xué)收集儀器和/或本發(fā)明的固定劑組合物用于生物性液體時(shí)，對(duì)于從尿和其相關(guān)細(xì)胞中制備測(cè)試樣品，用于帕帕尼科拉烏涂片，是特別有用的。在細(xì)胞學(xué)中最廣泛使用的目測(cè)細(xì)胞變化的染色是帕帕尼科拉烏染色程序。用于婦科和非婦科應(yīng)用的該染色法基本是由藍(lán)色胞核和橙色、紅色和綠色胞漿復(fù)染法構(gòu)成的。胞核染色顯示與正?；虍惓＜?xì)胞相關(guān)的染色體圖案，而胞漿染色有助于指明細(xì)胞起源。該程序的成功可歸功于可觀察許多因子，包括核的細(xì)節(jié)和細(xì)胞分化的能力。該染色程序還產(chǎn)生了多種顏色的制備物，看來很美觀，可能降低眼睛的緊張。本發(fā)明應(yīng)不受要處理物質(zhì)類型限制。在本發(fā)明的最優(yōu)選例中，液體是尿液，而顆粒物質(zhì)是細(xì)胞。
本發(fā)明的組合物和方法還允許從生物液中分離并收集新鮮細(xì)胞和/或微生物，一旦細(xì)胞以適當(dāng)緩沖液溶血后，可進(jìn)行DNA探測(cè)和染色體分析。
如本文所用的，適合于通訊、交通的術(shù)語(yǔ)，或相似的術(shù)語(yǔ)指用于建立流過該系統(tǒng)的流體的任何工具、結(jié)構(gòu)、或方法，是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。本文所引用專利的附圖
中顯示了示范性的結(jié)構(gòu)。例如，一根管道可具有一個(gè)接頭，適于接受或連接在另一條管道上的配對(duì)接頭。本文所用的接頭指任何用來形成接合點(diǎn)或其自身與另一零件接合的結(jié)構(gòu)。這些接頭或接合處建立了通過該儀器、裝置或系統(tǒng)的各種元件的液體流動(dòng)。典型的接頭包括但不限于配對(duì)接頭，如Luer型、螺絲型、摩擦型或互相結(jié)合的接頭。
本文所用的“適合于接合”，“接合”，“連接”，或相似的術(shù)語(yǔ)可指排成行、相嚙合、配對(duì)或互相靠近、垂直，或在彼此內(nèi)的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)。示范性結(jié)構(gòu)包括上述接頭。
本發(fā)明還包括從流體中取出顆粒物質(zhì)，并將顆粒物質(zhì)，如細(xì)胞或細(xì)菌或血液樣品轉(zhuǎn)移到顯微鏡載玻片上的方法。與現(xiàn)有方法相反，使用膜過濾提供了將細(xì)胞均勻放置在顯微鏡載玻片上，只有最少重疊的方法。這能使觀察清楚，和最佳的診斷準(zhǔn)確性。
然后用多孔介質(zhì)迫壓顯微鏡載玻片，使在收集部位上的收集的顆粒物質(zhì)如它們被收集時(shí)一樣，轉(zhuǎn)移到載玻片上。這使技術(shù)人員能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查，而不因加工需要，受到膜上孔的干擾或延遲。
由于細(xì)胞細(xì)節(jié)取決于固定方法，優(yōu)選細(xì)胞在被放置在載玻片上后，立刻固定。在制備和固定之間耽誤太久會(huì)使細(xì)胞暴露干燥，從而損害細(xì)胞結(jié)構(gòu)。另外，人為的空氣干燥對(duì)隨后的染色效果有不良作用。例外的是當(dāng)細(xì)胞用Wright-Giensa染色時(shí)，采用空氣干燥作為固定步驟。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，可將細(xì)胞單層直接固定在收集點(diǎn)上。這可先將細(xì)胞單層放置在上述細(xì)胞學(xué)收集儀器的收集點(diǎn)上，然后使含有固定劑，如酒精或丙酮的溶液通過該細(xì)胞學(xué)收集儀器。
應(yīng)要注意可采用能與本發(fā)明實(shí)施例互換的各種類型的多孔陣列。雖然聚碳酸酯膜特別適用于本發(fā)明的細(xì)胞收集儀器，其它多孔膜也是合適的。示范性多孔膜是本領(lǐng)域熟知的，在美國(guó)專利5,471,994和5,301,685中已公開，兩者都在此引入以供參考。
本發(fā)明范圍內(nèi)還包括從一病人樣品產(chǎn)生一張載玻片，從一個(gè)病人樣品產(chǎn)生多張載玻片，或從多個(gè)病人樣品產(chǎn)生多張載玻片。病人的樣品將以單幅、成批、或連續(xù)方式加工。可容易的制備其它染色用途的額外載玻片?？稍陬~外的載玻片上通過較新的方法，如免疫細(xì)胞化學(xué)或原位雜交進(jìn)行人乳頭瘤病毒測(cè)試。隨著癌基因產(chǎn)物或其它免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)試的發(fā)展，需要更多的載玻片。由于這種制備不需要僅以一種方式固定載玻片，可將這些測(cè)試所需要的不同固定方法引入該程序。
在細(xì)胞學(xué)中目測(cè)細(xì)胞變化使用最廣泛的染色方法是帕帕尼科拉烏染色程序。用于婦科和非婦科應(yīng)用的該染色法基本是由藍(lán)色胞核和橙色、紅色和綠色胞漿復(fù)染法構(gòu)成的。胞核染色顯示與正?；虍惓＜?xì)胞相關(guān)的染色體圖案，而胞漿染色有助于指明細(xì)胞起源。該程序的成功可歸功于可觀察許多因子，包括核的細(xì)節(jié)和細(xì)胞分化的能力。該染色程序還產(chǎn)生了多種顏色的制備物，看來很美觀，可能降低眼睛的緊張。
本發(fā)明的組合物和方法特別適合制備顆粒物質(zhì)，如細(xì)胞學(xué)、血液學(xué)和微生物學(xué)標(biāo)本，以及用于保存組織學(xué)標(biāo)本。
實(shí)施例實(shí)施例1.固定劑配制產(chǎn)生了下列固定劑組合物40％酒精(甲醇和異丙醇)；2.2％丙酮；1.8％聚乙二醇(PEG)；0.7％甲醛；1％甘油；0.02％Nonider P40；和54％Tris緩沖液(pH7.4-7.8)。所有成分的量是體積的大約百分?jǐn)?shù)。
上述固定劑溶液與各種細(xì)胞學(xué)標(biāo)本制備技術(shù)或裝置聯(lián)用，包括在美國(guó)專利5,471,994；美國(guó)專利5,301,685；1997年8月4日提交的美國(guó)系列號(hào)(USSN)08/905,833,1997年11月4日提交的USSN 08/963,873,1998年3月13日提交的USSN 09/042,005,1998年4月1日提交的USSN 09/053,010；PCT/US98/16349；USSN 09/050,010；PCT/US98/17524；USSN 09/185,606和PCT/US98/23222中公開的那些。實(shí)施例1的固定劑溶液顯示了用最小量的制品能迅速滲透組織；這樣固定的組織染色顯示了優(yōu)異的組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)細(xì)節(jié)。
實(shí)施例2.細(xì)胞學(xué)制備1．用本發(fā)明的固定劑組合物半充滿標(biāo)本收集容器。將含有細(xì)胞的標(biāo)本放入具有固定劑組合物的容器。
2．強(qiáng)力混合細(xì)胞學(xué)標(biāo)本和固定劑組合物，使標(biāo)本和固定劑充分混合。
3．如果該細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的細(xì)胞不分散，該標(biāo)本可能是均勻的。用每分鐘約2,000到4,000轉(zhuǎn)(RPM)，優(yōu)選約3,000RPM轉(zhuǎn)動(dòng)的機(jī)械葉片進(jìn)行均化。MonoGenTMMonoprep G底部的葉片執(zhí)行該功能?；蛘?，可用高速攪拌器攪拌5到10秒，或更短。如果在標(biāo)本中可見斑點(diǎn)和細(xì)線，將其返還到攪拌器中，再攪拌10到15秒鐘。避免過度攪拌。
4．在進(jìn)一步加工前，應(yīng)將細(xì)胞固定至少15分鐘。進(jìn)一步加工包括本領(lǐng)域制備細(xì)胞單層和細(xì)胞染色的熟知方法。可用各種細(xì)胞學(xué)制備裝置，如實(shí)施例1中的那些。
實(shí)施例3細(xì)胞學(xué)保存和溶粘蛋白溶液產(chǎn)生了下列固定劑和溶粘蛋白組合物40％酒精(甲醇和異丙醇)；2.2％丙酮；1.8％聚乙二醇(PEG)；0.7％甲醛；1％甘油；0.02％Nonidet P40；和54％Tris緩沖液(pH7.4-7.8)。所有成分的量是體積的大約百分?jǐn)?shù)。加入0.2-0.5克％范圍的DTT。該溶液稱為MonoLexTM。將該MonoLexTM溶液以1∶1比例加到標(biāo)本中。將標(biāo)本和溶粘蛋白固定劑溶液旋轉(zhuǎn)將近1分鐘，然后培育約30分鐘，再次旋轉(zhuǎn)約1分鐘。進(jìn)一步加工包括本領(lǐng)域制備顆粒單層和細(xì)胞染色熟知的方法?？墒褂酶鞣N細(xì)胞學(xué)制備裝置，如實(shí)施例1中列出的那些。
實(shí)施例4由于細(xì)胞細(xì)節(jié)取決于固定方法，細(xì)胞優(yōu)選在放置在載玻片上后，立刻固定。在制備和固定之間耽誤太久會(huì)使細(xì)胞暴露干燥，從而損害細(xì)胞結(jié)構(gòu)。另外，人為的空氣干燥會(huì)對(duì)隨后的染色效果有不良作用。例外的是當(dāng)細(xì)胞是用Wright-Giensa染色時(shí)，采用空氣干燥作為固定步驟。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，可將細(xì)胞單層直接固定在收集點(diǎn)上。這可先將細(xì)胞單層放置在上述細(xì)胞學(xué)收集儀器的收集點(diǎn)上，然后使含有固定劑，如酒精或丙酮的溶液通過該細(xì)胞學(xué)收集儀器。
本發(fā)明范圍內(nèi)還包括從病人樣品產(chǎn)生多張載玻片?？扇菀椎闹苽淦渌旧猛镜念~外載玻片。可在額外的載玻片上通過較新的方法，如免疫細(xì)胞化學(xué)或原位雜交進(jìn)行人乳頭瘤病毒測(cè)試。隨著癌基因產(chǎn)物或其它免疫細(xì)胞化學(xué)測(cè)試的發(fā)展，需要更多的載玻片。由于本發(fā)明不需要僅以一種方式固定載玻片，可將這些測(cè)試所需要的不同固定方法引入程序。
可將相同的載玻片制備程序用于幾乎所有的細(xì)胞學(xué)形式。另外，全部含有一次性組分的使用提醒對(duì)生物危害應(yīng)予以關(guān)注。最后，細(xì)胞提供質(zhì)量的提高，細(xì)胞學(xué)解釋的改進(jìn)，可能通過提供更一致和可靠的病人診斷而擴(kuò)大了細(xì)胞學(xué)的作用。
在本發(fā)明的描述中，參考了本發(fā)明的優(yōu)選例和優(yōu)點(diǎn)說明。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員和對(duì)本發(fā)明的直接公開內(nèi)容熟悉的人員，可認(rèn)識(shí)到在不脫離本發(fā)明權(quán)利要求所限定的范圍，可作出許多其它改變、變化和變通。
權(quán)利要求
1．一種細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)固定劑組合物，其特征在于，該組合物包含醛交聯(lián)劑、多元醇和去污劑。
2．如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述醛是C1-C6鏈烷基或C1-C8亞烷基二醛。
3．如權(quán)利要求2所述的組合物，其特征在于，所述醛選自戊二醛、甲醛、多聚甲醛、乙醛、丙醛和丁醛。
4．如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述多元醇選自乙二醇、丙二醇、甘油、山梨醇和甘露醇。
5．如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述去污劑是非離子去污劑。
6．如權(quán)利要求5所述的組合物，其特征在于，所述非離子去污劑是選自Triton X-100、Nonidet P40、Igepal Ca-630、Tween85、Tween80或Tween65。
7．如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，該組合物還包含一種緩沖液。
8．如權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，所述緩沖液將該溶液pH維持在約4到約7之間。
9．如權(quán)利要求7所述的組合物，其特征在于，所述緩沖液選自Tris或磷酸緩沖鹽水。
10．如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，該組合物還包含一種核蛋白沉淀劑或一種溶血?jiǎng)?br> 11．如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，該組合物還包含一種同滲容摩維持劑。
12．如權(quán)利要求10所述的組合物，其特征在于，所述核蛋白沉淀劑或溶血?jiǎng)┦且宜帷?br> 13．如權(quán)利要求11所述的組合物，其特征在于，所述同滲容摩維持劑是選自葡萄糖和氯化鈉。
14．如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，該組合物還包含一種溶劑，選自乙醇，異丙醇，甲醇和水。
15．如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，該組合物還包含一種酮，所述酮是丙酮或甲基乙基酮。
16．如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，該組合物還包含一種細(xì)胞包裹物質(zhì)，選自聚乙二醇和Carbowax。
17．如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，該組合物還包含一種溶粘蛋白劑。
18．如權(quán)利要求17所述的組合物，其特征在于，所述溶粘蛋白劑是二硫蘇糖醇或乙?；腚装彼?。
19．如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，該組合物包含濃度約0.2到4.0％的醛，濃度約0.5到2.0％的甘油，和濃度約0.01到0.05％的去污劑。
20．如權(quán)利要求19所述的組合物，其特征在于，該組合物還包含濃度約35％到約45％的乙醇，濃度約2.0％到3.0％的丙酮，濃度約1.0％到3.0％的聚乙二醇，和一種緩沖液。
21．一種保存細(xì)胞學(xué)、血液學(xué)、微生物學(xué)或組織學(xué)標(biāo)本的方法，其特征在于，該方法包括用有效量的權(quán)利要求1-20任一項(xiàng)所述的組合物固定所述標(biāo)本。
全文摘要
本發(fā)明是關(guān)于一種固定劑組合物,該固定劑組合物在制備細(xì)胞學(xué)或組織學(xué)標(biāo)本中的用途,和制備顆粒狀物體,如細(xì)胞學(xué)、血液學(xué)和微生物學(xué)標(biāo)本的方法,通過將顆粒狀物體收集在均一的層,優(yōu)選單層中,并將顆粒狀物體固定于本發(fā)明的組合物中,來檢查這些標(biāo)本。本發(fā)明的細(xì)胞學(xué)、血液學(xué)、微生物學(xué)和組織學(xué)固定劑組合物含有醛交聯(lián)劑,多元醇和去污劑。本發(fā)明保存顆粒狀或組織學(xué)標(biāo)本的方法使用含有醛交聯(lián)劑,多元醇和去污劑的固定劑組合物。
文檔編號(hào)G01N21/93GK1310797SQ99808948
公開日2001年8月29日 申請(qǐng)日期1999年6月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年6月30日
發(fā)明者R·A·吉吉斯, M·埃－阿明 申請(qǐng)人:萊密納股份有限公司