專利名稱：活體內(nèi)造影細(xì)胞死亡的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及活體內(nèi)造影(imaging)細(xì)胞死亡的方法，具體涉及使用γ射線造影，用經(jīng)放射性標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白造影哺乳動(dòng)物細(xì)胞死亡區(qū)域。
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背景技術(shù)：
細(xì)胞凋亡或編程性細(xì)胞死亡在發(fā)育和多種穩(wěn)態(tài)和疾病過程中起著重要作用(Thompson，1995)，因此，調(diào)制細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡不失為各種疾病的新的治療策略。檢測(cè)和監(jiān)控活體內(nèi)細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡的非侵害性方法的缺乏，障礙了對(duì)促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡的新藥劑的研究。
脂質(zhì)質(zhì)子核磁共振波譜學(xué)(1H-NMRS)可用于檢測(cè)遭受細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡的淋巴母細(xì)胞和其他細(xì)胞系之質(zhì)膜組成和/或流動(dòng)性的特異性變化(Blankenberg等，1996)。目前，很多組織和器官中天然存在的復(fù)雜的磁性微環(huán)境限制了脂質(zhì)1H-NMRS研究細(xì)胞凋亡的臨床應(yīng)用。
發(fā)明簡(jiǎn)述一方面，本發(fā)明包括活體內(nèi)造影哺乳動(dòng)物受試者區(qū)域性細(xì)胞死亡(如內(nèi)細(xì)胞凋亡或壞死所致的細(xì)胞死亡)的方法。該方法包括步驟(a)給受試者施用經(jīng)生物相容的放射性核素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白。(b)過一段時(shí)間后，當(dāng)標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白于受試者中定位之后，將此受試者置于放射檢測(cè)裝置的檢測(cè)區(qū)，以及(c)用放射檢測(cè)裝置測(cè)量定位于受試者的放射性核素散發(fā)的放射性放射以構(gòu)建出放射性放射影像，此影像即代表此哺乳動(dòng)物受試者特定區(qū)域的細(xì)胞死亡。在其中一實(shí)施方案中，此方法還包括步驟(d)處理此影像，減去標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白的非特異性定位的信號(hào)，例如腎臟中非特異性定位的信號(hào)。
可用于本發(fā)明的放射性核素包括碘123，碘131，鎵67，銦111，氟18，與锝99m。氟18發(fā)射陽電子，故可利用于陽電子放射局部X射線檢法(positron emission tomography；PET)。I 123，I 131，Ga67，In 111，與Tc 99m可利用于標(biāo)準(zhǔn)γ射線散發(fā)檢測(cè)。Tc 99m于本發(fā)明的方法中是優(yōu)選的放射性核素。在一優(yōu)選實(shí)施方案中，Tc 99m由hydrazino nicotinamide(HYNIC)連結(jié)于膜聯(lián)蛋白。Tc 99m標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白的標(biāo)準(zhǔn)給藥劑量是界于5到20mCi。
本發(fā)明的一般實(shí)施方案中，放射檢測(cè)裝置是γ射線檢測(cè)裝置，測(cè)量的放射性放射是γ射線放射。在另一一般實(shí)施方案中，放射檢測(cè)裝置是陽電子放射檢測(cè)裝置，測(cè)量的放射性放射是陽電子放射。
本發(fā)明又一一般實(shí)施方案中，當(dāng)重復(fù)步驟(b)與(c)能有效追蹤一區(qū)域中放射性放射如γ射線或陽離子放射強(qiáng)度隨時(shí)間的改變時(shí)，(放射性放射強(qiáng)度的改變反映出細(xì)胞死亡數(shù)目的改變)，此方法還包括以選定的時(shí)間間隔重復(fù)步驟(b)與(c)。
本發(fā)明又另一一般實(shí)施方案中，當(dāng)重復(fù)步驟(b)與(c)能有效追蹤一區(qū)域中γ射線放射的定位隨時(shí)間的改變時(shí)，(放射性放射強(qiáng)度的改變反映出細(xì)胞死亡位置的改變)，此方法還包括以選定的時(shí)間間隔重復(fù)步驟(b)與(c)。
此放射檢測(cè)裝置可以是例如安格γ閃爍照相機(jī)(Anger gammascintillation camera)或是立體造影照相機(jī)。
本發(fā)明優(yōu)選的膜聯(lián)蛋白是膜聯(lián)蛋白V。標(biāo)準(zhǔn)給藥劑量是小于約300μg蛋白質(zhì)/kg，優(yōu)選的是界于約1到10μg蛋白質(zhì)/kg。許多可行的給藥途徑包括靜脈內(nèi)的(i.v.)腹膜內(nèi)的(i.p.)椎管內(nèi)的，以及胸膜內(nèi)的給藥。
為構(gòu)建影像而進(jìn)行的γ射線放射的測(cè)量典型地是于施予標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白后5分鐘至約2小時(shí)測(cè)量。在其中一實(shí)施方案中，為構(gòu)建影像而進(jìn)行的γ射線放射的測(cè)量典型地是于施于標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白后約1小時(shí)測(cè)量。
利用本文公開的方法可造影受試者的不同部位。例如，此區(qū)域基本上可包括整個(gè)受試者或此受試者之一部分，如頭部或頭的一部分，心臟或心臟的一部分，肝臟或肝臟的一部分等。
本發(fā)明還提供了活體內(nèi)造影細(xì)胞死亡的試劑盒。此試劑盒包括(i)一密封小瓶，其中含有HYNIC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白，可以按例如〔材料與方法(A)〕中所述來制備；(ii)一密封小瓶，其中含有Sn-tricine溶液，可以按例如〔材料與方法(B)〕中所述來制備，并保存于N2環(huán)境下；(iii)利用(i)與(ii)的成分以及Tc-99m制備Tc-99m標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白的說明書；以及(iv)給藥Tc-99m標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白以活體內(nèi)造影細(xì)胞死亡區(qū)的說明書。在一實(shí)施方案中，此試劑盒保存在-70℃下并且在干冰中運(yùn)輸。在另一實(shí)施方案中，HYNIC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白經(jīng)凍干。
為讓本發(fā)明的上述和其他目的、特征、和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文結(jié)合附圖作詳細(xì)說明如下圖的簡(jiǎn)單說明

圖1是一電腦形成影像，顯示以Tc 99m HYNIC膜聯(lián)蛋白V檢測(cè)Fas-介導(dǎo)的暴發(fā)性肝臟細(xì)胞凋亡。圖2是一電腦形成影像，顯示發(fā)生Fas-介導(dǎo)的暴發(fā)性肝臟細(xì)胞凋亡，來自Tc 99m HYNIC-卵白蛋白的信號(hào)。
本發(fā)明的詳細(xì)說明1.定義“細(xì)胞死亡”此一術(shù)語出現(xiàn)在“檢測(cè)細(xì)胞死亡”或“定位細(xì)胞死亡”時(shí)，意指失去質(zhì)膜完整性的細(xì)胞以及哺乳動(dòng)物細(xì)胞死亡的過程。此過程包括細(xì)胞凋亡(apoptosis)以及涉及細(xì)胞凋亡(例如細(xì)胞衰老)與壞死的過程。在此，“細(xì)胞死亡”特指有核細(xì)胞(例如神經(jīng)元，肌細(xì)胞，肝細(xì)胞等等)的死亡或逼近的死亡以及無核細(xì)胞(例如紅血細(xì)胞，血小板等等)的死亡或逼近的死亡。
“生物相容的放射性核素〕或“生物相容的放射性同位素”是指被認(rèn)可為適用于注射核藥物給病人的同位素。生物相容的放射性核素的例子包括I123，I 131，Ga 67，In 111，F(xiàn) 18，與Tc 99m。II.細(xì)胞死亡-細(xì)胞凋亡與壞死細(xì)胞凋亡(apoptosis)意指“編程性細(xì)胞死亡”細(xì)胞藉以執(zhí)行“細(xì)胞自殺”程序。一般認(rèn)為，對(duì)多細(xì)胞生物以及一些特定生物的所有細(xì)胞而言，細(xì)胞凋亡程序在進(jìn)化上是保守的。更甚者，據(jù)信在許多例子中，在健康的存活細(xì)胞中，細(xì)胞凋亡是一個(gè)必須被主動(dòng)抑制的“不執(zhí)行”程序。
多種規(guī)律性的刺激以及環(huán)境因子會(huì)影響細(xì)胞決定是否進(jìn)行細(xì)胞凋亡(Thompson，1995)。細(xì)胞凋亡的生理活化劑包括腫瘤壞死因子(TNF)，F(xiàn)as配體，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β，神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸，多巴胺，N-甲基-D-天冬氨酸，生長(zhǎng)因子的釋出，喪失基質(zhì)附著，鈣與糖皮質(zhì)素。細(xì)胞凋亡的傷害性相關(guān)誘導(dǎo)因子包括熱激，病毒感染，細(xì)菌毒素，致癌基因myc，rel以及EIA，腫瘤抑制基因p53，溶細(xì)胞的T-細(xì)胞，氧化劑，自由基以及營(yíng)養(yǎng)缺乏(抗代謝物)。療法相關(guān)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子包括γ射線照射，UV射線照射與種種化療藥物有順鉑，阿霉素，博來霉素，阿糖胞苷，氮芥，甲氨喋呤與長(zhǎng)春新堿。毒素相關(guān)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子包括乙醇與β-淀粉樣肽。當(dāng)細(xì)胞凋亡病理性地發(fā)生于無法正常再生的細(xì)胞，例如神經(jīng)元時(shí)常造成嚴(yán)重的后果。由于當(dāng)這些細(xì)胞死亡時(shí)，沒有細(xì)胞可取代之，喪失這些，細(xì)胞導(dǎo)致被感染器官的功能衰退甚至是致命性的功能失常。與細(xì)胞凋亡增加相關(guān)的大量神經(jīng)變性失調(diào)疾病中可見這種功能失常，所述疾病包括老年癡呆癥，帕金森氏癥，肌萎縮性側(cè)索硬化，色素性視網(wǎng)膜炎和小腦退化。
不必要的細(xì)胞凋亡的后果對(duì)其他的病癥同樣具有嚴(yán)重的破壞，包括局部缺血傷害，例如心肌梗塞，再灌注傷害和中風(fēng)。一般認(rèn)為細(xì)胞凋亡于中度的焦點(diǎn)式局部缺血后，對(duì)延遲血梗起重要作用。(Du，等，1996)。其他與細(xì)胞凋亡增加相關(guān)的疾病包括但不限于AIDS；脊髓發(fā)育不良綜合癥，如再生障礙性貧血；以及毒素誘導(dǎo)的肝病，包括酗酒過多造成的傷害。
壞死(necrosis)是指除了細(xì)胞凋亡外(即除了執(zhí)行細(xì)胞內(nèi)在的自殺程序外)造成的局部性細(xì)胞或組織死亡。壞死的成因有外傷，細(xì)菌感染，急性缺氧等等。此二類細(xì)胞死亡有重疊處，因?yàn)橛行┐碳?huì)造成細(xì)胞凋亡或壞死或兩者，這取決于傷害的嚴(yán)重程度。III.生物膜的不對(duì)稱性一般認(rèn)為，相對(duì)于特定的膜磷脂，生物膜為不對(duì)稱的。特別是真核質(zhì)膜的外膜主要由膽堿磷脂，如鞘磷脂和磷脂酰膽堿(PC)，組成；而內(nèi)膜主要包括氨基磷脂，如磷脂酰絲氨酸(PS)和磷脂酰乙醇胺(PE)。一般而言，不對(duì)稱性是藉由依賴于ATP的氨基磷脂轉(zhuǎn)位酶的活性來維持，所述酶選擇性地傳運(yùn)PS與PE于雙膜之間(Seigneuret and Devaux，1984)。其他關(guān)于傳運(yùn)磷脂于雙膜之間的酶包括依賴于ATP的floppase(Connor，等，1992)與lipid scramblase(Zwell，等，1993)。
正常細(xì)胞具有不對(duì)稱性，喪失此不對(duì)稱性會(huì)與特定的生理與致病程序相關(guān)。舉例而言，當(dāng)于質(zhì)膜外膜檢測(cè)到PS的出現(xiàn)時(shí)(PS暴露)，是細(xì)胞凋亡，先前性的DNA破裂，質(zhì)膜起水泡以及喪失膜完整性的早期征兆之一。(Martin，等，1995；Fadok，等，1992)。
相似的重定位于鐮刀形細(xì)胞疾病(Lane，等，1994)，β-地中海型貧血(Borenstain-Ben Yashar，等，1993)，血小板活化，以及具有PS傳運(yùn)缺陷的突變腫瘤細(xì)胞中皆可發(fā)現(xiàn)。逐漸老化的紅血細(xì)胞外膜中會(huì)發(fā)現(xiàn)PS逐漸出現(xiàn)(Tait and Gibson，1994)。當(dāng)這些細(xì)胞上的PS暴露到一極限值，這些細(xì)胞會(huì)被巨噬細(xì)胞從循環(huán)中清除(Pak andFidler，1991)。上述這些情形大致顯示感染細(xì)胞(即顯著暴露的細(xì)胞)的PS死亡達(dá)到最高點(diǎn)。
不錯(cuò)的是PS暴露是細(xì)胞凋亡與壞死的共同征兆。它在細(xì)胞凋亡初期的作用已如上述。一旦凋亡的細(xì)胞達(dá)到凋亡的最終期時(shí)(也就是喪失膜的完整性)，在兩層質(zhì)膜上的PS皆會(huì)暴露出細(xì)胞外環(huán)境。相同的情形發(fā)生在壞死所致的細(xì)胞死亡，其中喪失膜完整性是壞死性細(xì)胞死亡過程的起始因素或早期現(xiàn)象，因此，因?yàn)殡p層細(xì)胞膜皆暴露出所以壞死細(xì)胞皆具有暴露的PS。IV.膜聯(lián)蛋白膜聯(lián)蛋白族的蛋白質(zhì)可應(yīng)用于實(shí)施本發(fā)明。在許多的細(xì)胞中，包括胎盤，淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞，膽與腎的管狀上皮細(xì)胞，的胞質(zhì)中可發(fā)現(xiàn)高含量的膜聯(lián)蛋白V。雖然膜聯(lián)蛋白的生理學(xué)功能至今尚未完全清楚，但是因?yàn)槟ぢ?lián)蛋白的幾個(gè)特性，膜聯(lián)蛋白已成為有用的診斷和/或治療藥劑。特別地，膜聯(lián)蛋白對(duì)陰離子磷脂表面，如有磷脂酰絲氨酸(PS)暴露表面的膜層，有特別強(qiáng)的親和力。V.實(shí)驗(yàn)結(jié)果概況實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明放射性標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白可被利用于活體內(nèi)造影細(xì)胞死亡。舉例而言，實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)顯示當(dāng)注射純化的Jo2抗體于小鼠時(shí)，F(xiàn)as-介導(dǎo)的肝臟細(xì)胞死亡的造影與定量(Ogasawara，等，1993)。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(例見圖1)顯示分別在第一與第二小時(shí)時(shí)，肝細(xì)胞對(duì)放射性標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白有增加兩倍與四倍的肝攝取量，具體原因是注射Jo2抗體之后由Fas-介導(dǎo)的肝臟細(xì)胞死亡。在脾細(xì)胞中經(jīng)注射后的早期，短暫地增加了兩倍的脾攝取量，接著又降至對(duì)照值。來自脾的信號(hào)下降可能是因?yàn)檠h(huán)與脾淋巴細(xì)胞對(duì)注射在由Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡突然出現(xiàn)作出回應(yīng)的快速清除作用。
腎臟中亦可發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白結(jié)合。然而，膜聯(lián)蛋白結(jié)合是在無任何細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)刺激存在下才有的，并且在肝細(xì)胞信號(hào)增強(qiáng)時(shí)，此結(jié)合減少。在供給抗Fas抗體后，腎臟活性急速下降的同時(shí)肝攝取量增加，這暗示非細(xì)胞凋亡相關(guān)對(duì)膜聯(lián)蛋白V的腎親和力遠(yuǎn)低于細(xì)胞凋亡的組織。腎皮質(zhì)對(duì)注射的膜聯(lián)蛋白V的結(jié)合可能部分因?yàn)槟ぢ?lián)蛋白與腎小管磷脂的交叉反應(yīng)性。
值得一提的是，腎分泌物含有極少量的標(biāo)記膜聯(lián)蛋白，顯示在實(shí)驗(yàn)期間，放射性標(biāo)記(在此為Tc 99m)保持與膜聯(lián)蛋白結(jié)合。再者，注射的經(jīng)Tc 99m標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白在血流中很快地被清除，血清半壽期約為3到7分鐘。這些因素使得可以在給藥后1到2小時(shí)造影放射性藥物信號(hào)。
以上的性質(zhì)使得連續(xù)每日或每雙日的造影研究得以進(jìn)行，每日或每雙日的造影研究代表當(dāng)注射放射性標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V時(shí)所需器官或組織的快速照相細(xì)胞凋亡活性。VI.活體內(nèi)細(xì)胞死亡造影本發(fā)明之一方面包括-哺乳動(dòng)物受試者區(qū)域活體內(nèi)造影細(xì)胞死亡(由例如細(xì)胞凋亡或壞死所致的)的方法。本方法中先給藥放射性標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白(如Tc 99m-標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V)于受試者。經(jīng)過一段時(shí)間使得共軛物到達(dá)受試者中定位后，將受試者置于γ射線檢測(cè)裝置的檢測(cè)區(qū)內(nèi)。當(dāng)利用γ射線檢測(cè)裝置測(cè)量由Tc 99m放射的γ射線時(shí)，受試者大致上是固定化狀態(tài)。接著，γ射線放射的影像就構(gòu)建出來了。此構(gòu)建出的γ射線放射影像用來給臨床醫(yī)師提供一圖譜，或哺乳動(dòng)物受試者或哺乳動(dòng)物受試者待分析區(qū)域的細(xì)胞死亡定位區(qū)。
為了清楚地解釋由上述方法所得的影像，此影像又經(jīng)過數(shù)字處理以濾去背景信號(hào)，雜信和/或膜聯(lián)蛋白/Tc 99m共軛物非特異性的定位，如腎定位。
上述方法的優(yōu)點(diǎn)是，藉由測(cè)量γ射線放射以及在特定時(shí)間區(qū)間形成影像，本方法可用于追蹤一段時(shí)間內(nèi)受試者的γ射線放射強(qiáng)度變化，反映出進(jìn)行細(xì)胞死亡過程的細(xì)胞數(shù)目的改變。本方法亦可用于追蹤一段時(shí)間內(nèi)受試者的γ射線放射定位的變化，反映出進(jìn)行細(xì)胞死亡過程的細(xì)胞分布的變化。A.放射性標(biāo)記膜聯(lián)蛋白的合成本發(fā)明可利用天然純化的，重組的，或者是合成的膜聯(lián)蛋白。膜聯(lián)蛋白V，舉例而言，可以是如傳統(tǒng)地由人類胎盤純化得到(Funakoshi，等，1987)。重組膜聯(lián)蛋白具有許多優(yōu)點(diǎn)包括容易制備，低成本。許多不同種的膜聯(lián)蛋白可由人體或其他生物體克隆而來。其序列可由序列數(shù)據(jù)庫如GenBank獲得。
本發(fā)明優(yōu)選地是使用膜聯(lián)蛋白V，有許多原因。第一，膜聯(lián)蛋白V是最豐足易得的膜聯(lián)蛋白之一。再者，易于從自然的或重組的來源獲得。第三，它對(duì)磷脂膜有高親和性(Tait，等，1988)。人類膜聯(lián)蛋白V的分子量為36kd并且對(duì)PS有高親和性(kd＝7n mol/L)。人類膜聯(lián)蛋白V的序列可由GenBank獲得，編號(hào)為U05760-U05770。
在〔材料與方法〕中提及一示范性的適用于本發(fā)明的表達(dá)系統(tǒng)。其利用在E. coli中的pET12a表達(dá)載體。(Novagen，Madison，Wisconsin)。
也可以利用其他細(xì)菌的表達(dá)載體。包括pGEX質(zhì)粒(Smith，等，1988)及其衍生物，例如Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ的pGEX系列。這些載體表達(dá)框內(nèi)融合于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的克隆插入片段的多肽序列?？赊D(zhuǎn)化重組pGEX質(zhì)粒于適當(dāng)?shù)腅.coli菌株，可通過加入異丙基-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)融合蛋白質(zhì)的生產(chǎn)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，利用谷胱甘肽瓊脂糖親和層析(glutathione agarose affinitychromatography)可將溶解的重組融合蛋白質(zhì)由誘導(dǎo)培養(yǎng)物的細(xì)胞裂解物中純化出來(Ausubel，等)。其他可商購(gòu)的表達(dá)系統(tǒng)包括酵母表達(dá)系統(tǒng)，如Invitrogen(San Diego，CA)的pichia表達(dá)試劑盒；桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Reilly，等；Beames，等；Ciontech，Palo Alto CA)與哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)(Clontech，Palo Alto CA；Gibco-BRL，Gaithersburg MD)。
許多特征，如促進(jìn)表達(dá)序列分泌入培養(yǎng)基的前導(dǎo)序列，可被建入表達(dá)載體。重組生成的多肽傳統(tǒng)上是由裂解細(xì)胞或培養(yǎng)基分離出來。
分離出的重組多肽可由標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化方法來純化。包括示差沉淀法，分子篩層析，離子交換層析，等電聚焦，凝膠電泳，與親和層析。蛋白質(zhì)制品也可以由過濾法來濃縮(Amicon，Danvers，Mass)。
依照上述方法制成的膜聯(lián)蛋白再被特定的放射性核素標(biāo)記。特定同位素的選擇是依據(jù)特殊應(yīng)用而定。
任何目前可得的放射性核素皆可應(yīng)用于本發(fā)明。選擇適當(dāng)放射性核素時(shí)一般應(yīng)考慮發(fā)明的特定應(yīng)用以及核造影普遍需考慮的幾個(gè)因素，所述因素包括(i)顆粒放射的最小值(ii)介于50到500kEv的初級(jí)光子能(iii)物理半壽期要大于準(zhǔn)備給藥物質(zhì)所需時(shí)間(iv)大于檢驗(yàn)時(shí)間的有效半壽期適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)形式與反應(yīng)性，低毒性，以及經(jīng)放射性核素標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白的穩(wěn)定性。
例舉的放射性核素是Tc 99m，Tc 99m的半壽期約6小時(shí)，對(duì)標(biāo)記膜聯(lián)蛋白有很高的特異活性。其滿足上述大部分條件，且超過80％的核醫(yī)學(xué)造影方法都用到Tc 99m。其他可供利用的同位素包括I 123(半壽期約13.2小時(shí))，I 131(半壽期約8天)，Ga 67(半壽期約78小時(shí))，In 111(半壽期約2.8天)。
許多已知方法公開了結(jié)合同位素與膜聯(lián)蛋白的方法。例如如下文材料和方法一節(jié)中所述可通過使用AnorMED，Langley，BritishColumbia，Canada的hydrazino nicotinamide(HYNIC)結(jié)合Tc 99m與膜聯(lián)蛋白。利用Hnatowich，等，1983(列入本文作為參考)所述的方法可以使Ga 67，In 111與放射性標(biāo)記的蛋白質(zhì)結(jié)合。
還有其他以核標(biāo)記蛋白質(zhì)的方法。例如，1996年9月3日核準(zhǔn)的美國(guó)專利案號(hào)5,552,525(Dean)，教導(dǎo)-制造Tc 99m標(biāo)記的肽的方法。美國(guó)專利案號(hào)5,443,815和5,508,020中公開了用Tc-99m標(biāo)記肽和多肽的方法。1990年Lind等教導(dǎo)Tc 99m標(biāo)記的單克隆抗體。LaMuraglia，等，(1989)教導(dǎo)111I標(biāo)記的非特異性人類免疫球蛋白。Fischman，等，(1991)教導(dǎo)趨化甲?；?fMLF)111In標(biāo)記的DTPA其軛物。B.放射性標(biāo)記膜聯(lián)蛋白的給藥放射性標(biāo)記膜聯(lián)蛋白可以利用放射性標(biāo)記化合物的標(biāo)準(zhǔn)給藥方案來給藥。供給的劑量取決于兩個(gè)主要考慮(i)注射放射性核素的量與形式以及(ii)注射膜聯(lián)蛋白蛋白質(zhì)的量。
Tc 99m給藥于一成年人的劑量可高至20mCi。單次Tc 99m給藥的優(yōu)選的劑量約介于5到20mCi。
在劑量大于300μg/kg時(shí)，膜聯(lián)蛋白V開始有藥物效應(yīng)(抗促凝劑效應(yīng))。因此，本發(fā)明的診斷方法(該方法旨在避免標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白的藥物效應(yīng))優(yōu)選是在低于300μg/kg，特別是低于50μg/kg的劑量下進(jìn)行。這樣的放射示蹤劑劑量(10μg/kg到50μg/kg)對(duì)動(dòng)物或人體并無報(bào)導(dǎo)出的藥物或毒性副作用。
放射性標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白一般在適合的傳輸載體中，例如是無菌生理鹽水中，作成懸浮液。載體包括本領(lǐng)域公知的穩(wěn)定劑，傳輸劑(carrier)，賦形劑，穩(wěn)定劑，乳化劑等。
任何有效給藥放射性標(biāo)記蛋白質(zhì)以用于核醫(yī)學(xué)造影的途徑皆可用于給藥放射性標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白。優(yōu)選的給藥方法是靜脈內(nèi)(i.v.)注射。對(duì)于內(nèi)部廣布血管的器官的造影更是適合，如心、肝、脾等等。靜脈內(nèi)注射放射性藥物的方法是已知的。例如，使用Oldendorf/Tourniquet方法或靜脈內(nèi)推入法(Mettler與Guierbteau，1985，附錄D)，以注射造影劑團(tuán)的方式施用經(jīng)放射性標(biāo)記的藥物。
當(dāng)進(jìn)行腦的顯影時(shí)，標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白可利用鞘內(nèi)給藥。鞘內(nèi)給藥直接傳輸藥物至含有大腦脊柱液(CSF)的次蛛網(wǎng)膜空間。欲傳輸至脊髓區(qū)必須通過硬膜外注射至蛛網(wǎng)膜外部的脊髓區(qū)來實(shí)現(xiàn)。
其他給藥方法包括腹膜內(nèi)(對(duì)腎透析患者)與胸膜內(nèi)給藥。在特殊情況下，本發(fā)明還包括其它傳輸方式，包括肌肉內(nèi)注射，皮下的，淋巴內(nèi)的，噴注以及口服，陰道內(nèi)的和/或直腸給藥。
前述給藥方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。C.放射性標(biāo)記膜聯(lián)蛋白的定位在施用標(biāo)記膜聯(lián)蛋白之后，接下來就是使放射性標(biāo)記膜聯(lián)蛋白定位于一靶組織或器官?！岸ㄎ弧痹诖酥甘茉囌唧w內(nèi)結(jié)合的，“駐定的”與非結(jié)合，“游離的”，標(biāo)記膜聯(lián)蛋白之間達(dá)到一平衡或假穩(wěn)定狀態(tài)的關(guān)系。達(dá)到定位所需的時(shí)間從數(shù)分鐘到數(shù)十分鐘。達(dá)到定位的時(shí)間可藉由標(biāo)記膜聯(lián)蛋白血清半壽期估計(jì)。當(dāng)靜脈內(nèi)注射經(jīng)Tc 99m標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白時(shí)，血清半壽期為約3至7分鐘。定位時(shí)間也取決于靶組織允許經(jīng)標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白接近的能力，這反過來又取決于給藥方式，這一點(diǎn)是本領(lǐng)域所公知的。
優(yōu)選在大多數(shù)經(jīng)標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白已定位于其靶之后開始造影對(duì)于Tc 99m標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V經(jīng)靜脈內(nèi)注射而言，定位在數(shù)個(gè)半壽期后產(chǎn)生。十倍半壽期(對(duì)膜聯(lián)蛋白/Tc 99m共軛物而言，約30到70分鐘)的時(shí)間足以達(dá)到基本上完全的定位。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)希望在大于或小于此約10倍半壽期的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行造影。例如，在造影因血管受傷造成的細(xì)胞死亡時(shí)，靶組織非常易于接近，因此在短短幾分鐘內(nèi)，就可獲得自靶位點(diǎn)來的強(qiáng)烈信號(hào)，特別是當(dāng)?shù)蛣┝康臉?biāo)記膜聯(lián)蛋白被漸漸給藥以減少來自循環(huán)標(biāo)記來的信號(hào)時(shí)更是如此。
在上述的例子中，本領(lǐng)域技術(shù)人員皆可對(duì)達(dá)到定位的時(shí)間做到合理的估計(jì)。另外，作為時(shí)間的函數(shù)的定位狀態(tài)確定之后，即可根據(jù)本發(fā)明的方法造影得自經(jīng)標(biāo)記膜聯(lián)蛋白的γ射線信號(hào)。D.γ射線檢測(cè)裝置γ射線造影裝置是藉在一段時(shí)間內(nèi)收集自受試者放射的γ射線信號(hào)以發(fā)揮作用。最普遍使用的γ射線檢測(cè)方法之一是Anger γ閃爍照相機(jī)(Mettler與Guibertau，1985)，它將放射性核素放射的γ射線轉(zhuǎn)變?yōu)楣庾?通常配合Nal(T1)晶體)，再于光電倍增管(PMTs)中放大，轉(zhuǎn)變成為電壓信號(hào)再藉以構(gòu)建一影像。Anger γ閃爍照相機(jī)的組件典型地包括準(zhǔn)直管，閃爍晶體，一列PMTs，脈沖高度分析儀，陰極射線管(CRT)與控制臺(tái)。此照相系統(tǒng)通常包括電腦。PMTs與顯示(CRT)之間的處理可以是類比的或數(shù)字的。許多評(píng)論和/或核醫(yī)學(xué)教科書(例如Mettler與Guiberteau，1985)有對(duì)Anger γ閃爍照相機(jī)的理論與操作方法的詳細(xì)敘述。
利用放射估計(jì)局部X光檢法(ETC)以產(chǎn)生三維立體圖提供一更資訊豐富的影像。ETC有兩種，一是單光子放射估計(jì)局部X光檢法(SPECT)其利用如Tc-99m的同位素，再者是陽電子放射局部X光檢法(PET)其利用高能量(SII-Kev)消滅光子以提供高度準(zhǔn)確的定位。PET的缺點(diǎn)是其一般與短生命的用回旋加速器產(chǎn)生的同位素，如11C，13N與18F一起使用。另外，SPECT適用于本文描述的放射性藥物類型如Tc-99m。
SPECT系統(tǒng)一般包括一個(gè)或兩個(gè)電腦控制Anger γ閃爍照相機(jī)頭，此機(jī)頭以圓形或橢圓形軌道繞患者轉(zhuǎn)動(dòng)。此種SPECT照相機(jī)可自，例如是Siemens(Des Plains，IL)，供應(yīng)商獲得。Siemens發(fā)售多種此類照相機(jī)，包括E-CAM，ORBITER，ECAT，MULTISPECT 3，MULTISPECT 2以及DIACAM。
上述的照相機(jī)一般包括一體化的影像處理器，其處理影像為數(shù)字文檔以減除背景與加上假色彩等。一旦影像以數(shù)字文檔的形式存在時(shí)，可在個(gè)人電腦如IBM兼容PC或Apple Macintosh(Apple Computer，Cupertino)上利用多種造影處理程序，例如ADOBE PHOTOSHOP，Adobe System，Mt.View，CA，處理并打印出結(jié)果。E.放置受試者于γ射線檢測(cè)裝置的檢測(cè)區(qū)中1.裝置的檢測(cè)區(qū) 裝置的檢測(cè)區(qū)的定義是可獲得恒定可靠的γ射線放射測(cè)量結(jié)果的區(qū)域。假如利用ETC以收聚影像時(shí)，此裝置的檢測(cè)區(qū)是γ射線放射可靠地被測(cè)量的全部空間或ETC系統(tǒng)按計(jì)劃包括在掃描中的部分空間。此空間一般基本上大于-單個(gè)-非ETC照相機(jī)的檢測(cè)區(qū)。
一般可知，并不需要將整個(gè)動(dòng)物或受試者置于γ射線檢測(cè)裝置的檢測(cè)區(qū)。例如，假如我們有興趣分析得自特定器官的信號(hào)，只需要測(cè)量得自包括此器官的區(qū)域以及周圍黑暗區(qū)來的信號(hào)即可得到所需信息。
2.放置受試者；固定化在測(cè)量γ射線以構(gòu)建影像的時(shí)間內(nèi)，將受試者置于光檢測(cè)裝置的檢測(cè)區(qū)中以收集用以集匯出影像的信號(hào)。假如信號(hào)夠強(qiáng)使影像可于20毫秒內(nèi)藉測(cè)量γ射線放射構(gòu)建出，和/或受試者相對(duì)于造影平面的移動(dòng)不足以破壞影像，就不需要額外的固定化步驟。而是只需要在測(cè)量期間將受試者置于檢測(cè)裝置的檢測(cè)區(qū)。
假如，測(cè)量γ射線放射需時(shí)大于20毫秒，而受試者被激烈搖動(dòng)時(shí)，確保γ射線放射測(cè)量期間與受試者之激烈搖動(dòng)程度相稱的受試者固定化的措施都應(yīng)被考慮以保留構(gòu)建的影像的空間信息。例如，假如受試者是人，光子放射測(cè)量時(shí)間是數(shù)秒鐘，在γ射線放射測(cè)量(造影)時(shí)，受試者最好是盡量維持靜止。另外，假如受試者是動(dòng)物，例如小鼠，可藉由麻醉或機(jī)械控制裝置固定之。
機(jī)械控制裝置有很多種，例如，利用一端有凹槽的海綿墊，將小鼠頭置于凹槽外使之自由呼吸，而小鼠身體的移動(dòng)受海綿墊限制，再將-γ射線可穿透的薄片覆蓋綁緊于上。如此制作的控制裝置可固定小鼠數(shù)十秒至數(shù)分鐘。
欲造影區(qū)域可基本上包括整個(gè)受試者或受試者需診斷或監(jiān)測(cè)細(xì)胞死亡的一部分，例如，此區(qū)域可以是一附件或是該附件的部分，頭，中樞神經(jīng)系統(tǒng)或一內(nèi)體腔，如胸腔或腹腔。在一些特殊的實(shí)施方案中，此區(qū)域可僅包括特定的器官或器官的一部分。例如，本方法僅可利用于分析中樞神經(jīng)系統(tǒng)，腦，心，肝，脾，肺，骨髓或上述之一部分中的細(xì)胞死亡。再者，被分析區(qū)域可被限制于腫瘤如接受造成腫瘤細(xì)胞死亡治療的癌癥患者。F.構(gòu)建γ射線放射影像造影處理許多適用的照相機(jī)可將γ射線放射的測(cè)量值匯集為電壓信號(hào)，其可顯示在CRT或以電腦儲(chǔ)存和/或分析為一數(shù)字列。以標(biāo)準(zhǔn)造影方法，可利用這些數(shù)字匯集出影像。舉例而言，一般通過標(biāo)準(zhǔn)化γ射線計(jì)數(shù)(對(duì)一固定，先前選擇的數(shù)值或?qū)σ匀魏螆D素偵測(cè)出的最大值)并轉(zhuǎn)換這些標(biāo)準(zhǔn)化數(shù)值為顯示器上的亮度(灰度)或色彩(假色)來分析影像。假色表現(xiàn)時(shí)，典型色彩的分配如下。計(jì)數(shù)為零的圖素為黑色，低計(jì)數(shù)為藍(lán)色，計(jì)數(shù)愈高色彩的波長(zhǎng)愈長(zhǎng)，最高的γ射線計(jì)數(shù)值是紅色。顯示器上色彩的位置表示γ射線放射的分布也就是細(xì)胞死亡的區(qū)域的位置。
假如想要追蹤一段時(shí)間內(nèi)的定位和/或信號(hào)，例如，要記錄一種治療方法對(duì)細(xì)胞死亡的分布和/或定位的影向，可以在一定時(shí)間間隔中重復(fù)γ射線放射測(cè)定或造影，以構(gòu)建一系列的影像。時(shí)間間隔可短至幾分鐘或長(zhǎng)至數(shù)天，數(shù)周，數(shù)月或數(shù)年。
許多方法都可用以分析藉本發(fā)明的方法匯集的影像，包括最簡(jiǎn)單的視覺檢視，心理評(píng)估和/或印出清樣，或復(fù)雜的數(shù)字影像分析。VII.應(yīng)用放射性標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V的主要應(yīng)用包括檢測(cè)不該發(fā)生的疾病中不適當(dāng)?shù)募?xì)胞凋亡，例如紅斑狼瘡，移植排斥等免疫失常，或嚴(yán)重的細(xì)胞局部缺血，以及檢測(cè)該發(fā)生而沒有發(fā)生足夠的細(xì)胞凋亡，如腫瘤或病毒感染的細(xì)胞。
本文所述結(jié)果顯示放射性標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白可應(yīng)用于臨床上需要檢測(cè)細(xì)胞凋亡或壞死性細(xì)胞死亡時(shí)，例如，但不限于，器官和骨髓移植排斥或受傷，感染性及非感染性炎性疾病，自身免疫病，大腦的及心肌梗塞以及局部貧血，心肌癥，動(dòng)脈粥樣硬化，神經(jīng)與肌神經(jīng)老化疾病，新月形細(xì)胞疾病，β-地中海型貧血，癌癥療法，AIDS，脊髓發(fā)育不良綜合征，與毒素誘導(dǎo)肝病等等。另外，也可利用放射性標(biāo)記膜聯(lián)蛋白作為研究正常免疫系統(tǒng)，胚胎發(fā)育，免疫耐受與變態(tài)反應(yīng)的臨床工具。
放射性標(biāo)記膜聯(lián)蛋白V也可利用在，例如，造影或定量接受治療的正常以及惡性組織的細(xì)胞凋亡性細(xì)胞死亡。藉由放射性標(biāo)記膜聯(lián)蛋白V與連續(xù)造影研究以監(jiān)控細(xì)胞凋亡可應(yīng)用于新藥與各種疾病療法的快速檢驗(yàn)與發(fā)展。此外，此方法又可用于監(jiān)控治療過程，監(jiān)控疾病進(jìn)程或兩者兼?zhèn)?。再者，這些方法又可有助于特定疾病的早期監(jiān)控。
以下的實(shí)施例是為了說明本發(fā)明，但非限制本發(fā)明。
材料與方法A.HYNIC標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V的制備依據(jù)前述方法在E.coli中由pET12a-PAPI質(zhì)粒表達(dá)產(chǎn)生人膜聯(lián)蛋白V，并純化之(Wood，等，1996)。制備30mM的hydrazinonicotinamide(HYNIC；得自AnorMED，Langley，British Columbia，Canada；Babich，等，1993)N-羥基琥珀酰亞胺酯的儲(chǔ)備溶液(HYNICester stock solution)，制備方法為將220μg的succinimidyl 6-hydrazinonicotinate hydrochloride(SHNH)懸浮于18.5μL的N，N-dimethyl formamide。溶解于893μL緩沖液A(20mM HEPES，pH7.4，100mM NaCl)的5mg膜聯(lián)蛋白V先與NYCIN酯儲(chǔ)備溶液于室溫下反應(yīng)3小時(shí)，反應(yīng)時(shí)溫和地?cái)噭?dòng)，遮光。(Schwartz，等，1991)。加入500L的500mM pH5.3的甘氨酸以停止反應(yīng)。然后在4℃下對(duì)20mM的檸檬酸鈉pH5.2，100mM NaCl透析。再以1500xg，10分鐘離心以移除沉淀，將100μL(100μg)的HYNIC膜聯(lián)蛋白V等分試樣儲(chǔ)存于-70℃。B.放射性標(biāo)記HYNIC膜聯(lián)蛋白V將80μL的SnCl2(50mg/ml 0.1N HCl，以氮?dú)鈨艋瘍尚r(shí))加入50ml的20mM tricine溶液中pH7.1，以氮?dú)鈨艋?小時(shí)；tricine＝N-〔tris(羥甲基)甲基〕甘氨酸)。按Larson等1995所述方法，將200μL的Sn-tricine溶液加入與100μL膜聯(lián)蛋白V等分試樣(按上述制備)混合的100μl Tc 99m(4-8mCi活性)中。
以saline為溶劑，用即時(shí)薄層層析法(Instant thin layerchromatography；ITLC)來測(cè)定放射性標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白的比活是20-200μCi/μg蛋白質(zhì)(取決于所需活性)，放射性純度為92-97％，HYNIC膜聯(lián)蛋白V的膜結(jié)合活性與衰減的Tc 99m HYNIC膜聯(lián)蛋白V是以修飾的競(jìng)爭(zhēng)分析法測(cè)定，其中5nM的FITC-膜聯(lián)蛋白V被I125膜聯(lián)蛋白V置換(Wood，等，1996)。室溫下15分鐘后，離心此樣品，結(jié)合于沉淀細(xì)胞的FITC-膜聯(lián)蛋白V藉由EDTA釋出而釋出的FITC-膜聯(lián)蛋白V藉由螢光測(cè)定法測(cè)量。在此分析系統(tǒng)中，未修飾的膜聯(lián)蛋白，HYNIC膜聯(lián)蛋白，與Tc 99m HYNIC膜聯(lián)蛋白V分別有8nM，10.5nM與12.3nM的競(jìng)爭(zhēng)抑制(FITC-膜聯(lián)蛋白V結(jié)合的50％濃度)。每摩爾膜聯(lián)蛋白V有0.9摩爾的HYNIC參入膜聯(lián)蛋白V。C.造影與生物分布研究在利用ITLC鹽水為溶劑，測(cè)定游離對(duì)結(jié)合Tc 99m后，給小鼠注射50-150μCi的Tc 99m-HYNIC膜聯(lián)蛋白(0.125-0.25μg的蛋白質(zhì))。在注射放射性藥物之后，小鼠先置于俯臥姿勢(shì)，造影1至2小時(shí)。利用低能可動(dòng)(LEM)閃爍照相機(jī)與高敏感度平行孔準(zhǔn)直管與128×128造影陣列(Siemens，Des Plains，IL)15分鐘后可得影像。同樣的方法可用于所有掃描的先前處理以及后處理。
在得到來自子宮頸瘤，唾腺，大腦，胸腺，心，肺，肝，脾，胃，GI神經(jīng)束，腎，骨骼肌，脂肪，血液，以及遺骸的樣品之后，就可進(jìn)行生物分布的研究。樣品先置于Packard Cobra II自動(dòng)γ閃爍計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)(Packard Instrument，Downer Grove，IL)表示為每分鐘同位素衰變與背景活性的校正計(jì)數(shù)。D.結(jié)合的人體膜聯(lián)蛋白V與細(xì)胞凋亡的細(xì)胞核的免疫染色經(jīng)福爾馬林固定，石蠟包埋的組織先切成5μm大小，再以蘇木精/伊紅或其他技術(shù)染色。結(jié)合人類膜聯(lián)蛋白V的免疫染色可藉由人體胎盤膜聯(lián)蛋白V誘生的兔抗血清進(jìn)行，所述抗血清親和純化自與Affi-Gel(Bio-Rad)偶聯(lián)的重組膜聯(lián)蛋白V。接著，依次與生物素標(biāo)記的山羊抗兔抗體和親和素-辣根過氧化物酶復(fù)合物保溫(JacksonImmuno Reserch)，以及與3，3’-二氨基聯(lián)苯胺反應(yīng)(Bindl，J.M.&Warnke，R.A.，1986)之后，可完成免疫組織化學(xué)檢測(cè)。
欲檢測(cè)細(xì)胞凋亡細(xì)胞核時(shí)，可用Gavrieli等公開的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶-介導(dǎo)的UPT末端標(biāo)記(TUNEL)法的修正方法來染色切片。在抑制內(nèi)源性過氧化物酶之后，再用蛋白酶K(20μg/ml)于室溫下消化石蠟切片15分鐘。這些切片又接著與5單位/ml的λ外切核酸酶(LifeTechnologies，Gaithersburg)于37℃保溫30分鐘，再以末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)緩沖液(0.2M potassium cacodylate，25mM Tris-HCl，0.25mg/ml BSA，1.5mM CaCl2，20mg/ml聚乙烯吡咯烷酮，與20mg/mlFicoll)與5μM dAPT使達(dá)到平衡。此末端標(biāo)記反應(yīng)也是在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶緩沖液也包括最終濃度為75單位/ml的末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶與100μM的1，N-6-ethenol-ATP(Sigma)。37℃保溫60分鐘之后，以1×SSC(標(biāo)準(zhǔn)的檸檬酸鹽水)潤(rùn)濕終止反應(yīng)。這些切片再與鼠1G4mAb(ReginaSantella贈(zèng)，Columbia University)保溫，所述mAb能識(shí)別ethenoadenin組成成分(Young，T.L.&Santella，R.M.，1988)，隨后的免疫組織化學(xué)檢測(cè)如前述，利用的是生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體。
實(shí)施例1活體內(nèi)造影Fas-介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡小鼠的肝細(xì)胞凋亡是藉注射抗Fas抗體誘導(dǎo)出的，其在1至2小時(shí)內(nèi)造成大規(guī)模的肝細(xì)胞凋亡，在90％的受處理小鼠中在3小時(shí)之時(shí)會(huì)造成死亡(Ogasawara)。
5至6周齡的18-24克雌性Balb/c小鼠接受靜脈內(nèi)注射，注射以純化的倉(cāng)鼠單克隆抗-Fas抗體(Jo2，10μg每只動(dòng)物，Pharmingen，San，Diego，CA)。接著，在3個(gè)分別的實(shí)驗(yàn)中，此動(dòng)物于0，1，2小時(shí)，再靜脈內(nèi)接受以約90μCi的Tc 99m HYNIC放射性標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V。結(jié)果如圖1所示。
表1放射性標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V與HAS的生物分布分
攝取量瞬時(shí)升至對(duì)照值的140％，在2小時(shí)時(shí)，降至110％。在處理之后1和2小時(shí)，腎攝取量降至40％。
另一組小鼠(對(duì)照組)在Jo2抗體處理之后0，1，2小時(shí)，即注射以90μCi Tc 99m HYNIC卵白蛋白(MW＝43kd；2μg蛋白質(zhì))。如圖2所示，這些動(dòng)物在抗Fas抗體處理后第一小時(shí)時(shí)，肝攝取量增加為127％，第二小時(shí)時(shí)，仍幾乎維持不變(131％)。脾攝取放射性標(biāo)記的卵白蛋白量在處理之后保持不變。腎攝取放射性標(biāo)志的卵白蛋白量在處理后1小時(shí)時(shí)升至對(duì)照值的138％，并在2小時(shí)時(shí)，維持在對(duì)照值的131％。
第三組小鼠除接受上述的處理外，并且于三個(gè)分別的實(shí)驗(yàn)中，在第0，1，2小時(shí)，注射Tc 99m標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V與I125標(biāo)記的人血清白蛋白(HSA)。不同實(shí)驗(yàn)的動(dòng)物在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)之后被殺死以作生物分布研究。結(jié)果如上表1所示，以注射劑量/g組織的百分比(％ID/gm)表示。此數(shù)據(jù)與由放射性標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白V與HAS的ROI造影分析所得的數(shù)據(jù)成比例。
實(shí)施例2心臟同種異體移植排斥的活體內(nèi)造影基本上按前述方法制備99mTc HYNIC-膜聯(lián)蛋白V。除特別說明之外造影與生物分布研究亦如前述進(jìn)行，依據(jù)Ono與Lindsey(Woodley，等，1993)修飾過的方法，將自PVG供體(得自Harlen-Sprague-Dawley)異位心臟同種異體移植至成年雄性ACI大鼠(250-350g)腹大動(dòng)脈與下靜脈。將ACI供體的同系心臟移植物移植至宿主ACI大鼠的腹部。在上述模型的ACI受體體內(nèi)的PVG心臟同種異體移植物在移植之后4到5天開始有排斥反應(yīng)，其是以心跳脈博的降低來評(píng)估的。移植之后五天，所有動(dòng)物經(jīng)由尾部靜脈血管接受700-900μCi的99mTcHYNIC-膜聯(lián)蛋白V(10-20μg蛋白質(zhì)/kg)并且在1小時(shí)后顯影。再殺死這些動(dòng)物，原有的自身心臟與移植的心臟再進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)與組織病理研究。
移植后5天，使用哦99mTc HYNIC-膜聯(lián)蛋白V可以使所有PVG同種異體移植心臟(n＝4)輕易地造影。ACI同系心臟移植物(n＝3)在注射99mTc HYNIC-膜聯(lián)蛋白之后沒有可見的活性，而經(jīng)閃爍孔計(jì)數(shù)證實(shí)，放射性藥物的攝入等同于原來的心臟活性。PVG同種異體移植物的整體活性百分比超過ACI同系移植物活性百分比的213％(p＜0.005；two-tailed斯式t檢驗(yàn))，這是由ROI造影分析測(cè)定的。閃爍孔計(jì)數(shù)分析揭示出PVG同種異體移植物相對(duì)于原有心臟活性有超過11倍的99mTc HYNIC-膜聯(lián)蛋白V攝取量。
所有的動(dòng)物中，PVG心臟同種異體移植物的切片在移植5天之后有顯著的單核炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)。同系或原來的心臟并未發(fā)現(xiàn)這種侵入。浸潤(rùn)圍繞心肌受傷區(qū)域，并與心肌血管血栓形成相關(guān)。這些區(qū)域的中心，不須蘇木精染色就有明顯的細(xì)胞壞死。但在周邊，以TUNEL染色可確定有細(xì)胞凋亡變化的細(xì)胞核。在心肌發(fā)炎細(xì)胞與細(xì)胞壞死區(qū)的交界處可觀察顆粒狀模式的99mTc HYNIC-膜聯(lián)蛋白V免疫染色。這些細(xì)胞的細(xì)胞核仍被蘇木精染色，更進(jìn)一步說明了他們是細(xì)胞凋亡而不是壞死。以陽性肌細(xì)胞數(shù)目而言，抗膜聯(lián)蛋白V染色比起TUNEL更廣效，對(duì)比度也更強(qiáng)。如一般預(yù)測(cè)，抗膜聯(lián)蛋白染色在壞死區(qū)很濃且結(jié)塊但這種染色是特異性的。同系或原來的心臟并未觀察到染色，在省略了第一抗體的同種異體心臟移植物中也未觀察到染色。
在另一組不同但相似的實(shí)驗(yàn)中，ACI大鼠(每組n＝6)接受自PVG供體的異位心臟同種異體移植物。自ACI供體(每組n＝3)的同系心臟移植物被移植于宿主ACI大鼠。沒有任何一組接受移植排斥處理。
移植之后第1，2，3，4，5，6，7天，對(duì)受體大鼠進(jìn)行核掃描。核掃描前1小時(shí)，先注射1.0mCi99mTc HYNIC-膜聯(lián)蛋白V。
移植后4天，以99mTc HYNIC-膜聯(lián)蛋白V可輕易地使PVG心臟同種異體移植物顯現(xiàn)。在注射99mTc HYNIC-膜聯(lián)蛋白V之后，ACI同系心臟移植物沒有可見的活性。
99mTc HYNIC-膜聯(lián)蛋白V攝取量可用ROI分析來定量。移植心臟的攝取以整體攝取的百分比來計(jì)算。結(jié)果如圖3。
核掃描之后即刻就使這些動(dòng)物安樂死。取出移植的心臟以作分析。對(duì)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)蘇木精和伊紅染色的切片進(jìn)行急性排斥的組織分級(jí)，分級(jí)方案示于下表2。
表2急性排斥的組織分級(jí)
<p>使用商購(gòu)的過氧化物酶試劑盒(APOPTAG，Oncor，Gaithersburg，MD)，通過核DNA裂解的TUNEL染色在組織切片上鑒定細(xì)胞凋亡的細(xì)胞核。如表3的數(shù)據(jù)所示，在心臟同種異體排斥的過程中，在肌細(xì)胞與炎性細(xì)胞皆發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡。
表3心臟同種異體移植的TUNEL染色；在排斥過程中陽性細(xì)胞核的顯現(xiàn)
如表4的數(shù)據(jù)與圖4所顯示，99mTc HYNIC-膜聯(lián)蛋白V的攝取量與急性排斥組織等級(jí)相關(guān)。
表4在心臟同種異體移植排斥過程中99mTc HYNIC-膜聯(lián)蛋白V的攝取百分比
*斯氏t檢驗(yàn)，雙尾的偏差不相等。
實(shí)施例3活體造影處理過的鼠淋巴瘤99mTc HYNIC-膜聯(lián)蛋白V大致如上述方法制備。除非特別說明造影與生物分布研究，亦如上述方法進(jìn)行。
于C3H.HeN小鼠(Harlan Breeders，Indianapolis)中，培養(yǎng)38C13鼠B細(xì)胞淋巴瘤(Maloney，等，1985)，再將懸浮于200μl RPMI培養(yǎng)基1640(不含血清)的400個(gè)腫瘤細(xì)胞皮下注射于小鼠左肋。移植之后14天，小鼠又接受100mg/kg環(huán)磷酰胺腹膜內(nèi)注射。環(huán)磷酰胺腹膜內(nèi)注射后20小時(shí)，小鼠又接受25-50μg/kg的99mTc HYNIC-膜聯(lián)蛋白V(100-150μCi/動(dòng)物)的靜脈內(nèi)注射。在注射放射性藥物后1小時(shí)，造影與殺死該動(dòng)物，再移除腫瘤作閃爍計(jì)數(shù)與組織病理研究。
未處理的肋腫瘤移植物(n＝8)可輕易藉由閃爍照相造影而得見，并且以ROI顯影分析可知其有超過正常軟組織活性365％的膜聯(lián)蛋白V攝取量。處理過的肋腫瘤(n＝6)的99mTc HYNIC-膜聯(lián)蛋白V活性相對(duì)對(duì)照值有高于78％的增加量，所述值以每克腫瘤的總體活性表示。(p＜0.05，two-tailed student’s test)。閃爍孔計(jì)數(shù)又確認(rèn)了此結(jié)果，其中經(jīng)處理的腫瘤的膜聯(lián)蛋白V攝取量增加了132％(p＜0.05)，所述攝取量以每克腫瘤注射劑量的百分比表示，并且與對(duì)照組比較重量降低了58％(p＜0.05)。以ROI造影分析得到的每克腫瘤總體活性與以生物分布研究(r2＝0.831)測(cè)定的每克腫瘤注射劑量百分比線性相關(guān)。
組織分析證明經(jīng)處理的腫瘤的全部成淋巴細(xì)胞完全(大于95％)細(xì)胞凋亡，而對(duì)照組只有低于5％的細(xì)胞凋亡。
雖然參照特定方法和實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但在不背離本發(fā)明精神的情況下也可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行多種修飾和改革。
權(quán)利要求
1.活體內(nèi)造影哺乳動(dòng)物受試者區(qū)域性細(xì)胞死亡的方法，所述方法(a)給藥于該受試者標(biāo)記有生物相容性放射性核素的膜聯(lián)蛋白；(b)經(jīng)過一段時(shí)間后，當(dāng)該標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白于該受試者中定位之后，將該受試者置于一放射檢測(cè)裝置的檢測(cè)區(qū)；以及(c)用該放射檢測(cè)裝置測(cè)量定位于該受試者的放射性核素的放射性放射(radiation emission)以構(gòu)建出放射影像，其中該影像代表該所述哺乳動(dòng)物受試者的所述區(qū)域的細(xì)胞死亡。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中該方法進(jìn)一步包括步驟(d)處理該影像以減去該受試者的膜聯(lián)蛋白的非特異性定位所致的信號(hào)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中所述非特異性定位在腎臟中。
4.如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的方法，其中該放射性核素選自I 123，I 131，Ga 67，In 111，F(xiàn) 18，以及Tc 99m。
5.如權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的方法，其中該放射性核素為Tc99m。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中Tc99m藉由hydrazinonicotinamide(HYNIC)連結(jié)于該膜聯(lián)蛋白。
7.如權(quán)利要求5或6所述的方法，其中該Tc99m標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白的給藥劑量界于約5到20mCi。
8.如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述放射檢測(cè)裝置是γ射線檢測(cè)裝置而所述放射性放射是γ射線放射。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中所述γ射線檢測(cè)裝置是γ閃爍照相機(jī)。
10.如權(quán)利要求8或9所述的方法，其中施用該標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白后約5分鐘至約2小時(shí)后測(cè)量該γ射線放射以構(gòu)建該影像。
11.如權(quán)利要求8至10中任一項(xiàng)所述的方法，其中施用該標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白后約1小時(shí)后測(cè)量該γ射線放射以構(gòu)建該影像。
12.如權(quán)利要求1至11中任一項(xiàng)所述的方法，其中該細(xì)胞死亡是細(xì)胞凋亡所致。
13.如權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括在以選定時(shí)間間隔重復(fù)步驟(b)與(c)，其中重復(fù)步驟(b)與(c)能有效追蹤在一段時(shí)間內(nèi)，該區(qū)域放射性放射強(qiáng)度的改變，反映出遭受細(xì)胞死亡的細(xì)胞數(shù)目的改變。
14.如權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括在選定時(shí)間間隔重復(fù)步驟(b)與(c)。其中重復(fù)步驟(b)與(c)能有效追蹤在一段時(shí)間內(nèi)，在該區(qū)域放射性放射定位的改變，反映出遭受細(xì)胞死亡的細(xì)胞位置的改變。
15.如權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)所述的方法，其中該放射檢測(cè)裝置是立體造影照相機(jī)。
16.如權(quán)利要求1至15中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述膜聯(lián)蛋白是膜聯(lián)蛋白V。
17.如權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的方法，其中該標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白的給藥劑量是小于約300μg蛋白質(zhì)/kg。
18.如權(quán)利要求1至17中任一項(xiàng)所述的方法，其中該標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白的給藥劑量是界于約1到10μg蛋白質(zhì)/kg。
19.如權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中該標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白經(jīng)由靜脈內(nèi)給藥。
20.如權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中該標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白經(jīng)由腹膜內(nèi)給藥。
21.如權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中該標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白經(jīng)由椎管內(nèi)給藥。
22.如權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中該標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白經(jīng)由胸膜內(nèi)給藥。
23.如權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中該標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白經(jīng)由淋巴內(nèi)給藥。
24.如權(quán)利要求1至18中任一項(xiàng)所述的方法，其中該標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白經(jīng)由肌肉內(nèi)給藥。
25.如權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述區(qū)域基本上包括整個(gè)受試者。
26.如權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述區(qū)域包括頭部或頭部的一部分。
27.如權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述區(qū)域包括心臟或心臟的一部分。
28.如權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述區(qū)域包括肝臟或肝臟的一部分。
全文摘要
一種利用放射性標(biāo)記的膜聯(lián)蛋白以活體內(nèi)造影細(xì)胞死亡的方法。
文檔編號(hào)G01T1/164GK1265572SQ98804718
公開日2000年9月6日 申請(qǐng)日期1998年4月28日 優(yōu)先權(quán)日1997年4月30日
發(fā)明者F·G·布蘭肯伯格, H·W·斯特勞斯, J·F·泰特, P·D·卡特斯基斯 申請(qǐng)人:萊蘭斯坦福初級(jí)大學(xué)評(píng)議會(huì), 華盛頓州大學(xué)