專利名稱：條件復(fù)制型病毒載體及其用法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及條件復(fù)制型病毒載體，涉及這樣一種載體的制備、修飾、繁殖和選擇性包裝的方法，涉及與這類載體相關(guān)的特定核苷酸序列和氨基酸序列的分離分子，涉及包含這樣一種載體的藥物組合物和宿主細(xì)胞以及使用這樣一種載體和宿主細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
發(fā)現(xiàn)人免疫缺陷病毒(HIV)為獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)的原因已經(jīng)促進(jìn)眾多的研究進(jìn)入病毒感染周期和病毒致病的根本機(jī)制。對這些機(jī)制的研究已經(jīng)為研究人員提供越來越多的靶，以研制不僅有效對HIV有效、而且也對其它病毒有效的抗病毒劑。根據(jù)這些抗病毒劑，特別是針對HIV的抗病毒劑的作用模式，可以將其分為幾類。這些類別包括逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、病毒進(jìn)入細(xì)胞的競爭劑、疫苗和蛋白酶抑制劑以及本文稱為“遺傳抗病毒劑”的最新一類。
一般來說，每種類型的抗病毒劑有其相關(guān)的益處和限制，必須根特定治療狀況的迫切需要進(jìn)行評價。諸如疊氮胸苷(3’-疊氮基-3’-脫氧胸苷，也被稱為AZT)、蛋白酶抑制劑等抗病毒劑可以相對容易地傳遞到病人身體的細(xì)胞中，對這些抗病毒劑已經(jīng)進(jìn)行了廣泛地研究。這些抗病毒劑以病毒感染周期中的某種特異性因子為目標(biāo)，已證明對HIV相對無效。這主要是因為HIV毒株變化迅速，變?yōu)閷哂袉蝹€作用位點的藥劑產(chǎn)生抗性(Richman，AIDS Res.and Hum.Retrovir.，8，1065-1071(1992))。因此，在HIV基因組中的遺傳變異和快速突變的問題迫使考慮治療HIV感染的新抗病毒策略。根據(jù)這些方法，由于遺傳抗病毒劑在細(xì)胞內(nèi)作用于多個不同水平，因此有吸引力。
遺傳抗病毒劑不同于其它治療劑，因為它們作為分子元件轉(zhuǎn)移到靶細(xì)胞內(nèi)，其中它們保護(hù)細(xì)胞免受病毒感染(Baltimore，Nature，325，395-396(1988)；和Dropulic等，Hum.Gene Ther.，5，927-939(1994))。遺傳抗病毒劑可以是任何遺傳序列，包括(但不限于)反義分子、RNA引捕器、反式顯性突變、干擾素、毒素、免疫原和核酶。特別是，核酶是以序列特異性方式切割靶RNA(包括HIV RNA)的遺傳抗病毒劑。核酶介導(dǎo)的靶RNA切割的特異性啟示可能使用核酶作為病毒復(fù)制(包括HIV復(fù)制)的治療抑制劑。不同類型的核酶(諸如錘頭型核酶和發(fā)夾型核酶)已經(jīng)用于抗HIV策略中(參見例如美國專利第5,144,019、5,180,818和5,272,262號和PCT專利申請WO 94/01549和WO93/23569)?？梢怨こ谈脑戾N頭型核酶和發(fā)夾型核酶，以切割含有GUC序列的任何靶RNA(Haseloff等，Nature，334，585-591(1988)；Uhlenbeck，Nature，334，585(1987)；Hampel等，Nuc.Acids Res.，18，299-304(1990)；和Symons，Ann.Rev.Biochem.，61，641-671(1992))。一般來說，錘頭型核酶有兩種類型的功能域，即一個側(cè)翼為兩個雜交域的保守催化域。雜交域與GUC序列周圍的序列結(jié)合，而催化域切割GUC序列的3’RNA靶(Uhlenbeck(1987)，見上述；Haseloff等，(1988)，見上述；和Symons(1992)，見上述)。
大量研究證實，核酶至少可以部分有效地抑制組織培養(yǎng)細(xì)胞中HIV的繁殖(參見例如Saver等，Science，247，1222-1225(1990)；Saver等，NIH Res.，5，63-67(1993a)；Dropuluc’等，J.Virol.，66，1432-1441(1992)；Dropulic等，MethodsComp.Meth.Enzymol.，5，43-49(1993)；Ojwang等，PNAS，89，10802-10806(1992)；Yu等，PNAS，90，6340-6344(1993)；和Weerasinghe等，J.Virol.，65，5531-5534(1991))。具體地說，Saver等((1990)，見上述)已經(jīng)證明，設(shè)計在HIV gag基因轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)切割的錘頭型核酶(即抗gag核酶)在體外可以特異性地切割HIV gagRNA。此外，當(dāng)用HIV-1攻擊表達(dá)抗gag核酶的細(xì)胞系時，觀察到50-100倍的抑制HIV復(fù)制。同樣，Weerasinghe等((1991)，見上述)已經(jīng)表明，編碼設(shè)計在HIV-1 RNA的U5序列內(nèi)切割的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體當(dāng)隨后用HIV攻擊轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞時，賦予轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞HIV抗性。盡管如通過用來驅(qū)動核酶表達(dá)的啟動子系統(tǒng)測定的，不同的轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞克隆對攻擊表現(xiàn)出不同水平抗性，但大多數(shù)表達(dá)核酶的細(xì)胞系在培養(yǎng)有限時間后，屈服于HIV表達(dá)。
用雜交域?qū)IV U5區(qū)為特異性的核酶導(dǎo)入其nef基因(該基因?qū)τ诮M織培養(yǎng)中病毒的復(fù)制是不必要的)的前病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)到組織培養(yǎng)細(xì)胞中已經(jīng)表明，與用野生型前病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞相比，100倍地抑制病毒在轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞中的復(fù)制(參見例如Dropulic等(1992)和(1993)，見上述)。同樣，已發(fā)現(xiàn)發(fā)夾型核酶抑制HIV在用含U5發(fā)夾型核酶的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)、并用HIV攻擊的T細(xì)胞中復(fù)制(Ojwang等，(1992)，見上述)。其它研究已經(jīng)表明，含有由tRNA啟動子表達(dá)的核酶的載體，也抑制多種HIV毒株(Yu等(1993)，見上述)。
將核酶或其它遺傳抗病毒劑傳遞到HIV感染的細(xì)胞靶(例如CD4+T細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞)，已經(jīng)成為有效遺傳治療處理AIDS的主要障礙。目前以造血系統(tǒng)細(xì)胞(即HIV感染的主要靶)為目標(biāo)的途徑，要求將治療基因?qū)敕只瘯r產(chǎn)生成熟T細(xì)胞的前體多能造血干細(xì)胞或成熟CD4+T淋巴細(xì)胞中。然而，由于干細(xì)胞難以體外培養(yǎng)和轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此以干細(xì)胞為目標(biāo)存在問題。以循環(huán)T淋巴細(xì)胞為目標(biāo)也有問題，因為這些細(xì)胞傳播得如此之廣，以致于使用目前的載體傳遞系統(tǒng)難以到達(dá)所有靶細(xì)胞。此外，由于巨噬細(xì)胞是病毒傳播到其它器官的主要貯主，因此應(yīng)將它們考慮為細(xì)胞靶。然而，由于巨噬細(xì)胞是成體終末分化的，因此不進(jìn)行細(xì)胞分裂，所以它們不易用常用載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。
因此，目前治療HIV的主要方法利用復(fù)制缺陷型病毒載體和包裝(即“輔助”)細(xì)胞系(參見例如Buchschacher，JAMA，269(22)，2880-2886(1993)；Anderson，Science，256，808-813(1992)；Miller，Nature，357，455-460(1992)；Mulligan，Science，260，926-931(1993)；Friedmann，Science，244，1275-1281(1989)；和Cournoyer等，Ann.Rev.Immunol.，11，297-329(1993))，將特異性干擾病毒復(fù)制或使受感染細(xì)胞致死的外源基因?qū)胍资懿《靖腥?諸如HIV感染)的細(xì)胞中(Buchschacher(1993)進(jìn)行了綜述，見上述)。這類復(fù)制缺陷型病毒載體除含有目的外源基因外，還含有病毒復(fù)制必需的順式作用序列，但不含編碼必需病毒蛋白質(zhì)的序列。結(jié)果，這樣一種載體不能夠完成病毒復(fù)制周期，而使用含有并組成型表達(dá)其基因組中病毒基因的輔助細(xì)胞系來繁殖它。將復(fù)制缺陷型病毒載體導(dǎo)入輔助細(xì)胞系后，反式提供該載體形成病毒顆粒所需的蛋白質(zhì)，產(chǎn)生能夠感染靶細(xì)胞并在其中表達(dá)該基因的載體病毒顆粒，它干擾病毒復(fù)制，或使得病毒感染的細(xì)胞死亡。
這類復(fù)制缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括腺病毒和腺病毒相關(guān)病毒以及用于HIV基因治療臨床實驗的那些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，特別是已知為莫洛尼鼠白血病病毒(MuLV)的小鼠嗜兩棲類逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。這些缺陷型病毒載體已經(jīng)用來用遺傳抗病毒劑(諸如抗HIV核酶)轉(zhuǎn)導(dǎo)CD4+細(xì)胞，其成功的程度不同(Sarver等(1990)，見上述；Weerasinghe等(1991)，見上述；Dropulic等(1993)，見上述；Ojwang等(1992)，見上述；和Yu等(1993)，見上述)。然而，這些載體本身限制HIV基因治療的應(yīng)用。例如，高轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率在HIV治療中是尤其重要的，在此該載體必須轉(zhuǎn)導(dǎo)稀少的CD34+遠(yuǎn)祖造血干細(xì)胞或廣泛傳播的靶CD4+T細(xì)胞，其中大多數(shù)在疾病臨床“潛伏”期中已經(jīng)感染HIV。然而，MuLV載體難以獲得高效價，因此，導(dǎo)致轉(zhuǎn)導(dǎo)差。此外，在CD34+遠(yuǎn)祖干細(xì)胞中，特別是在分化為成熟T淋巴細(xì)胞后，尚未獲得轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA的長期表達(dá)。另外，缺陷型病毒載體的使用需要體外基因轉(zhuǎn)移策略(參見例如美國專利第5,399,346號)，這可能是昂貴的，并且超出大眾的費用。
與使用目前可利用的用于AIDS遺傳治療處理的載體有關(guān)的這些缺點，已經(jīng)使研究人員找出新的病毒載體。一種這種載體是HIV本身。HIV載體已經(jīng)用于傳染性研究(Page等，J.Virol.，64，5270-5276(1990))和用來將基因(諸如自殺基因)導(dǎo)入CD4+細(xì)胞中，特別是導(dǎo)入感染HIV的CD4+細(xì)胞中(參見例如Buchschacher等，Hum.Gener.Ther.，3，391-397(1992)；Richardson等，J.Virol.，67，3997-4005(1993)；Carroll等，J.Virol.，68，6047-6051(1994)；和Parolin等，J.Virol.，68，3888-3895(1994))。這些研究的策略是使用HIV載體，將基因?qū)隒D4+T細(xì)胞和單核細(xì)胞中。
然而迄今為止，這些載體是極其復(fù)雜的。此外，這些載體的使用伴隨著通過細(xì)胞內(nèi)重組產(chǎn)生野生型HIV的風(fēng)險。已經(jīng)觀察到缺陷型載體序列和輔助病毒共轉(zhuǎn)染/共感染導(dǎo)致病毒基因組同源區(qū)之間的重組(Inoue等，PNAS，88，2278-282(1991))。體外觀察到的互補(bǔ)表明，相似的復(fù)制缺陷型HIV載體可以在體內(nèi)重組，因此加劇已經(jīng)存在的HIV感染。逆轉(zhuǎn)錄病毒將兩個RNA基因組包裝到一個病毒粒子中的事實已經(jīng)使研究人員指出，逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶兩個病毒RNA，以防止由互補(bǔ)和/或重組引起的任何遺傳缺陷(Inoue等(1991)，見上述)。
除細(xì)胞內(nèi)重組，由此產(chǎn)生野生型HIV的風(fēng)險外，HIV載體還具有體內(nèi)突變的相關(guān)風(fēng)險，這提高該病毒載體的致病性。這已經(jīng)使Sarver等(AIDS Res.and Hum.Retrovir.，9，483-487(1993b))推測第二代重組HIV載體的研制，這些載體具有復(fù)制能力，而無致病性。與主要使用的非復(fù)制型載體(即復(fù)制缺陷型載體)相比，這類載體在病人體內(nèi)繼續(xù)復(fù)制，由此提供與野生型HIV的恒定競爭。然而，迄今尚不能獲得這類載體。
理想的是，治療受感染個體的最佳機(jī)會發(fā)生在接種時，在該病毒感染該宿主之前。然而，由于許多個體直至疾病的潛伏期才認(rèn)識到他們已經(jīng)感染了HIV，因此難以實現(xiàn)這一點。在此基礎(chǔ)上，最強(qiáng)烈需要抗病毒介入的階段是臨床潛伏期間。在該階段的治療要求面對已經(jīng)感染的大量CD4+淋巴細(xì)胞引起的攻擊，這種淋巴細(xì)胞含有病毒基因組。這不是平常的攻擊，事實證明，迄今仍不能治療HIV，目前可利用的治療方法只能很差地治療。沒有有效的疫苗，盡管逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和蛋白酶已經(jīng)表明防止HIV在組織培養(yǎng)物中復(fù)制，但體內(nèi)病毒抗性的發(fā)展已經(jīng)導(dǎo)致治療失敗。因此，HIV基因治療對于預(yù)測在2000年時超過四千萬感染HIV的個體中的大多數(shù)而言幾乎沒有益處。
根據(jù)以上所述，對于某些病原體，尤其是病毒，特別是在例如AIDS和癌的情況下，發(fā)展對這些病原體的長期和持久性免疫應(yīng)答也變得越來越重要。已經(jīng)考慮采用具有復(fù)制能力無致病性的病毒的減毒活(LA)疫苗(Daniel等，Science，258，1938-1941(1992)；和Desrosiers，AIDS Res.& Human Retrovir.，10，331-332(1994))。然而，由于在一個或多個基因內(nèi)的缺失而不同于相應(yīng)野生型病毒的這類非致病病毒，或者(i)因為該抗原不持久(因為LA病毒不能有效地復(fù)制)而不能引起保護(hù)性免疫應(yīng)答；或者(ii)LA病毒復(fù)制，但具有其它致病潛力，如LA病毒在年輕動物模型中的致病能力證實的(Baba等，Science，267，1823-1825(1995))。
由于上述原因，仍需要病毒感染特別是在AIDS和癌的情況下的選擇預(yù)防和治療處理用藥程式。本發(fā)明通過提供條件復(fù)制型載體，提供這類選擇方法。本發(fā)明也提供可以使用這樣一種載體的其它方法。本發(fā)明的這些和其它目的和優(yōu)點以及其它發(fā)明特征將由本文提出的本發(fā)明描述中明顯看出。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種條件復(fù)制型病毒載體，其特征在于僅在允許該載體復(fù)制的宿主細(xì)胞中復(fù)制的能力。
在一個實施方案中，該條件復(fù)制型病毒載體包含至少一個核酸序列，該序列的存在、轉(zhuǎn)錄或翻譯賦予允許復(fù)制的宿主細(xì)胞中的該載體的選擇性優(yōu)勢高于對應(yīng)于衍生該載體的病毒的野生型毒株。
在該條件復(fù)制型病毒載體的另一實施方案中，該載體、最好是逆轉(zhuǎn)錄病毒包含至少一個核酸序列，該序列的存在、轉(zhuǎn)錄或翻譯賦予感染該載體的宿主細(xì)胞的選擇性優(yōu)勢高于感染病毒野生型毒株的細(xì)胞，其中該病毒野生型毒株相當(dāng)于衍生該載體的病毒。
本發(fā)明也提供包含條件復(fù)制型病毒載體和藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物。還提供包含條件復(fù)制型病毒載體的宿主細(xì)胞。所述載體如果是DNA，則包含選自SEQ ID NO2、4、5、6、7、15、16、17和18的一個核苷酸序列，所述載體如果是RNA，則包含由選自SEQID NO2、4、5、6、7、15、16、17和18的一個核苷酸序列編碼的核苷酸序列，該載體也作為本文提出的分離并純化的核酸分子提供。同樣提供產(chǎn)生具有核酶的載體的方法、修飾載體的方法和不用包裝細(xì)胞系而繁殖并選擇性地包裝條件復(fù)制型載體的方法。
在本發(fā)明的再一實施方案中，提供治療性和預(yù)防性處理感染病毒的宿主細(xì)胞的方法。這類方法可以還適當(dāng)?shù)匕ㄊ褂幂o助表達(dá)載體、細(xì)胞毒性藥物、蛋白質(zhì)/因子或蛋白酶/逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。該方法可以用來例如抑制病毒復(fù)制、治療癌、體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移，或在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)目的基因。
在又一實施方案中，提供使用包含條件復(fù)制型載體的宿主細(xì)胞檢測藥物/因子和蛋白質(zhì)之間相互作用的方法。這樣一種方法使得能夠進(jìn)行蛋白質(zhì)特征記述和篩選對給定蛋白質(zhì)有活性的藥物/因子。
附圖簡述

圖1A-1E圖示野生型HIV(圖1A)、crHIV-1.1(圖1B)、crHIV-1.11(圖1C)、crHIV-1.12(圖1D)和crHIV-1.111(圖1E)中存在的病毒基因組結(jié)構(gòu)。命名cr，條件復(fù)制型；U5，U5編碼序列；Rz，核酶；Ψ，包裝信號；gag、pol和env，分別形成病毒核心蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶和囊膜蛋白的編碼序列；tat、rev、rre和nef，其它病毒基因；空心方框，病毒長末端重復(fù)序列。野生型U5編碼區(qū)中的叉表示按照本發(fā)明核酶在野生型U5 RNA、而不是修飾的crHIV U5 RNA(即“mU5”)中切割的大致區(qū)域。
圖2描述野生型HIV U5 RNA的DNA序列[SEQ ID NO1](A)和修飾的crHIV U5 RNA的DNA序列[SEQ ID NO2](B)。數(shù)字是指轉(zhuǎn)錄起始下游的堿基數(shù)。
圖3為描述與不切割的crHIV U5 RNA(第8-14泳道)相比，野生型U5 RNA(第1-7泳道)體外核酶切割敏感性的放射自顯影照片野生型HIV U5 RNA轉(zhuǎn)錄物(第1泳道)；含有以+115位點為靶(即相當(dāng)于轉(zhuǎn)錄起始下游的堿基數(shù))的單核酶的核酶RNA(第2和9泳道)；與以+115位點為靶的單核酶保溫的野生型HIV U5 RNA，導(dǎo)致切割產(chǎn)物P1和P2(第3泳道)；含有以+115位點為靶的雙核酶的核酶RNA(第4和11泳道)；與以+115位點為靶的雙核酶保溫的野生型HIV RNA(第5泳道)；含有以+115和+133位點為靶的雙核酶的核酶RNA(第6和13泳道)；與以+115和+133位點為靶的雙核酶保溫的野生型HIV RNA(第7泳道)；crHIV U5 RNA轉(zhuǎn)錄物(第8泳道)；以及與以+115位點為靶的單核酶或雙核酶保溫的crHIV U5 RNA(第10、12和14泳道)，它表現(xiàn)出沒有切割。如果存在核酶切割產(chǎn)物，星號表示該產(chǎn)物出現(xiàn)的位置。
圖4為描述在共轉(zhuǎn)染野生型HIV和crHIV-1.1(空心方框)、野生型HIV和crHIV-1.11(空心打叉方框)、野生型HIV和crHIV-1.12(打點方框)以及野生型HIV和對照質(zhì)粒pGEM-3Z(實心方框)的Jurkat細(xì)胞中，逆轉(zhuǎn)錄酶活性(cpm/μl)對crHIV介導(dǎo)的野生型HIV復(fù)制抑制時間(共轉(zhuǎn)染后的天數(shù))的圖。
圖5為描述在共轉(zhuǎn)染野生型HIV和crHIV-1.1(空心方框)、野生型HIV和crHIV-1.11(空心打叉方框)、野生型HIV和crHIV-1.111(打點方框)以及野生型HIV和質(zhì)粒pGEM-3Z(實心方框)的Jurkat細(xì)胞中，逆轉(zhuǎn)錄酶活性(cpm/μl)對crHIV介導(dǎo)的野生型HIV復(fù)制抑制時間(共轉(zhuǎn)染后的天數(shù))的圖。
圖6A-6C圖示用來檢測野生型HIV(圖6A)、crHIV-1.1(圖6B)和crHIV-1.111(圖6C)的U5 RNA轉(zhuǎn)錄物的引物和探針。命名U5，U5編碼序列；Ψ，包裝信號；gag、pol和env，分別形成病毒核心、逆轉(zhuǎn)錄酶和囊膜蛋白的編碼序列；空心方框，病毒長末端重復(fù)序列；實心方框，tat和rev編碼序列；而PE、V1、V2、V3、R1和R2，用于野生型和/或條件復(fù)制型病毒的引物。野生型U5編碼區(qū)中的叉表示按照本發(fā)明的核酶在野生型U5 RNA、而不是修飾的crHIV U5RNA(即“mU5”)中切割的大致區(qū)域。
圖7為描述采用病毒粒子核酶RNA的R1和R2引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增的放射自顯影照片，這些病毒粒子由共轉(zhuǎn)染野生型HIV和crHIV-1.111(第4泳道)、或只轉(zhuǎn)染野生型HIV(第2泳道)的Jurkat細(xì)胞+20天培養(yǎng)物產(chǎn)生。第1泳道和第3泳道包含RT-PCR陰性對照，其中RNA是在缺乏逆轉(zhuǎn)錄酶的情況下偽逆轉(zhuǎn)錄的。
圖8為描述病毒粒子(第1-4泳道)和采用病毒RNA的V1、V2和V3引物進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)(第5-8泳道)RT-PCR擴(kuò)增的放射自顯影照片，這些病毒粒子由共轉(zhuǎn)染野生型HIV和crHIV-1.111(第4和8泳道)、或單獨轉(zhuǎn)染野生型HIV(第2和6泳道)的Jurkat細(xì)胞+20天培養(yǎng)物產(chǎn)生。第1、3、5和7泳道包含RT-PCR陰性對照。
圖9為描述細(xì)胞內(nèi)HIV RNA Northern印跡分析的放射自顯影照片，其中HIV RNA由共轉(zhuǎn)染野生型HIV和crHIV-1.111(第4泳道)、或單獨轉(zhuǎn)染野生型HIV(第3泳道)的Jurkat細(xì)胞+20天培養(yǎng)物產(chǎn)生。顯示野生型HIV RNA(第3泳道)和crHIV-1.111 RNA(第4泳道)的RNA制劑的質(zhì)量和上樣量。
圖10A-10C是描述在野生型HIV助手存在下crHIV復(fù)制的放射自顯影。圖10A含有crHIV-1.111 RNA的病毒粒子在轉(zhuǎn)染crHIV-1.111(第4泳道)或轉(zhuǎn)染pGEM 3Z(第2泳道)的受刺激ACH2細(xì)胞中的產(chǎn)生。第1泳道和第3泳道包含PT-PCR陰性對照。圖10B在用預(yù)先轉(zhuǎn)染(第2泳道)或不轉(zhuǎn)染(第1泳道)crHIV-1.11的受刺激ACH2細(xì)胞上清液感染Jurkat細(xì)胞后，crHIV-1.11核酶DNA的產(chǎn)生。圖10C在首先轉(zhuǎn)染crHIV-1.11、然后超感染pNL4-3病毒(第2泳道)的Jurakt細(xì)胞中，含有crHIV-1.11 RNA的病毒粒子的產(chǎn)生。也顯示了在首先轉(zhuǎn)染pGEM 3Z對照質(zhì)粒、然后超感染pNL4-3病毒(第2泳道)的細(xì)胞中病毒粒子的產(chǎn)生。第1和第3泳道包含RT-PCR陰性對照。
圖11為描述采用病毒生長早期(第1-4泳道)和晚期(第5-8泳道)期間病毒粒子相關(guān)RNA的病毒特異性引物(V1、V2和V3)進(jìn)行RT-PCR放射自顯影照片，這些病毒粒子來自共轉(zhuǎn)染野生型HIV RNA和crHIV-1.11(分別為第4和8泳道)或單獨轉(zhuǎn)染野生型HIV(分別為第2和6泳道)的培養(yǎng)物。第1、3、5和7泳道包含RT-PCR陰性對照。
圖12為描述采用病毒粒子相關(guān)RNA的PE引物的引物延伸放射自顯影照片，這些病毒粒子相關(guān)RNA來自在單獨轉(zhuǎn)染野生型HIV(第1泳道)或共轉(zhuǎn)染野生型HIV和crHIV-1.11(第2泳道)的細(xì)胞中病毒生長晚期階段的crHIV-1.11培養(yǎng)物。
推薦實施方案的描述本發(fā)明提供抑制病毒野生型毒株的方法。該方法包括使能夠感染這樣一種病毒野生型毒株的宿主，最好是實際感染這樣一種病毒野生型毒株的宿主，與只在允許該載體復(fù)制的宿主中繁殖的載體(即非致病條件復(fù)制型(cr)載體)接觸。
正如本文進(jìn)一步描述的，該方法的具體目的是在該宿主中建立用這一非致病條件復(fù)制型載體的競爭感染。一般來說，按照本發(fā)明的條件復(fù)制型載體包含至少一個賦予該條件復(fù)制型載體復(fù)制和傳播選擇性優(yōu)勢(與野生型病毒相比)的核酸序列和/或至少一個賦予含有條件復(fù)制型載體的宿主細(xì)胞選擇性繁殖病毒顆粒優(yōu)勢(與含有野生型病毒的宿主細(xì)胞相比)的核酸序列。
在本發(fā)明的一個推薦實施方案中，該載體包含一個HIV序列，該載體用來治療HIV感染。因此，該載體或含有該載體的宿主細(xì)胞包含至少一個核酸序列，該核酸序列(1)提供與野生型HIV基因組相比，具有選擇性包裝到子代病毒粒子中的優(yōu)點的crHIV基因組(即在它們兩者都駐留的細(xì)胞中)，和/或(2)與產(chǎn)生野生型病毒的宿主細(xì)胞相比，提供具有選擇性產(chǎn)生crHIV病毒粒子的優(yōu)點的產(chǎn)生條件復(fù)制型載體的宿主細(xì)胞。一種方法(本發(fā)明不限于該方法)通過提供crHIV基因組一個或多個能夠切割野生型HIV基因組的核酶，以賦予其選擇性包裝的優(yōu)點。野生型病毒按照本發(fā)明，“病毒”是一種傳染因子，它由蛋白質(zhì)和核酸組成，并且使用宿主細(xì)胞的遺傳機(jī)構(gòu)生產(chǎn)被病毒核酸特化的病毒產(chǎn)物?！昂怂帷笔侵笧閱捂溁螂p鏈、線性或環(huán)狀DNA或RNA的聚合物，可選地含有能夠整合到DNA或RNA聚合物中的合成、非天然或修飾核苷酸。DNA多聚核苷酸最好由基因組序列或cDNA序列組成。
“病毒野生型毒株”為不包含本文所述的任何人造突變的毒株，即為可以由自然界分離的任何病毒?；蛘撸吧投局隇橐呀?jīng)在實驗室培養(yǎng)、但在缺乏任何其它病毒的情況下仍能夠產(chǎn)生子代基因組或病毒粒子的病毒，這些子代基因組或病毒粒子同從自然界中分離的那些基因組或病毒粒子一樣。例如，下面實施例中所述的pNL4-3 HIV分子克隆是一種野生型毒株。
一般來說，本發(fā)明的方法最好用來治療由病毒感染引起的病毒病。病毒(以及該載體，如下所述)最好是一種RNA病毒，但也可以是一種DNA病毒。RNA病毒為感染原核細(xì)胞(例如噬菌體)以及許多真核細(xì)胞(包括哺乳動物，特別是人類)的多樣化的一類。大多數(shù)RNA病毒具有作為其遺傳物質(zhì)的單鏈RNA，盡管至少一個科具有作為遺傳物質(zhì)的雙鏈RNA。RNA病毒分為主要的三類正鏈病毒(即該病毒轉(zhuǎn)移的基因組翻譯為蛋白質(zhì)，并且其去蛋白化核酸足以引發(fā)感染的那些病毒)、負(fù)鏈病毒(即該病毒轉(zhuǎn)移的基因組與信使有義鏈互補(bǔ)，并且在翻譯前必須用病毒粒子相關(guān)酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的那些病毒)和雙鏈RNA病毒。本發(fā)明方法最好用來處理正鏈病毒、負(fù)鏈病毒和雙鏈RNA病毒。
本文所用的RNA病毒包括辛德畢斯樣病毒(例如披膜病毒科、雀麥花葉病毒屬、黃瓜花葉病毒組、煙草花葉病毒組、等軸不穩(wěn)環(huán)班病毒、煙草脆裂病毒組和馬鈴薯X病毒組(Potexvirus))、小核糖核酸病毒樣病毒(例如小核糖核酸病毒科、杯狀病毒科、缸豆花葉病毒組、線蟲傳多角體病毒組和potyvirus)、負(fù)鏈病毒(例如副粘病毒科、彈狀病毒科、正粘病毒科、本雅病毒科和砂粒樣病毒科)、雙鏈病毒(例如呼腸孤病毒科和雙節(jié)段RNA病毒科)、黃病毒樣病毒(例如黃病毒科和瘟病毒屬)、逆轉(zhuǎn)錄病毒樣病毒(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒)、冠狀病毒科和其它病毒組，包括(但不限于)羅達(dá)病毒科。
推薦的按照本發(fā)明的RNA病毒是黃病毒科病毒，最好是黃病毒屬病毒，尤其是馬爾堡或埃波拉病毒。黃病毒科病毒最好是黃病毒屬病毒，諸如黃熱病病毒、登革熱病毒、西尼羅病毒、圣路易腦炎病毒、日本腦炎病毒、摩萊河谷腦炎病毒、羅西歐病毒、蜱傳腦炎病毒等。
也最好是小核糖核酸病毒科病毒，最好是甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)或非甲非乙型肝炎病毒。
另一類推薦的RNA病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒科病毒(即逆轉(zhuǎn)錄病毒)，特別是腫瘤病毒亞科、泡沫病毒亞科、泡沫病毒屬、慢病毒亞科和慢病毒屬的屬或亞科病毒。腫瘤病毒亞科的亞科RNA病毒希望是1型或2型人親T淋巴病毒(即HTLV-1或HTLV-2)或牛白血病病毒(BLV)、禽白血病-肉瘤病毒(例如勞斯肉瘤病毒(RSV)、禽成髓細(xì)胞性白血病病毒(AMV)、禽成紅血細(xì)胞性病病毒(AEV)和勞斯相關(guān)病毒(RAV；RAV-0至RAV-50)、哺乳動物C型病毒(例如莫洛尼鼠白血病病毒(MuLV)、哈維鼠肉瘤病毒(HaMSV)、艾貝爾遜鼠白血病病毒(A-MuLV)、AKR-MuLV、貓白血病病毒(FeLV)、猿猴肉瘤病毒、網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病毒(REV)、脾壞死病毒(SNV))、B型病毒(例如小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV))和D型病毒(例如馬森-法衣扎猴病毒(MPMV)和“SAIDS”病毒)。慢病毒亞科的RNA病毒希望是1型或2型人免疫缺陷病毒(即HIV-1或HIV-2，其中HIV-1以前稱為淋巴結(jié)病相關(guān)病毒3(HTLV-III)和獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS)相關(guān)病毒(ARV))、或與HIV-1或HIV-2有關(guān)的、已經(jīng)鑒定與AIDS或AIDS樣疾病有關(guān)的另一病毒。本文所用的縮寫字“HIV”或術(shù)語“AIDS病毒”或“人免疫缺陷病毒”在屬類上是指這些HIV病毒和HIV相關(guān)病毒。此外，慢病毒亞科的RNA病毒最好是維斯那/梅迪病毒(例如感染羊的)、貓免疫缺陷病毒(FIV)、牛慢病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、馬傳染性貧血病病毒(EIAV)和山羊關(guān)節(jié)炎-腦炎病毒(CAEV)。
按照本發(fā)明的病毒也希望是DNA病毒。該DNA病毒最好是EB病毒、腺病毒、單純皰疹病毒、乳頭瘤病毒、痘苗病毒等等。
這些病毒中的許多病毒被分類為“第4生物安全等級”(即世界衛(wèi)生組織(WHO)的“第4風(fēng)險類”)的病原體，為此所有實驗室研究工作都需要極端控制設(shè)備。然而，普通技術(shù)人員熟悉并能夠遵守這些病毒所必需的安全注意事項。
“宿主細(xì)胞”可以是任何細(xì)胞，最好是真核細(xì)胞。該宿主細(xì)胞希望是淋巴細(xì)胞(諸如T淋巴細(xì)胞)或巨噬細(xì)胞(諸如單核巨噬細(xì)胞)，或是這些細(xì)胞中任一個的前體，諸如造血干細(xì)胞。這些細(xì)胞在細(xì)胞表面上最好包含CD4+糖蛋白，即CD4+。然而，希望已經(jīng)感染AIDS病毒的CD4+T淋巴細(xì)胞尚未激活(即最好尚未發(fā)生nef的表達(dá)，甚至更優(yōu)選尚未減量調(diào)節(jié)CD4基因的表達(dá)，正如下面進(jìn)一步討論的)。此外，宿主細(xì)胞最好是缺乏CD4標(biāo)記的、并能夠被按照本發(fā)明的病毒感染的細(xì)胞。這樣的細(xì)胞包括(但不限于)星形細(xì)胞、皮膚成纖維細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞等等。該宿主細(xì)胞最好是真核多細(xì)胞物種細(xì)胞(例如與單細(xì)胞酵母細(xì)胞相對)，甚至更優(yōu)選是哺乳動物(例如人)細(xì)胞。細(xì)胞可以作為單個實體存在，或可以是較大細(xì)胞集合的部分。這樣一種“較大細(xì)胞集合”可以包括例如細(xì)胞培養(yǎng)物(或者為混合的，或者為純的)、組織(例如上皮組織或其它組織)、器官(例如心臟、肺、肝臟、膽囊、膀胱、眼和其它器官)、器官系統(tǒng)(例如循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、體被系統(tǒng)或其它器官系統(tǒng))或生物(例如鳥類、哺乳動物等)。這些作為靶的器官/組織/細(xì)胞最好屬于循環(huán)系統(tǒng)(例如包括(但不限于)心臟、血管和血液)、呼吸系統(tǒng)(例如鼻、咽、喉、氣管、支氣管、細(xì)支氣管、肺等)、消化系統(tǒng)(例如包括口、咽、食管、胃、腸、唾液腺、胰腺、肝臟、膽囊和其它器官)、泌尿系統(tǒng)(例如腎、輸尿管、膀胱、尿道等)、神經(jīng)系統(tǒng)(例如包括(但不限于)腦和脊髓，以及特殊感官，諸如眼)和體被系統(tǒng)(例如皮膚)。作為靶的細(xì)胞更優(yōu)選選自心臟、血管、肺、肝臟、膽囊、膀胱和眼細(xì)胞。載體“載體”是一種用來將過客核酸序列(即DNA或RNA)轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中的核酸分子(通常為DNA或RNA)。三種常見類型的載體包括質(zhì)粒、噬菌體和病毒。該載體最好是病毒。
希望該載體不是病毒的野生型毒株，因為它包括人造突變。因此該載體通常通過遺傳操作(即通過缺失)由病毒野生型毒株衍生，以包括條件復(fù)制型病毒，正如本文進(jìn)一步描述的。最理想的是，該病毒載體包括一個與引起待治療感染的野生型病毒類型相同的病毒毒株，引起感染的病毒最好是其中一種上述野生型病毒。因此，該載體最好得自RNA病毒，該載體甚至更優(yōu)選得自逆轉(zhuǎn)錄病毒，最理想的是，該載體得自人免疫缺陷病毒。得自人免疫缺陷病毒的這樣一種載體本文從種屬上說稱為“crHIV”載體。
載體最好也是一種“嵌合載體”，例如病毒載體與其它序列的組合，諸如HIV序列與另一病毒(它最好得自病毒野生型毒株，以包括條件復(fù)制型載體)的組合。具體地說，希望HIV序列可以與腺病毒或腺病毒相關(guān)病毒的修飾毒株(即非野生型)、辛德畢斯病毒載體或嗜兩棲類鼠逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的序列連接。
如本文所包括的，載體可以包括或者DNA或者RNA。例如或者DNA載體或者RNA載體可以用來衍生該病毒。同樣，cDNA拷貝可以由病毒RNA基因組構(gòu)成。另一方法是，可以體外轉(zhuǎn)錄cDNA(或病毒基因組DNA)部分，以生產(chǎn)RNA。這些技術(shù)對本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的，也在以下實施例中進(jìn)行了描述。
“條件復(fù)制型病毒”是一種復(fù)制缺陷型病毒，它只在某些條件下是缺陷型。具體地說，該病毒在允許宿主細(xì)胞中可以完成其復(fù)制周期，而在限制性宿主細(xì)胞中不能完成其復(fù)制周期。“允許宿主細(xì)胞”是一種感染病毒野生型毒株的宿主細(xì)胞。這種感染可以發(fā)生在感染按照本發(fā)明的條件復(fù)制型病毒之前或之后?；蛘?，“允許宿主細(xì)胞”是編碼病毒復(fù)制所必需的野生型病毒基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞。因此，按照本發(fā)明的條件復(fù)制型載體是這樣一種病毒(它最好與待治療感染的病毒類型相同)，它只在與病毒野生型毒株互補(bǔ)時，或野生型病毒感染含有條件復(fù)制型載體基因組的細(xì)胞時進(jìn)行復(fù)制。
在推薦實施方案中，載體包含以DNA形式導(dǎo)入的RNA病毒(例如條件復(fù)制型HIV病毒)。該推薦實施方案提供一種復(fù)制HIV-1(crHIV)載體的策略，它提供非致病crHIV-1載體基因組的選擇性優(yōu)勢高于致病野生型HIV基因組。具體地說，在同時含有野生型HIV和crHIV基因組的細(xì)胞中，crHIVRNA具有包裝到病毒粒子中的選擇性優(yōu)點，因為它們含有例如切割野生型RNA、但不切割crHIV RNA的核酶。這類非致病crHIV在野生型輔助病毒存在下，能夠傳播到對易受HIV感染的未受感染細(xì)胞(例如CD4+細(xì)胞)。crHIV的選擇性包裝和傳播以這種方式干擾野生型HIV的復(fù)制。
具體地說，將crHIV基因組導(dǎo)入受感染細(xì)胞或未受感染細(xì)胞中。受感染細(xì)胞提供crHIV基因組子代病毒粒子包衣和生產(chǎn)所需的蛋白質(zhì)。最好可以或者直接通過轉(zhuǎn)導(dǎo)(例如可以通過脂質(zhì)體介導(dǎo)的crHIVDNA轉(zhuǎn)導(dǎo)，或通過采用嵌合病毒載體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)做到這一點)，或者通過感染由轉(zhuǎn)染感染野生型HIV的細(xì)胞產(chǎn)生的crHIV顆粒，將crHIV基因組導(dǎo)入未受感染細(xì)胞中。未受感染細(xì)胞本身不產(chǎn)生crHIV顆粒。然而，它們可以用野生型病毒超感染，后者供應(yīng)進(jìn)一步生產(chǎn)crHIV顆粒所需的蛋白質(zhì)。在這種意義上，按照本發(fā)明的條件復(fù)制型載體也用作提供可以獲得多輪crHIV感染(即在同時感染野生型HIV的情況下)的方法的一種類型的“病毒傳遞載體”。提供一輪以上病毒復(fù)制病毒源的這樣一種載體與目前所用的其它載體形成對比，目前所用的其它載體諸如與包裝細(xì)胞系一起使用的那些載體，它們只提供一輪復(fù)制。
需要時(例如以促進(jìn)該載體體外使用)，可以將野生型病毒基因產(chǎn)物共同供給感染該條件復(fù)制型載體的細(xì)胞。不僅可以通過共感染野生型病毒毒株(或cDNA或RNA病毒的前病毒)，而且可以通過將它們以它們的基因在表達(dá)載體(例如輔助表達(dá)載體(“助手”))中亞克隆形式供給細(xì)胞，供應(yīng)野生型病毒基因產(chǎn)物，其中輔助表達(dá)載體能夠使宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄或翻譯該序列(調(diào)節(jié)序列或結(jié)構(gòu)序列)，或者，可以從外部供應(yīng)基因產(chǎn)物，即通過將蛋白產(chǎn)物加入該細(xì)胞中。關(guān)于該“助手”，其表達(dá)可以是細(xì)胞特異性的或不是細(xì)胞特異性的，可以將其與本文限定的條件復(fù)制型載體一起導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，由此能夠連續(xù)復(fù)制條件復(fù)制型病毒載體。
本文所用的“互補(bǔ)”是指來自細(xì)胞中不同來源的病毒基因產(chǎn)物的非遺傳相互作用。具體地說，對于混合感染，互補(bǔ)包括一個或兩個親本基因組病毒產(chǎn)量的提高，而親本基因組的基因型保持不變?；パa(bǔ)可以是非等位的(即基因間的，其中不同功能缺陷型的突變體通過供給另一病毒缺陷的功能，在病毒復(fù)制中相互協(xié)助)，或是等位的(即基因內(nèi)的，其中兩個親本在多體蛋白的不同域中有缺陷)。
最好是，可以轉(zhuǎn)染(轉(zhuǎn)導(dǎo))crHIV DNA(即通過脂質(zhì)體或通過使用腺病毒載體或嗜兩棲類逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)的細(xì)胞類型可以為或者感染HIV或未感染HIV的細(xì)胞。感染的細(xì)胞可以已被激活或未被激活。如果它們被激活，那么它們將立刻轉(zhuǎn)錄野生型HIV RNA和crHIV RNA，導(dǎo)致選擇性地將crHIV RNA包裝到子代病毒粒子中。如果感染HIV的細(xì)胞未被激活，那么crHIV DNA將駐留在該細(xì)胞中，直至它們被激活(例如通過促細(xì)胞分裂劑、抗原等刺激)，導(dǎo)致選擇性地將crHIV RNA包裝到子代病毒粒子中。轉(zhuǎn)染crHIV DNA的激活和未激活未受感染細(xì)胞直至它們超感染野生型HIV并通過刺激激活，再導(dǎo)致選擇性地將crHIV RNA包裝到子代病毒粒子中，才產(chǎn)生病毒粒子。
因為crHIV基因組不編碼阻斷超感染的病毒蛋白(諸如env和nef)，因此發(fā)生含有crHIV基因組細(xì)胞的超感染(例如由于轉(zhuǎn)染或感染產(chǎn)生的)。產(chǎn)生的crHIV病毒粒子可以感染未受感染細(xì)胞，因為這些病毒顆粒含有逆轉(zhuǎn)錄酶分子，后者是所有HIV顆粒攜帶的，使得它們可以由其基因組RNA產(chǎn)生DNA前病毒。該過程稱為逆轉(zhuǎn)錄。一旦crHIV病毒粒子感染未受感染細(xì)胞，它們則可以經(jīng)歷逆轉(zhuǎn)錄，并由其基因組RNA產(chǎn)生前病毒。因此，這些細(xì)胞是直接轉(zhuǎn)導(dǎo)crHIV DNA的未受感染細(xì)胞的等價物。直至這些細(xì)胞超感染野生型HIV并被激活時，才產(chǎn)生crHIV顆粒，然后再選擇性地將crHIV RNA包裝到子代病毒粒子中?？赡躢rHIV顆粒也可以感染某些已經(jīng)感染HIV的細(xì)胞(參見例如Yunoki等，Arch.Virol.，116，143-158(1991)；Winslow等，Virol.，196，849-854(1993)；Chen等，Nuc.Acids Res.，20，4581-4589(1992)；和Kim等，AIDS Res.& Hum.Retrovir.，9，875-882(1993))。然而，為了發(fā)生這種情況，這些感染HIV的細(xì)胞必須不表達(dá)減量調(diào)節(jié)CD4表達(dá)的蛋白質(zhì)，因為這將防止crHIV病毒粒子感染這些細(xì)胞。感染HIV的細(xì)胞激活時，一般減量調(diào)節(jié)CD4的表達(dá)。因此，未激活的感染HIV的細(xì)胞對crHIV超感染潛在地敏感，并且因此可能是crHIV顆粒生產(chǎn)的另一來源。
關(guān)于按照本發(fā)明的推薦crHIV載體，該載體包含RNA轉(zhuǎn)錄、tRNA引物結(jié)合、二聚體形成和包裝所需的序列，它們或者缺乏編碼阻斷超感染野生型HIV的蛋白質(zhì)的序列(例如nef或env蛋白)，或包含這類序列，但這些序列或者不轉(zhuǎn)錄，或者不翻譯為功能蛋白，使得認(rèn)為它們的表達(dá)是“沉默”的。甚至更優(yōu)選該載體缺乏野生型HIV從gag編碼序列內(nèi)至nef基因并包括nef基因區(qū)域的編碼區(qū)或編碼序列。然而，最好是該載體確實包含rev應(yīng)答因子(RRE)，后者克隆到該載體的缺失區(qū)或某些其它方便的區(qū)中。如上所述，由于該載體可以以其RNA表現(xiàn)形式或以DNA形式給藥，我們說這種推薦的HIV載體“缺乏該區(qū)編碼區(qū)或編碼序列”。
載體的構(gòu)建對本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的。例如，如實施例1所述，用限制酶切割RNA病毒(諸如HIV)的DNA表現(xiàn)形式，以在nef基因后面切下從gag編碼區(qū)內(nèi)至U3區(qū)內(nèi)的HIV編碼序列。在將含有多個限制位點的多接頭組成的克隆盒在連接前插入該缺失區(qū)，以提供用于克隆入該載體的便利的限制位點。將含有RRE的DNA片段亞克隆到其中一個這些位點中。產(chǎn)生的質(zhì)粒產(chǎn)生縮短的gag轉(zhuǎn)錄物，而不產(chǎn)生野生型Gag蛋白或任何其它野生型HIV蛋白。此外，由于該gag轉(zhuǎn)錄起始序列可以突變，以防止其轉(zhuǎn)錄，因此甚至該載體表達(dá)縮短的gag蛋白也是不必要的。
采用相同方法，可以將crHIV序列與諸如病毒和其它載體序列的其它序列連接，以衍生嵌合載體。例如，可以將crHIV序列與辛德畢斯病毒、AAV、腺病毒或嗜兩棲類逆轉(zhuǎn)錄病毒的序列連接，這僅僅列舉少數(shù)可以用來提供crHIV序列傳遞的這類病毒?；蛘呃眉?xì)胞進(jìn)入的連體病毒機(jī)制(例如腺病毒受體介導(dǎo)的胞吞作用)或其它方法(例如脂質(zhì)體)，可以用這樣一種嵌合載體將該載體導(dǎo)入該細(xì)胞中。
按照本發(fā)明，載體(即最好是crHIV載體的條件復(fù)制型病毒)最好包含至少一種核酸序列，占有該序列(即存在、轉(zhuǎn)錄或翻譯)則賦予選擇性優(yōu)勢。有兩個類型這類核酸序列待包入該載體中(1)一種核酸序列，擁有該序列最佳地賦予包含這種序列的載體優(yōu)于病毒野生型毒株(即最好是衍生該載體的野生型毒株，并且它不包含該序列)的病毒復(fù)制和傳播的選擇優(yōu)勢，以及(2)一種核酸序列，與感染病毒野生型毒株(即最好是衍生該載體的野生型毒株(此外例如在未受感染宿主細(xì)胞中促進(jìn)載體復(fù)制和/或起作用的輔助表達(dá)載體)，并且它不包含該序列)的細(xì)胞相比，擁有該序列最佳地通過例如促進(jìn)細(xì)胞存活、促進(jìn)載體顆粒生產(chǎn)和/或繁殖、促進(jìn)由crHIV載體產(chǎn)生細(xì)胞生產(chǎn)crHIV載體病毒粒子(包括細(xì)胞凋亡)、促進(jìn)蛋白生產(chǎn)或促進(jìn)免疫功能或?qū)颍x予感染包含該序列的載體的細(xì)胞選擇優(yōu)勢，以便達(dá)到所需預(yù)防、治療或生物學(xué)結(jié)果。促進(jìn)該載體的繁殖和/或促進(jìn)特定宿主細(xì)胞功能，以便能夠達(dá)到合適的預(yù)防、治療和/或生物學(xué)結(jié)果的這些序列中的每個或多種每種這些序列(即單獨的序列或與一個或多個另一因子組合的序列)，可以在缺乏或存在另一序列的情況下將其包含于該載體中，即該載體可以包含“至少一個核酸序列”和“至少一個另一核酸序列”。
“核酸”如前所述?！昂怂嵝蛄小本唧w包括具有潛在任何大小(即當(dāng)然受該載體施加的任何包裝限制所限制)的任何基因或編碼序列(即DNA或RNA)，其擁有提供選擇性優(yōu)勢，如本文進(jìn)一步描述的?！盎颉笔蔷幋a蛋白質(zhì)或新生mRNA分子的任何核酸序列(無論該序列是否轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)。盡管基因包括編碼序列以及非編碼序列(例如調(diào)節(jié)序列)，但“編碼序列”不包括任何非編碼DNA。
1.核酸序列，該序列的擁有賦予包含這種一種序列的載體在宿主細(xì)胞中的選擇性優(yōu)勢高于病毒野生型毒株。
賦予載體在宿主細(xì)胞中優(yōu)于病毒野生型毒株的的選擇優(yōu)勢的核酸序列，最好是這樣的任一序列，它與從野生型病毒繁殖的病毒顆粒相比，使得從該載體繁殖的病毒顆粒選擇性產(chǎn)生或包裝。這類序列包括(但不限于)導(dǎo)致與野生型基因組相比細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的載體基因組數(shù)增加的序列和抗病毒核酸序列。
第一類核酸序列是與病毒野生型毒株相比，賦予宿主細(xì)胞中含有該序列的載體選擇性優(yōu)勢的諸如啟動子之類的序列?！皢幼印笔侵笇?dǎo)RNA聚合酶結(jié)合并由此啟動RNA合成以及可以包括一個或多個增強(qiáng)子的序列?！霸鰪?qiáng)子”是刺激或抑制相鄰基因轉(zhuǎn)錄的順式作用因子。抑制轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子也稱為“沉默子”。增強(qiáng)子不同于僅在啟動子中發(fā)現(xiàn)的序列特異性DNA結(jié)合蛋白的DNA結(jié)合位點(也稱為“啟動子元件”)，因為增強(qiáng)子可以從兩個方向的任一方向起作用，甚至在距轉(zhuǎn)錄區(qū)下游位點至多幾千堿基對(kb)的距離起作用。
因此，最好修飾條件復(fù)制型HIV載體的啟動子(例如長末端重復(fù)序列(LRT))，使得該載體比野生型HIV毒株更加響應(yīng)某些細(xì)胞因子。例如，可利用證明在白介素-2存在下提高轉(zhuǎn)錄活性的修飾HIV啟動子。將該啟動子加入載體并將該載體導(dǎo)入感染野生型HIV的細(xì)胞中，與野生型HIV基因組相比，最好導(dǎo)致來自該載體基因組的子代病毒粒子的生產(chǎn)和包裝增加。其它細(xì)胞因子和/或化學(xué)因子(chemokines)(例如包括(但不限于)腫瘤壞死因子α、RANTES等)同樣可以用來促進(jìn)該載體編碼的病毒粒子的選擇性包裝。
與病毒野生型毒株相比，賦予含有該序列的載體選擇性優(yōu)勢的第二類核酸序列，作為推薦序列包括抗病毒核酸序列?！翱共《緞备鶕?jù)其作用模式分類，例如逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、病毒進(jìn)入細(xì)胞的競爭劑、疫苗、蛋白酶抑制劑和遺傳抗病毒劑?！斑z傳抗病毒劑”是轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中、并且或者直接(即當(dāng)細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入時)或者在其轉(zhuǎn)化為或者RNA或者蛋白質(zhì)后影響其細(xì)胞內(nèi)的靶的DNA或RNA分子(Dropuli□等綜述，(1994)，見上述)。遺傳抗病毒序列也是一種推薦核酸序列。遺傳抗病毒劑包括(但不限于)反義分子、RNA引捕器、反式顯性突變、毒素、免疫原和核酶。遺傳抗病毒劑希望是反義分子、免疫原和核酶。因此，賦予載體的選擇性優(yōu)勢高于病毒野生型毒株的推薦核酸序列是遺傳抗病毒劑核酸序列，選自反義分子、免疫原和核酶。
“反義分子”是與待阻斷其表達(dá)的基因短區(qū)段互補(bǔ)的分子。導(dǎo)向HIV的反義分子與野生型HIV RNA雜交，允許細(xì)胞核酸酶優(yōu)先降解它。反義分子最好是DNA寡核苷酸，其長度希望大約為20-200個堿基對，其長度最好是大約20-50個堿基對，最佳小于25個堿基對。反義分子可以由crHIV RNA表達(dá)，它優(yōu)先與野生型基因組RNA結(jié)合，由此提供crHIV RNA包裝到子代病毒粒子中的選擇優(yōu)勢。
“免疫原”是一種導(dǎo)向病毒結(jié)構(gòu)蛋白的單鏈抗體(scAb)。免疫原作為核酸轉(zhuǎn)移，并在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。同樣，免疫原也可以是任何抗原、表面蛋白(包括類別限制的那些表面蛋白)或抗體，它促進(jìn)載體和/或宿主細(xì)胞的選擇。在推薦載體中，該核酸序列包括與野生型HIV Rev蛋白結(jié)合的scAb。這最好通過使Rev蛋白保持在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中防止Rev蛋白成熟。具體地說，Rev蛋白通過與RRE結(jié)合，將未剪接的HIV RNA輸出到胞質(zhì)，然后低聚以包圍HIV RNA。與Rev復(fù)合的HIV RNA輸出到細(xì)胞質(zhì)中，繞過細(xì)胞剪接機(jī)制。因此，如果野生型Rev不與野生型RRE結(jié)合，那么野生型HIV RNA就不輸出到細(xì)胞質(zhì)中，也就不能包衣殼成為子代病毒粒子。
含有scAb核酸序列的載體最好還包含一個修飾RRE序列，并編碼識別修飾(而非野生型)RRE的突變Rev蛋白。因此，在含有野生型HIV和包含scAB核酸序列的載體的細(xì)胞中，該載體優(yōu)先包裝為病毒粒子。最好使用相似的策略，其中野生型HIV基質(zhì)蛋白或核衣殼蛋白(即，或參與影響病毒RNA包衣殼的蛋白/RNA相互作用的任何蛋白)為該scAb的靶。
“核酶”是具有催化活性的反義分子，即核酶結(jié)合RNA并影響被結(jié)合RNA分子的位點特異性切割，而不是結(jié)合RNA并抑制翻譯。一般來說，有四組核酶第I四膜蟲組間插序列、RNA酶P以及錘頭型和發(fā)夾型核酶。然而，在其它RNA分子中也存在另一些催化基元，例如δ肝炎病毒和真菌線粒體中的核糖體RNA。
推薦的核酶是催化域切割3’核苷酸NUH序列[SEQ ID NO3]的核酶，其中N可以是任何核苷酸(即G、A、U或C)，而H可以為A、C或U。然而，由于這類核酶最有效切割的序列是GUC位點，因此NUH序列最好包含一個GUC位點。
這樣一種核酶最好在病毒野生型毒株區(qū)內(nèi)或其轉(zhuǎn)錄物區(qū)內(nèi)切割，但不在載體或其轉(zhuǎn)錄物區(qū)內(nèi)切割。如前所述，在這樣一種病毒或載體可以或者為RNA或者為DNA的意義上，該核酶切割該病毒或其轉(zhuǎn)錄物?！霸谝粎^(qū)域內(nèi)”切割是指在靶區(qū)域內(nèi)切割，即最好是在病毒繁殖必需的病毒區(qū)域內(nèi)切割。最好已經(jīng)修飾該載體，使得作為靶的該特定區(qū)域(即如果真的存在于該載體中)不被該核酶切割。只要切割不發(fā)生在病毒(例如crHIV顆粒)繁殖所需的區(qū)域中，那么該核酶可以可選地切割該載體。
最好是該核酶由選自以下的一種序列編碼SEQ ID NO4(即CACACAACACTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACGGGCACA)和SEQ ID NO5(即ATCTCTAGTCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACCAGAGTC)。SEQ ID NO4包含一個以野生型HIV U5區(qū)域+115位點(即根據(jù)轉(zhuǎn)錄起始下游的堿基數(shù))為靶的核酶，而SEQ ID NO5包含一個以野生型HIV U5區(qū)域+133位點為靶的核酶。
這樣一種核酶能夠在野生型HIV基因組(或其轉(zhuǎn)錄物)內(nèi)切割，而不切割該載體基因組(或其轉(zhuǎn)錄物)內(nèi)切割，因為該載體的U5序列通過諸如本領(lǐng)域已知并在實施例1中描述的定點誘變進(jìn)行修飾。具體地說，最好修飾這些載體序列，使得該載體包含選自以下一個序列SEQID NO2(即GTGTGCCCACCTGTTGTGTGACTCTGGCAGCTAGAGAAC)、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6(即GTGTGCCCGCCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATC)、SEQ ID NO7(即GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGCAACTAGAGATC)、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17和SEQ ID NO18。RNA形式的該載體最好包含由選自以下的一個序列編碼的序列SEQ ID NO2、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO15、SEQ ID NO16、SEQ ID NO17和SEQ ID NO18。相反，野生型HIV包含由SEQ ID NO1(即GTGTGCCCGTC TGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATC)編碼的U5序列。圖2提出了全部修飾和與野生型U5序列(DNA形式)的比較。
此外，可以或者單獨使用或者組合使用以病毒其它區(qū)、特別是HIV基因組為靶的其它核酶。例如，該核酶可以在病毒復(fù)制所需的其它RNA序列內(nèi)切割，例如在逆轉(zhuǎn)錄酶、蛋白酶或反式激活蛋白、Rev內(nèi)或諸如已經(jīng)描述的其它必需序列內(nèi)切割。載體最好包含例如以多個位點為靶的多個核酶。在這類情況下，通過定點誘變或諸如本領(lǐng)域已知的某些其它方法修飾該載體中的類似序列，以獲得抗這種核酶切割的載體。
當(dāng)該載體為人免疫缺陷病毒時，該載體最好缺乏tat基因及其5’剪接位點，取而代之包含一個抗Tat三聯(lián)核酶盒，其中該三聯(lián)核酶盒的每個核酶的催化域切割野生型人免疫缺陷病毒核酸分子上的一個不同位點，特別是tat內(nèi)的不同位點。每個核酶的催化域最好切割野生型人免疫缺陷病毒核酸分子一個區(qū)域內(nèi)的核苷酸序列，在野生型病毒中本身沒有該載體中抗核酶的相應(yīng)物。
2.核酸序列，與感染病毒野生型毒株的細(xì)胞相比，擁有該序列賦予感染包含該序列的載體的細(xì)胞選擇性優(yōu)勢。
與含有病毒野生型毒株(即缺乏該序列)的細(xì)胞相比，賦予含有包含該序列的載體的細(xì)胞選擇性優(yōu)勢的核酸序列，最好是與含有野生型病毒的細(xì)胞相比允許含有該載體的細(xì)胞存活并繁殖病毒顆粒(即crHIV病毒顆粒)的任一序列。這類序列包括(但不限于)允許該細(xì)胞或含于該細(xì)胞的載體免于破壞的任何序列、促進(jìn)細(xì)胞存活的序列、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的序列、促進(jìn)蛋白生產(chǎn)的序列或促進(jìn)免疫功能或?qū)虻男蛄小?br> 例如，該載體上含有的這樣一個核酸序列最好編碼多種藥物抗性的基因(參見例如Ueda等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，141，956-962(1986)；Ueda等，J.Biol.Chem.，262，505-508(1987)；和Ueda等，PNAS，84，3004-3008(1987))。在加入的細(xì)胞毒性藥物(例如用于癌癥化療的藥物)存在下，這允許含有該載體的細(xì)胞存活，而含有野生型病毒(諸如HIV)的細(xì)胞不能存活。這類細(xì)胞毒性藥物包括(但不限于)放線菌素D、硫酸長春花堿、硫酸長春新堿、道諾霉素、阿霉素、VP-16和AMSA。
或者，這樣一個核酸序列最好包含一個選自突變蛋白酶序列(或它編碼的序列)和突變逆轉(zhuǎn)錄酶的序列(或它編碼的序列)的序列。最好將突變逆轉(zhuǎn)錄酶工程改造，以對核苷酸和非核苷酸逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑有抗性，并且將突變的蛋白酶工程化，以對常用的蛋白酶抑制劑有抗性。
將這些蛋白抑制劑或逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑與該載體一起給予宿主，用來篩選與產(chǎn)生野生型病毒的細(xì)胞相反的產(chǎn)生該載體的細(xì)胞。同樣，修改該方法，以用于抑制病毒復(fù)制的任何藥物，使得該病毒可以突變以逃避抑制。因此，關(guān)于HIV的治療，加入到該載體的選擇性核酸序列最好包括突變的HIV序列。然而，這些序列最好不防止超感染野生型HIV。
該載體最好是上述那些載體之一，具體地說，為圖1B-1E描述的推薦crHIV載體，即分別為crHIV-1.1、crHIV-1.11、crHIV-1.12和crHIV-1.111(Dropulic等，PNAS，93，11103-11108(1996))。也最好是實施例11中描述的載體，即cr2HIV。
該cr2HIV載體最好缺乏來自野生型人免疫缺陷病毒基因組的tat基因及其剪接位點。該cr2HIV載體包含抗Tat三聯(lián)核酶盒以取代tat基因及其剪接位點，其中三聯(lián)核酶盒的每個核酶的催化域切割野生型HIV核酸分子上的一個不同位點。該三聯(lián)核酶盒的每個核酶的催化域最好切割野生型HIV核酸分子上tat內(nèi)的一個不同位點。每個核酶的催化域更優(yōu)選切割野生型HIV核酸分子區(qū)域內(nèi)的核苷酸序列，在野生型HIV病毒中本身沒有該載體中抗核酶的相應(yīng)物。
載體最好與載體導(dǎo)入的細(xì)胞相容，例如載體能夠使得該細(xì)胞表達(dá)該載體編碼的核酸序列。該載體最好包含在該細(xì)胞中有功能的復(fù)制起點。當(dāng)核酸序列以其DNA編碼序列形式(例如與包含其本身啟動子的完整基因形式相對)轉(zhuǎn)移時，該載體最好也含有能夠驅(qū)動該編碼序列表達(dá)并操作性地與該編碼序列連接的啟動子。當(dāng)啟動子能夠指導(dǎo)編碼序列轉(zhuǎn)錄時，則該編碼序列是“操作性地連接”該啟動子(例如當(dāng)該編碼序列和該啟動子一起組成天然或重組基因時)。
在本發(fā)明重組載體中，最好將所有合適的轉(zhuǎn)錄信號(例如起始信號和終止信號)、翻譯信號(例如核糖體進(jìn)入或結(jié)合位點等)和加工信號(例如剪接供體位點或剪接受體位點，必要時和多腺苷酸化信號)正確地布置在該載體上，使得任何基因或編碼序列在導(dǎo)入該載體的細(xì)胞中適當(dāng)?shù)剞D(zhuǎn)錄(和/或翻譯，如果這樣要求)。確保在宿主細(xì)胞中合適表達(dá)的這類信號的操作是普通技術(shù)人員眾所周知的，并且在其專門技術(shù)范圍內(nèi)。
該載體最好也包含鑒定和篩選該載體或其含有的亞克隆序列的某些工具。采用多種本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法完成載體的鑒定和/或篩選。例如，最好通過雜交、存在于該載體上的標(biāo)記基因編碼的所謂“標(biāo)記”基因功能的存在或缺乏、和/或特定序列的表達(dá)，鑒定含有特定基因或編碼序列的載體。在第一種方法中，采用包含與相關(guān)序列同源的序列的探針，通過雜交(例如通過DNA-DNA雜交)檢測載體中特定序列的存在。在第二種方法中，在存在于該載體上編碼這些功能的特定基因引起的某一標(biāo)記基因功能(諸如抗生素抗性、胸苷激酶活性等)存在或缺乏的基礎(chǔ)上，鑒定和篩選該重組載體/宿主系統(tǒng)。在第三種方法中，通過檢測該載體編碼的特定基因產(chǎn)物鑒定載體。這類檢測基于該基因產(chǎn)物的物理性質(zhì)、免疫學(xué)性質(zhì)或功能性質(zhì)。
因此，本發(fā)明也提供一種載體，它如果是DNA，那么包含選自SEQ ID NO2、4、5、6、7、15、16、17和18的一個核苷酸序列，它如果是RNA，那么包含由選自SEQ ID NO2、4、5、6、7、15、16、17和18的一個核苷酸序列編碼的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供產(chǎn)生具有核酶的載體的方法，該載體得自野生型人免疫缺陷病毒，并只能夠在允許所述載體復(fù)制的宿主細(xì)胞中復(fù)制。包含在該載體內(nèi)或由該載體編碼的核酶切割野生型人免疫缺陷病毒的核酸，如果有轉(zhuǎn)錄物的話也切割其轉(zhuǎn)錄物，但不切割該載體本身及其轉(zhuǎn)錄物。該方法包括獲得載體并將一種核酸序列加入該載體中，該載體得自野生型人免疫缺陷病毒，并只能夠在允許所述載體復(fù)制的宿主細(xì)胞中復(fù)制，該序列包含或編碼一種核酶，后者的催化域切割野生型人免疫缺陷病毒的核酸，如果有轉(zhuǎn)錄物的話也切割其轉(zhuǎn)錄物，但不切割該載體本身及其轉(zhuǎn)錄物。在這樣一種方法中，包含或編碼野生型人免疫缺陷病毒U5序列的核苷酸序列可以從該載體上缺失，并且如果該載體是DNA，則用選自SEQ ID NO2、6、7、15、16、17和18的一個核苷酸序列取代，如果該載體是RNA，則用選自SEQ ID NO2、6、7、15、16、17和18的一個核苷酸序列編碼的核苷酸序列取代。該載體最好在允許所述載體復(fù)制1次以上的宿主細(xì)胞中復(fù)制。
本發(fā)明也提供修飾載體的方法。該方法包括獲得載體，并且如果該載體是DNA，將選自SEQ ID NO2、4、5、6、7、15、16、17和18的DNA序列的一個核苷酸序列導(dǎo)入該載體中；如果該載體是RNA，將選自SEQ ID NO2、4、5、6、7、15、16、17和18的一個核苷酸序列編碼的核苷酸序列導(dǎo)入該載體中。
本發(fā)明還提供不用包裝細(xì)胞系繁殖和選擇性包裝條件復(fù)制型載體的方法。該方法包括使該條件復(fù)制型載體與能夠感染另一載體的細(xì)胞接觸，另一載體的類型與該條件復(fù)制型載體相同，它由于復(fù)制能力方面為野生型而不同于條件復(fù)制型載體；隨后使該細(xì)胞與另一載體接觸；然后在有助于繁殖該條件復(fù)制型載體的條件下培養(yǎng)該細(xì)胞。
也提供分離和純化的核酸分子，后者選自DNA分子和RNA分子，這些DNA分子包含選自SEQ ID NO2、6、7、15、16、17和18的一個核苷酸序列，而這些RNA分子包含選自SEQ ID NO2、6、7、15、16、17和18的一個核苷酸序列編碼的一個核苷酸序列。使用方法為了進(jìn)行病毒感染的預(yù)防處理和治療處理，為了易于載體保持以及其它原因，最好將上述載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。因此，本發(fā)明提供包含按照本發(fā)明載體的宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞的分離和/或這類細(xì)胞或在培養(yǎng)中由其得到的細(xì)胞系的保持已經(jīng)成為常規(guī)實驗并且是普通技術(shù)人員精通的實驗。
具體地說，上述載體最好用于病毒感染的預(yù)防處理和治療處理，最好諸如該感染來自野生型病毒，最好是野生型RNA病毒，甚至更優(yōu)選來自野生型逆轉(zhuǎn)錄病毒，最佳是來自野生型HIV。
該方法包括使能夠感染野生型病毒的宿主細(xì)胞與條件復(fù)制型載體接觸，該載體只能夠在允許該載體復(fù)制的宿主細(xì)胞中復(fù)制，該載體的存在、轉(zhuǎn)錄或翻譯抑制病毒野生型毒株在宿主細(xì)胞中的復(fù)制。該載體最好復(fù)制1次以上，并包含至少一個核酸序列，與病毒野生型毒株、最好是與衍生該載體毒株相比，擁有該核酸序列(即存在、轉(zhuǎn)錄或翻譯)賦予宿主細(xì)胞中的該載體選擇性優(yōu)勢。
按照該方法，該核酸序列最好包含一種核苷酸序列，它包含或編碼一種遺傳抗病毒劑，后者不利地影響非所述載體的病毒的復(fù)制和/或表達(dá)。該遺傳抗病毒劑希望選自反義分子、核酶和免疫原。該遺傳抗病毒劑最好是核酶，其催化域最好在3’核苷酸NUH序列處切割(即尤其是GUC序列；SEQ ID NO3)。該核酶可選地至少部分由選自SEQID NO4和SEQ ID NO5的序列編碼。希望該核酶在該病毒野生型毒株或其轉(zhuǎn)錄物區(qū)域中切割，但不在該載體或其轉(zhuǎn)錄物區(qū)域內(nèi)切割。這最好是因為該病毒野生型毒株包含SEQ ID NO1編碼的序列，而該載體如果是DNA，則包含一個選自SEQ ID NO2、6、7、15、16、17和18的核苷酸序列，該載體如果是RNA，則包含選自SEQ ID NO2、6、7、15、16、17和18的一個核苷酸序列編碼的核苷酸序列。
也希望進(jìn)行該方法，其中該載體包含至少一個核酸序列，與感染病毒野生型毒株(它最好是衍生該載體的病毒毒株)的細(xì)胞相比，擁有該核酸序列(即存在、轉(zhuǎn)錄或翻譯)賦予感染該載體的宿主細(xì)胞選擇性優(yōu)勢。在該方面，與相應(yīng)于衍生該載體的病毒的病毒野生型毒株相比，載體包含至少一個賦予感染該病毒的宿主細(xì)胞選擇性優(yōu)勢的核酸序列和至少一個賦予該載體選擇性優(yōu)勢的核酸序列。
因此，最好進(jìn)行這種方法，其中該核酸序列包含一種編碼多種藥物抗性的核苷酸序列?；蛘?，諸如當(dāng)待預(yù)防處理或治療處理的病毒感染為逆轉(zhuǎn)錄病毒時，進(jìn)行這樣一種方法，其中該核酸序列包含突變蛋白酶編碼核苷酸序列和突變逆轉(zhuǎn)錄酶的編碼核苷酸序列。
該方法最好還包括給予宿主細(xì)胞選自細(xì)胞毒性藥物、蛋白酶抑制劑和逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的一種藥劑(即除給予該載體外)。
因此，可以按照上述方法使用載體，不僅用于治療處理病毒感染，而且用于保護(hù)潛在的宿主細(xì)胞免受病毒感染，該方法即預(yù)防處理病毒感染的方法或接種抗目的病毒(諸如RNA病毒，特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒，諸如HIV)疫苗。該方法在宿主細(xì)胞與病毒野生型毒株接觸之前，基本上抑制病毒野生型毒株的復(fù)制。在該方面，該載體可以包含或編碼阻斷超感染野生型病毒的蛋白質(zhì)。該方法包括使該宿主細(xì)胞與上述條件復(fù)制型載體和“輔助表達(dá)載體”(即促進(jìn)該“載體”在未受感染宿主中復(fù)制的病毒基因組)接觸。該條件復(fù)制型載體包括選擇性包裝和/或繁殖的優(yōu)勢。此外，該載體例如可以含有提高細(xì)胞存活率、促進(jìn)病毒生產(chǎn)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)蛋白生產(chǎn)和/或促進(jìn)免疫功能和/或?qū)虻男蛄?。該“輔助表達(dá)載體”構(gòu)建物是對該“載體”不能復(fù)制的能力進(jìn)行互補(bǔ)的任何表達(dá)載體。這類輔助表達(dá)載體是常用的，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員易于構(gòu)建的。該輔助表達(dá)載體可以或者象該載體一樣包裝入病毒粒子，或者不需要包裝而進(jìn)行表達(dá)。由于該“載體”具有選擇性包括和/或繁殖的優(yōu)勢，因此該系統(tǒng)提供一種安全的方法，以達(dá)到病毒的高度復(fù)制，而沒有減毒活病毒可以潛在引起的可能的致病作用。此外，該載體可以與非特異性佐劑混合，以提高免疫原性。這類佐劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括(但不限于)弗氏完全佐劑或不完全佐劑、由細(xì)菌和分支桿菌細(xì)胞壁組分組成的乳液等。
當(dāng)按照上述方法作為預(yù)防處理病毒感染使用載體時，該載體可以編碼一種不由野生型病毒編碼的蛋白抗原，諸如突變病毒蛋白或非病毒蛋白。因此，該載體編碼的抗原可以例如來自細(xì)菌或來自癌細(xì)胞。此外，該“載體”也可以編碼MHC基因，以適當(dāng)?shù)貙⒖乖瓕?dǎo)向宿主免疫系統(tǒng)。因此，這類載體可以用來促進(jìn)對多樣化系列的潛在病原體和/在異常細(xì)胞中選擇性表達(dá)的內(nèi)源蛋白(例如腫瘤特異性抗原)的持久性的免疫應(yīng)答。
此外，可以通過加入或省去允許細(xì)胞特異性載體復(fù)制和傳播的特定遺傳元件/因子(或者在該載體中，或者在輔助病毒表達(dá)構(gòu)建物中)，將該“輔助病毒”(本文也稱為“助手”)表達(dá)載體工程改造，以只在特定細(xì)胞類型(例如干細(xì)胞、專門抗原提呈細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞)中表達(dá)。因此，該載體仍通過與輔助病毒構(gòu)建物互補(bǔ)進(jìn)行傳播，但該傳播是細(xì)胞特異性的，取決于某一遺傳元件/因子是否加入該載體或輔助病毒表達(dá)構(gòu)建物或省去。這可以單獨使用，或與上述其它策略結(jié)合使用。
例如，可以設(shè)計條件復(fù)制型HIV載體以在巨噬細(xì)胞而不是T細(xì)胞中特異性復(fù)制?？赡芙M成Tat缺陷型HIV的該載體(該載體編碼另一些HIV蛋白，但它們因為缺乏Tat轉(zhuǎn)錄反式激活蛋白而不表達(dá))，可以編碼切割野生型HIV、但不切割條件復(fù)制型HIV RNA的核酶。該載體的輔助表達(dá)載體可以編碼巨噬細(xì)胞特異性啟動子表達(dá)的tat基因。因此，crHIV只能夠在巨噬細(xì)胞中有條件復(fù)制，而不能在T細(xì)胞或其它細(xì)胞類型中復(fù)制。
或者，tat基因可以操作性地與腫瘤特異性啟動子連接；因此，該crHIV然后只在腫瘤CD4細(xì)胞中復(fù)制，而不在正常CD4細(xì)胞中復(fù)制。遺傳元件/因子也可以是該載體啟動子序列的修飾物，使得它與該“輔助病毒”表達(dá)構(gòu)建物一致，只在特定細(xì)胞類型中表達(dá)，而不在其它細(xì)胞類型中表達(dá)。
在另一實施方案中，可以修飾該輔助表達(dá)構(gòu)建物或該載體構(gòu)建物的囊膜蛋白(如果工程改造這類構(gòu)建物使其含有囊膜蛋白)，使得該載體-病毒粒子特異性地感染某些細(xì)胞類型(例如腫瘤細(xì)胞)，而不能感染其它細(xì)胞類型(例如正常細(xì)胞)。在再一實施方案中，缺乏一個或幾個關(guān)鍵復(fù)制因子的腺病毒可以通過使用一種輔助構(gòu)建物進(jìn)行互補(bǔ)，該輔助構(gòu)建物提供連接腫瘤特異性啟動子的這類因子。因此，互補(bǔ)腺病毒復(fù)制的因子只能在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，由此允許病毒在腫瘤細(xì)胞中復(fù)制(表達(dá)細(xì)胞殺傷所需的蛋白)，但不在正常細(xì)胞中復(fù)制。
因此，本發(fā)明也提供治療癌癥、特別是治療T細(xì)胞白血病的方法。按照本發(fā)明“治療癌癥”包括給予宿主一種進(jìn)一步修飾的本文提出的載體，以用于實現(xiàn)治療反應(yīng)?？梢酝ㄟ^監(jiān)測腫瘤生長的減弱和/或腫瘤消退，評價這樣一種反應(yīng)。“腫瘤生長”包括腫瘤大小的增加和/或腫瘤數(shù)的增加?！澳[瘤消退”包括腫瘤質(zhì)量的減小。
按照本發(fā)明的“癌”包括特征為異常細(xì)胞增殖和缺乏接觸抑制的癌，它可以通過腫瘤形成證實。該術(shù)語包括局限在腫瘤中的癌以及不局限在腫瘤中的癌，例如由一個腫瘤通過侵入局部擴(kuò)張或通過轉(zhuǎn)移全身性擴(kuò)張的那些癌細(xì)胞。理論上，任何類型的癌都可以作為按照本發(fā)明進(jìn)行治療的靶。然而，該癌最好是由病毒引起的。
最后，上述載體可以直接用于體內(nèi)基因治療。目前的基因治療策略是失敗的，因為它們不介導(dǎo)基因傳遞到大部分細(xì)胞中；只感染一定百分比的細(xì)胞。在關(guān)鍵是對整個腫瘤群體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗腫瘤策略中，這是尤其重要的。通過與“助手”一起加入該“載體”，即刻轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞將產(chǎn)生可以感染相鄰細(xì)胞的病毒顆粒，并使得達(dá)到高的、可能完全轉(zhuǎn)導(dǎo)的效率。在本發(fā)明的一個實施方案中，人逆轉(zhuǎn)錄病毒(可能是HIV或反轉(zhuǎn)座子元件)可以與“助手”構(gòu)建物一起傳遞到組織中(或體外細(xì)胞中)。即刻含有該載體和助手的細(xì)胞將產(chǎn)生病毒，并將該載體有條件地包裝為病毒粒子。這些病毒粒子將能夠介導(dǎo)高效率的相鄰細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)(由于細(xì)胞-細(xì)胞接觸是轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的最有效方法)。即刻轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞可能死亡或不死亡，取決于該載體/助手組合是否導(dǎo)致溶胞感染。在反轉(zhuǎn)座子的情況下，由于正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞可能含有包衣殼為病毒粒子所需蛋白/因子，因此該助手可能不必含有結(jié)構(gòu)蛋白。這樣，該助手可能僅僅是(但不限于)激活反轉(zhuǎn)座子包衣殼所需因子轉(zhuǎn)錄的反式激活蛋白。在HIV的情況下，將HIV基因組包衣殼為感染/轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的子代病毒粒子可能(但不必)需要其它因子。
上述載體也可以用于反生物戰(zhàn)和反化學(xué)戰(zhàn)策略中。例如條件復(fù)制型載體可以傳遞到新近感染高度致病的病毒或細(xì)菌或化學(xué)試劑(例如毒素)的個體中。如前所述，載體可能干擾該致病病毒的復(fù)制。然而，該條件復(fù)制型載體也可以與輔助表達(dá)載體(“助手”)一起用于抗菌或抗化學(xué)藥品策略中。
例如，條件復(fù)制型載體在“助手”允許其表達(dá)和繁殖后，可以分泌抗菌或抗毒素抗體。該“助手”可以(但不必)驅(qū)動關(guān)閉被細(xì)菌、細(xì)胞因子(對細(xì)菌感染應(yīng)答)、抗生素(如同四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子系統(tǒng)一樣(Paulus等，J.Virol.，70，62-67(1996))或化學(xué)藥品(例如毒素本身)激活時允許其表達(dá)的誘導(dǎo)型啟動子。因此，該條件復(fù)制型載體不僅可以在該“助手”的幫助下，對遭遇的病原體或毒素(該助手激活的結(jié)果)應(yīng)答，選擇性進(jìn)行繁殖，而且分泌抗病原體或抗毒素抗體，抑制腫瘤抗原、病原體或化學(xué)藥品(例如毒素)的致病作用。因此，可以將或者轉(zhuǎn)錄為mRNA和/或者轉(zhuǎn)錄為蛋白的任何蛋白、因子或遺傳元件，與“助手”一起插入條件復(fù)制型載體中，以抑制致病反應(yīng)，“助手”促進(jìn)其選擇性繁殖和表達(dá)(選擇性是因為該助手的產(chǎn)物是條件型表達(dá)的(例如(但不限于)(a)誘導(dǎo)型啟動子系統(tǒng)-腫瘤細(xì)胞中的因子激活助手因子的產(chǎn)生、表達(dá)助手因子的毒素應(yīng)答序列或細(xì)胞因子應(yīng)答啟動子誘導(dǎo)助手因子的產(chǎn)生，(b)助手RNA/蛋白/因子在某些細(xì)胞中是選擇性穩(wěn)定化的，而在其它細(xì)胞中不是選擇性穩(wěn)定化的)，以及(c)影響輔助病毒蛋白生產(chǎn)、護(hù)送、導(dǎo)向、結(jié)構(gòu)或其它生物功能的第三方基因的間接誘導(dǎo))。這類策略可以用于轉(zhuǎn)基因植物和動物中，以保護(hù)它們免受病原體的的侵害。同樣，這類策略可以用于轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)中，以生產(chǎn)有價值的異源蛋白/因子。
按照本發(fā)明方法的另一實施方案中，可以開發(fā)出細(xì)胞系以篩選藥物/因子，以測定例如該蛋白/因子的哪一部分對特定功能是重要的。可以產(chǎn)生一個載體，以在給定細(xì)胞系中表達(dá)誘變的目的蛋白。然而，通過例如插入沉默點突變，使編碼該誘變蛋白的RNA對核酶產(chǎn)生抗性。然而，在該細(xì)胞系中抑制野生型蛋白的表達(dá)。也可以構(gòu)建表達(dá)目的蛋白的核酶的載體，以表達(dá)突變測試蛋白。當(dāng)將該載體轉(zhuǎn)導(dǎo)到細(xì)胞中時，大多數(shù)編碼正常蛋白的天然RNA被切割，而表達(dá)該突變測試蛋白。該方法可以與新近開發(fā)的傳遞和篩選技術(shù)一起使用，作為測定給定蛋白如何起作用和給定因子/藥物如何與該蛋白相互作用的快速高效技術(shù)。
本發(fā)明方法和載體在體外也有許多用途。例如，載體可以用來確定病毒復(fù)制和核酶功能的某些細(xì)微差異。同樣，含核酶的載體可以用作診斷工具，例如以評價病變細(xì)胞存在的突變或檢測遺傳漂變。關(guān)于本發(fā)明用途的上述討論決不是全面性的。本發(fā)明的益處采用crHIV策略進(jìn)行遺傳治療處理AIDS和其它病毒的優(yōu)點相當(dāng)多。例如，解決了將該載體導(dǎo)向感染HIV的細(xì)胞的問題。在體內(nèi)將crHIV轉(zhuǎn)染入受感染CD4+細(xì)胞后，該crHIV采用內(nèi)源感染性HIV的囊膜蛋白包裝為子代病毒粒子。因此，該crHIV RNA沿子代病毒粒子內(nèi)和可被特定HIV毒株正常感染的受感染細(xì)胞類型內(nèi)標(biāo)記，產(chǎn)生非致病病毒粒子。這包括難以導(dǎo)向的細(xì)胞，諸如腦的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，后者為中樞神經(jīng)系統(tǒng)HIV感染的主要貯主。由于crHIV載體不編碼病毒蛋白，因此可能幾乎沒有與感染未受感染CD4+細(xì)胞的crHIV有關(guān)的毒性。此外，crHIV載體與野生型HIV競爭的結(jié)果，導(dǎo)致產(chǎn)生非致病顆粒，后者導(dǎo)致病毒荷載降低。由于crHIV顆粒也可以全身性傳播(即與傳染性HIV一樣)，因此降低致病HIV-1的荷載不僅可以增加受感染個體的存活時間，而且可以降低向未受感染個體傳染的速率。血液中致病HIV-1荷載的降低，在感染HIV的受孕個體中可能特別重要，因為crHIV的產(chǎn)生也可以減少HIV-1由受感染母親傳遞到子宮中的胎兒。
可以用于將crHIV載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的質(zhì)粒DNA/脂類混合物應(yīng)該是穩(wěn)定的，并且生產(chǎn)便宜，避開昂貴的體外策略。當(dāng)然，因為本發(fā)明方法需要時也可以用于體外基因傳遞，因此它本質(zhì)上是靈活的。無論如何，脂質(zhì)體介導(dǎo)方法的可用性打開了治療一般群體(用目前基因治療策略行不通的某些群體)的可能性。也可以工程改造crHIV載體，以含有幾種核酶，后者可以制成導(dǎo)向HIV基因組的不同靶。這就降低了傳染性HIV可能突變并逃避抗HIV核酶作用的可能性。此外，具有條件復(fù)制能力的病毒策略可以用來治療其它病毒感染，尤其是病毒周轉(zhuǎn)高的那些病毒感染。
crHIV特別有用的特征是，它們可以用來轉(zhuǎn)錄后表達(dá)遺傳抗病毒劑，例如核酶。因此，用crHIV載體感染未受感染細(xì)胞產(chǎn)生的毒性低，因為在缺乏Tat蛋白時，幾乎沒有由HIV長末端重復(fù)(LTR)啟動子發(fā)生的表達(dá)。只在通過用野生型HIV互補(bǔ)提供Tat蛋白時，crHIV表達(dá)及其隨后的抗病毒活性的水平高。因此，設(shè)計的crHIV載體不保護(hù)細(xì)胞免受HIV感染，而是通過選擇性積累非致病crHIV顆粒，減少完整野生型HIV病毒的含量。
盡管本發(fā)明的操作和功能不試圖結(jié)合特定理論，但如在以下實施例中所證實的，相信因為以下兩個有用的性質(zhì)，核酶可以用來向crHIV基因組提供選擇性優(yōu)勢(1)它們的特異性程度高，以及(2)它們具有相當(dāng)?shù)男?，取決于它們與靶RNA共定位的能力(Cech，Science，236，1532-1539(1987))。通過核酶與含有XUY位點的互補(bǔ)靶序列特異性的雜交，提供核酶的特異性。因為僅當(dāng)核酶與靶RNA有效地共定位時，它們高效地切割靶RNA，因此核酶是相當(dāng)有效的。在混合HIV/crHIV感染中，由于HIV RNA基因組在包裝到子代病毒粒子中之前二聚化，因此必定發(fā)生含核酶的crHIV RNA與野生型HIV RNA的共定位。病毒蛋白生產(chǎn)所需的野生型HIV RNA非基因組物質(zhì)的切割效率可以低于基因組野生型HIV RNA的切割效率，因為非基因組HIV RNA不二聚化。在本文所述實驗中發(fā)現(xiàn)，賦予crHIV的選擇性優(yōu)勢是由于crHIV選擇性包裝到病毒顆粒中引起的。這些結(jié)果表明，胞內(nèi)最有效的切割發(fā)生在二聚化期間，導(dǎo)致野生型HIV被宿主核酸酶選擇性地破壞。這允許crHIV RNA優(yōu)先包裝到病毒顆粒中。
用于HIV治療的crHIV載體應(yīng)用不僅可以涉及crHIV的基因組篩選，而且可以涉及產(chǎn)生crHIV顆粒的細(xì)胞的細(xì)胞篩選。否則，產(chǎn)生野生型HIV的細(xì)胞以高于產(chǎn)生crHIV顆粒的細(xì)胞的選擇性優(yōu)勢產(chǎn)生野生型HIV顆粒，并且快速地占優(yōu)勢。通過將賦予表達(dá)crHIV的細(xì)胞(在有藥物的情況下)高于表達(dá)野生型HIV細(xì)胞存活優(yōu)勢的一個基因插入crHIV基因組中(例如多種藥物抗性基因)，可以賦予表達(dá)crHIV細(xì)胞的選擇性優(yōu)勢。在這些條件下，表達(dá)野生型HIV的細(xì)胞逐漸死亡，但仍產(chǎn)生一些野生型HIV，同時選擇性地產(chǎn)生crHIV的表達(dá)crHIV的細(xì)胞存活。含crHIV的細(xì)胞感染殘余的野生型HIV，會導(dǎo)致進(jìn)一步產(chǎn)生含crHIV的病毒顆粒。因此，隨著感染crHIV基因組的的CD4+細(xì)胞的累積，可能產(chǎn)生病毒基因組漂變，由此宿主中的病毒平衡，由致病野生型HIV改變?yōu)榉侵虏rHIV基因組。一旦HIV基因組的平衡選擇性地由野生型HIV漂變?yōu)閏rHIV，這樣一種策略可以導(dǎo)致野生型HIV的清除。由于crHIV只能在野生型HIV助手基因組的存在下復(fù)制，因此病毒復(fù)制實際上停止。因此，在這類突變限制條件下，可能工程改造crHIV載體，該載體不僅降低HIV病毒的荷載，而且從感染HIV的宿主中清除該病毒。
給藥方法按照本發(fā)明，按前述方法將載體導(dǎo)入需要基因治療病毒感染的宿主細(xì)胞中。導(dǎo)入方法包括使能夠感染病毒的宿主與按照本發(fā)明的載體接觸。這種接觸最好包括將該載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的任何方法；該方法不取決于任何導(dǎo)入方法，也不是如此解釋。導(dǎo)入方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，在本文中也進(jìn)行了例舉。
因此，可以例如或者體外(例如在基因治療的體外類型方法中)或者體內(nèi)進(jìn)行導(dǎo)入，這包括采用電穿孔、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合或三親本交配、轉(zhuǎn)染、感染、與陽離子脂類膜融合、用涂有DNA的微彈高速轟擊、與磷酸鈣-DNA沉淀物一起保溫、直接微注射到單個細(xì)胞中等。也可利用其它方法，它們是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。
然而，最好通過陽離子脂類(例如脂質(zhì)體)導(dǎo)入該載體或核酶。這類脂質(zhì)體是市售的(例如Life Technologies，Gibco BRL，Gaithersburg，MD供應(yīng)的Lipofectin、LipofectamineTM等)。此外，體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力高和/或毒性較低的脂質(zhì)體(例如在PCT專利申請WO 95/21259中所綜述的)可以用于本發(fā)明。對于脂質(zhì)體給藥，可以遵循在PCT專利申請WO93/23569中鑒定的建議。一般來說，關(guān)于這種給藥，該制劑于37℃，在8小時內(nèi)被大多數(shù)淋巴細(xì)胞吸收，靜脈注射后1小時，在脾中檢測到50％以上的注射劑量。同樣，其它傳遞載體包括水凝膠和控釋聚合物。
該載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞的形式可以改變，部分取決于該載體是體外導(dǎo)入還是體內(nèi)導(dǎo)入。例如，該核酸可以是閉環(huán)的、帶切口的或是線性化的，取決于該載體是否在基因組外保持(即作為自主復(fù)制載體)、作為前病毒或前噬菌體整合、瞬時轉(zhuǎn)染、利用復(fù)制缺陷型或條件復(fù)制型病毒瞬時感染，或是通過雙或單交叉重組事件穩(wěn)定導(dǎo)入該宿主基因組中。
在本發(fā)明的載體在導(dǎo)入宿主之前，可以配制為各種組合物，以用于治療處理和預(yù)防處理方法中。具體地說，該載體可以通過與合適的藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑混合，制成藥物組合物，并且可以進(jìn)行配制，以適用于或者人類或者獸醫(yī)應(yīng)用。
因此，用于本發(fā)明方法的組合物可以包括一種或多種上述載體，最好與藥學(xué)上可接受的載體混合。藥學(xué)上可接受的載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，合適的給藥方法也是眾所周知的。該載體的選擇將部分取決于特定的載體以及用來該組合物給藥的特定方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員也理解，可以利用組合物給藥的各種途徑，盡管可以使用一種以上的途徑給藥，但可以提供一種比其它途徑更直接、更有效反應(yīng)的特定途徑。因此，有種類繁多的本發(fā)明組合物的合適制劑。
單獨或與其它抗病毒化合物混合的本發(fā)明載體組成的組合物可以制成適于胃腸外給藥、特別是腹膜注射的制劑。這樣一種制劑可以包括含水和非水等滲無菌注射液，該注射液可以含有抗氧劑、緩沖液、抑菌劑和提供制劑與受體血液等滲的溶質(zhì)和含水和非水無菌懸液，后者可以包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑。制劑可以以單位劑量存在或多劑量封閉容器(諸如安瓿和西林瓶)存在，可以在冷凍干燥(凍干)條件下貯存，使用前只需要加入無菌液體載體(例如水)即可立刻注射?？梢杂杀疚乃龅臒o菌粉劑、顆粒劑和片劑制備臨時注射液和懸液。
適用于口服的制劑可以包括液體溶液劑(諸如溶于稀釋劑的有效量的該化合物，稀釋劑諸如水、鹽水或果汁)；膠囊劑、小藥囊或片劑，每種制劑都含有預(yù)定量的作為固體或顆粒的活性組分；水性液體中的溶液或懸液；和水包油型乳液或油包水型乳液。片劑形式可以包括一種或多種乳糖、甘露醇、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、微晶纖維素、阿拉伯膠、明膠、膠體二氧化硅、croscarmellose sodium、滑石、硬脂酸鎂、硬脂酸和其它賦形劑、色料、稀釋劑、緩沖劑、潤濕劑、防腐劑、矯味劑和藥學(xué)上相容的載體。
也可以制備適用于通過吸入給藥的氣溶膠制劑?？梢詫馊苣z制劑置于加壓可接受的拋射劑(諸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣等)中。
同樣，適于口服的制劑可以包括在調(diào)味劑中可以包含活性組分的糖錠形式，調(diào)味劑通常為蔗糖和阿拉伯膠和西黃蓍膠；在惰性堿(諸如明膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯膠)中包含該活性組分的錠劑；和在合適液體載體中包含該活性組分的漱口藥；以及乳膏、乳液、凝膠等，它們除含有該活性組分外，還含諸如本領(lǐng)域已知的載體。
適用于局部用藥的制劑可以為乳膏、軟膏或洗劑形式。
用于直腸給藥的制劑可以以具有合適堿、包含例如可可油或水楊酸鹽的栓劑出現(xiàn)。適用于陰道給藥的制劑可以以陰道栓、塞子、乳膏、凝膠、糊劑、泡沫劑或噴霧配方出現(xiàn)，它們除含有該活性組分外，還含有本領(lǐng)域已知的這類合適載體。同樣，該活性組分可以與潤滑劑混合，作為避孕套上的涂層。
在本發(fā)明正文中，給予動物(特別是人類)的劑量應(yīng)該足以在合理的時間框內(nèi)，實現(xiàn)受感染個體的治療反應(yīng)。由用于治療的特定載體的效力、病情的嚴(yán)重性以及受感染個體的體重和年齡決定該劑量。由可能伴隨所用特定載體的使用產(chǎn)生的任何不利副作用的存在決定該劑量的大小。通常最好是無論何時都可能將不利副作用保持在最小限度。
該劑量可以為單位劑量形式，諸如片劑或膠囊劑。本文所用的術(shù)語“單位劑量形式”是指物理上分離的適用作人和動物對象的單元劑量單位，每個單位含有預(yù)定量的單獨的載體或與其它抗病毒劑混合的載體，以與藥學(xué)上可接受的稀釋劑、載體或溶媒一起足以產(chǎn)生所需作用的量計算。本發(fā)明單位劑量形式的規(guī)格取決于所用的一種或多種特定化合物和待達(dá)到的效果以及與宿主中每種化合物有關(guān)的藥效學(xué)。給藥劑量應(yīng)該是“抗病毒有效量”或在各個病人中達(dá)到“有效水平”的必需量。
由于“有效水平”用作劑量的推薦終點，因此實際劑量和時間表可以改變，取決于藥物動力學(xué)、藥物分布和代謝的個體間差異。該“有效水平”可以定義為例如該病人中相當(dāng)于一種或多種按照本發(fā)明載體濃度的所需血液水平或組織水平，該有效水平在預(yù)測化學(xué)化合物臨床抗病毒活性的測定中抑制諸如HIV之類的病毒。當(dāng)本發(fā)明組合物與疊氮胸苷或其它已知抗病毒化合物或其組合物混合使用時，本發(fā)明化合物的“有效水平”也可以改變。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以容易地確定待用組合物準(zhǔn)確配方的合適給藥劑量、給藥時間表和給藥方法，以便在單個病人中達(dá)到所需“有效水平”。本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以通過合適的病人樣品(例如血液和/或組織)的直接(例如分析化學(xué)分析)或間接(例如病毒感染的代替指標(biāo)，諸如用于治療AIDS或AIDS樣疾病的p24或逆轉(zhuǎn)錄酶)分析，容易地確定和使用本發(fā)明化合物“有效水平”的合適指標(biāo)。
另外，關(guān)于確定病人中治療AIDS或AIDS樣疾病的有效水平，特別是可利用合適的動物模型，并已經(jīng)廣泛地應(yīng)用了用于評價各種基因治療方案對HIV的體內(nèi)效力的合適動物模式(Saver等(1993b)，見上述)。這些模型包括小鼠、猴子和貓。即使這些動物不是天然對HIV疾病敏感，但用人外周血單核細(xì)胞(PBMC)、淋巴結(jié)或胎肝/胸腺組織重建的組織嵌合小鼠模型(例如SCID、bg/nu/xid、切除骨髓的BALB/c)可以感染HIV，并將其用作HIV發(fā)病機(jī)理和基因治療的模型。同樣，可以使用猿猴免疫缺陷病毒(SIV)/猴模型，貓免疫缺陷病毒(FIV)/貓模型也可以使用。
一般來說，足以達(dá)到的給予核酶(或載體)組織濃度的載體量最好大約為50-300mg/kg體重/天，尤其是大約100-200mg/kg體重/天。在某些應(yīng)用中，例如局部應(yīng)用、眼部應(yīng)用或陰道應(yīng)用，最好是每天多個劑量。此外，劑量的數(shù)量取決于傳遞方法和使用的特定載體。
在某些病毒感染個體的治療中，可能最好利用“大劑量”制度，其中給予大劑量的載體，給與允許該化合物起作用的時間，然后將合適的試劑給予該個體，以滅活活性化合物。在本發(fā)明方法中，該治療(即該載體與待治療病毒競爭復(fù)制)必定是受限制的。換句話說，當(dāng)例如HIV的水平下降時，依賴于HIV產(chǎn)生病毒粒子的載體水平也將下降。
藥物組合物當(dāng)用于治療處理AIDS時，可以結(jié)合按照本發(fā)明的載體含有其它藥物。這些其它藥物可以以其傳統(tǒng)方式使用(即作為治療HIV感染的藥劑)，以及更具體地說，以體內(nèi)選擇crHIV病毒的方法使用。本文所述的這種選擇將促進(jìn)條件復(fù)制型HIV的傳播，并允許條件復(fù)制型HIV更有效地與野生型HIV競爭，這必然限制野生型HIV的致病性。具體地說，預(yù)期使用一種抗逆轉(zhuǎn)錄病毒劑，諸如最好是疊氮胸苷。除前述那些藥物外可以使用的這些其它藥物的其它代表實例包括抗病毒化合物、免疫調(diào)節(jié)劑、免疫刺激物、抗生素和可以用來治療AIDS的其它藥劑和治療制度(包括作為選擇性醫(yī)藥認(rèn)識的那些藥劑和治療制度)。抗病毒化合物包括(但不限于)ddI、ddC、gancyclovir、氟化二脫氧核苷酸、非核苷酸類似化合物，諸如nevirapine(Shih等，PANS，88，9878-9882(1991))；TIBO衍生物，諸如R82913(White等，Antiviral Research，16，257-266(1991))和BI-RJ-70(Shih等，Am.J.Med.，90(增補(bǔ)本4A)，8S-17S(1991))。免疫調(diào)節(jié)劑和免疫刺激物包括(但不限于)各種白介素、CD4、細(xì)胞因子、抗體制劑、輸血制品和細(xì)胞轉(zhuǎn)輸?？股匕?但不限于)抗真菌劑、抗細(xì)菌劑和抗卡氏肺囊蟲劑。
將抑制病毒化合物與其它抗逆轉(zhuǎn)錄病毒劑、特別是已知的RT抑制劑(諸如ddC、疊氮胸苷、ddI、ddA)或作用于其它HIV蛋白的其它抑制劑(諸如抗TAT劑)一起給藥，一般抑制病毒生活周期的大多數(shù)或全部復(fù)制階段。ddC和疊氮胸苷用于AIDS或ARC病人的劑量已經(jīng)是公布的。ddC的病毒抑制范圍一般為0.05-1.0μM。在大多數(shù)病人中，大約0.005-0.25mg/kg體重的范圍是抑制病毒的?？诜膭┝糠秶詫捫?，例如為0.001-0.25mg/kg，以2小時、4小時、6小時、8小時和12小時等間隔給予一個或多個劑量。最好每8小時給予0.01mg/kg體重的ddC。當(dāng)在混合療法中給予時，例如其它抗病毒劑可以在給予按照本發(fā)明載體的同時給藥，或可以根據(jù)需要錯開服藥時間。該載體也可以混入組合物中。每種藥物混合使用時的劑量可以低于分別單獨使用時的劑量。
實施例在以下實施例的正文中進(jìn)一步描述本發(fā)明化合物和方法。這些實施例用來進(jìn)一步說明本發(fā)明，而不是限制本發(fā)明的范圍。實施例1該實施例描述按照本發(fā)明的有條件復(fù)制能力的載體的構(gòu)建。具體地說，該實施例描述基于HIV的條件復(fù)制型載體(即crHIV載體)的構(gòu)建。
HIV-1發(fā)病機(jī)理的一個最突出的方面是產(chǎn)生該病毒的遺傳變異體。體內(nèi)迅速產(chǎn)生HIV變異體表明，可以認(rèn)為該病毒在達(dá)爾文氏遺傳模式化的框架內(nèi)(參見例如Coffin，Curr.Top.Microbiol.Immuniol.，176，143-164(1992)和Coffin，Science，267，483-489(1995))。這些變異體是由HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶分子不精確造成的，這在由病毒基因組RNA新轉(zhuǎn)錄的前病毒中產(chǎn)生突變。因此，在無顯著瓶頸和許多復(fù)制周期的體內(nèi)條件下，發(fā)生相當(dāng)程度的遺傳變異，產(chǎn)生許多病毒變異體。另外，由于在這類非限制條件下野生型HIV具有最高選擇優(yōu)勢，因此野生型HIV仍占優(yōu)勢。然而，在抑制劑(例如疊氮胸苷)存在下，將選擇被賦予高于野生型毒株選擇優(yōu)勢的病毒變異體，它隨后占優(yōu)勢(Coffin(1992)和(1995)，見上述)?；谶@一點，本發(fā)明提供一種條件復(fù)制型病毒載體策略，它提供選擇優(yōu)勢高于致病野生型HIV-1的非致病HIV-1基因組。
這些非致病條件復(fù)制型HIV(crHIV)載體是缺陷型HIV，它只在感染野生型HIV的細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和包裝。crHIV基因組與致病野生型HIV病毒競爭，并降低致病野生型HIV的病毒荷載。降低受感染宿主中野生型HIV病毒荷載的作用應(yīng)該導(dǎo)致壽命的延長。它也應(yīng)該降低受感染宿主將野生型HIV傳染未受感染個體的能力。為了使crHIV成功地與野生型HIV-1競爭，兩個因素似乎是重要的(1)crHIV基因組的選擇優(yōu)勢高于野生型HIV基因組，以及(2)表達(dá)crHIV的細(xì)胞的選擇優(yōu)勢高于表達(dá)野生型HIV的細(xì)胞(即與表達(dá)野生型HIV的細(xì)胞相比，表達(dá)crHIV細(xì)胞產(chǎn)生crHIV病毒粒子的選擇性優(yōu)勢)。
由于crHIV載體含有RNA表達(dá)、二聚化和包裝所需的序列，但不表達(dá)功能性(即野生型)HIV-1蛋白，因此crHIV載體有條件地復(fù)制。通過插入在野生型HIV基因組U5區(qū)內(nèi)切割、但不切割crHIV U5 RNA的核酶盒，賦予crHIV載體選擇性優(yōu)勢。
因為crHIV RNA的U5區(qū)已經(jīng)通過保守堿基置換(存在于其它HIV毒株的堿基置換)而進(jìn)行修飾，以防止核酶有效地結(jié)合并切割這些位點，因此存在于載體的核酶不切割該crHIV RNA。此外，因為crHIV不編碼相信引起CD4+細(xì)胞死亡的蛋白，因此crHIV為非致病的。當(dāng)感染HIV的細(xì)胞(已經(jīng)轉(zhuǎn)染該crHIV載體)被激活時，這些細(xì)胞變得能夠互補(bǔ)crHIV基因組的缺陷，導(dǎo)致產(chǎn)生crHIV子代病毒粒子。
一般來說，由全長傳染性HIV克隆pNL4-3構(gòu)建crHIV基因組(Adachi等，J.Virol.，59，284-291(1986))。采用普通技術(shù)人員熟知的并已經(jīng)在本領(lǐng)域中描述的方法，例如Maniatis等，分子克隆實驗手冊(Molecular CloingA Laboratory Manual)，第2版，(冷泉港實驗室，NY(1982))，進(jìn)行所有克隆反應(yīng)和DNA、RNA和蛋白操作。用于這些反應(yīng)的酶和試劑得自市場供應(yīng)商(例如New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA；Clontech，Palo Alto，CA；和Boehringer Mannheim，Inc.，Indianapolis，IN)并按照生產(chǎn)商的建議使用。此外，采用通常已知技術(shù)和先前已經(jīng)描述的技術(shù)(例如Dropulic等(1992)，見上述；和Dropulic等(1993)，見上述)，進(jìn)行載體保持和繁殖。
用酶Pst I(它在gag中大約在轉(zhuǎn)錄起始起+1000的位置酶切)和XhoI(它在nef中大約在轉(zhuǎn)錄起始起+8400的位置酶切)酶切pNL4-3，并插入含有便利限制位點的多接頭。將含有rev應(yīng)答元件(RRE)的0.86kbBgl II至Bam HI的片段克隆到多接頭中存在的Bam HI位點。這些操作導(dǎo)致HIV野生型基因組從gag編碼區(qū)內(nèi)至U3編碼區(qū)內(nèi)的缺失(即由此也缺失nef基因)。盡管該載體能夠產(chǎn)生縮短的gag轉(zhuǎn)錄物，但該載體不產(chǎn)生全長的功能Gag蛋白。然而，由于按照本發(fā)明野生型Gag功能是不必要的，因此gag序列可以突變，以防止翻譯Gag蛋白。
將本文所述的含有單個或多個核酶的核酶盒插入該Bam HI位點下游的Sal I位點中。為了完成這一點，合成編碼核酶序列的互補(bǔ)脫氧寡核苷酸，將其退火，然后克隆到該Sal I位點。用來構(gòu)建crHIV載體的核酶為錘頭型核酶。這些核酶含有由22個堿基對組成的催化域和每個由9個堿基對組成的雜交域。這些核酶或者導(dǎo)向U5 RNA序列的+115位點，或者導(dǎo)向其+133位點(即相當(dāng)于轉(zhuǎn)錄起始下游的堿基對數(shù))。導(dǎo)向+115位點和+113位點的核酶的雜交域和催化域(加下線)如下CACACAACACTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACGGGCACA(“+115核酶”)[SEQ ID NO4]ATCTCTAGTCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACCAGAGTC(“+113核酶”)[SEQ ID NO5]該核酶盒由或者單、雙或者三核酶串聯(lián)組成。含有或者單核酶(即“crHIV-1.1”載體，圖1B)或三核酶(即“crHIV-1.1載體，圖1E)的載體導(dǎo)向該U5 HIV RNA的同一位點，即+115位點。含有雙核酶的載體或者導(dǎo)向同一位點即+115位點(即“crHIV-1.11”載體，圖1C)，或者導(dǎo)向該U5 HIV RNA+115位點和+133位點的不同位點；crHIV-1.12(即“crHIV-1.12”載體，圖1D)。本文在種屬上將這些載體稱為“crHIV”載體。
為了完成這些載體的構(gòu)建，通過突變錘頭型核酶在該crHIV基因組的U5區(qū)內(nèi)的一個識別位點，賦予crHIV載體對核酶酶切的抗性(即以它們作為RNA的顯示物)。為了完成這一點，含有圖2所述堿基置換(SEQ ID NO2]的雙鏈寡核苷酸(即AAGCTTGCCTTGAGTGCTCAAAGTAGTGTGTGCCCACCTGTTGTGTGACTCTGGCAGCTAGAGATCCCACAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCC[SEQ ID NO14]被用來將修飾位點導(dǎo)入該載體。具體地說，將堿基置換工程改造到該核酶在115堿基對和133堿基對處的雜交和酶切位點中。正如圖所示，特別是將這些突變導(dǎo)入113、114、132、134和142堿基對處。可以修飾這些位點，以包含任何突變(即GTGTGCCCNNCTGTTGTGTGACTCTGGNANCTAGAGANC，其中N可以是任何核苷酸[SEQ ID NO15]。然而，最好突變這些序列，使得在+113位點例如G置換為A(即使得該序列包含GTGTGCCCATCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATC[SEQ ID NO16]，在+114位點U(即根據(jù)該DNA序列為T)置換為C[SEQ ID NO6]，在+132位點U(即根據(jù)該DNA序列為T)置換為C[SEQ ID NO7]，在+134位點A置換為G(即使得該序列包含GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAGCTAGAGATC[SEQ ID NO17])以及在+142位點U(即根據(jù)該DNA序列為T)置換為A(即使得該序列包含GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGAAC[SEQ ID NO18]，這些突變可以或者單獨制備或者組合制備。特別是，在缺乏其它U5突變的情況下，crHIV U5 RNA中的+114位點[SEQ ID NO6]和/或+132位點[SEQ IDNO7]的U(即根據(jù)該DNA序列為T)置換為C，防止核酶的切割(Uhlenbeck(1987)，見上述)。這些插入的堿基置換存在于HIV的其它各種毒株中(Myers等，HIV Sequence Database，Los Alamos Nat.Lab.(1994))，這表明這些置換不降低該HIV基因組的復(fù)制能力。
本文提出的方法可以用來構(gòu)建其它條件復(fù)制型載體，例如由不同病毒基因組(例如不同RNA病毒)組成的載體，或由不同遺傳抗病毒劑組成的載體。另外，可以進(jìn)一步修飾條件復(fù)制型載體，以賦予導(dǎo)入該載體的宿主細(xì)胞的選擇性優(yōu)勢高于含有野生型病毒的細(xì)胞。例如，可以修飾這樣一種載體以進(jìn)一步編碼多種藥物抗性或一種突變蛋白酶或逆轉(zhuǎn)錄酶。實施例2該實施例描述條件復(fù)制型載體、特別是crHIV載體對核酶酶切的抗性。
為了證實crHIV載體對核酶酶切的抗性，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。為了完成這一點，將核酶序列克隆入pBluescript KSII(Stratagene，La Jolla，CA)的Xho I位點。同樣從該crHIV載體切下含有該突變crHIV U5區(qū)的0.21千堿基對(kb)的Bgl II片段，將其插入pBluescript KSII的Bam HI位點。在體外轉(zhuǎn)錄之前，將所得的修飾pBlueseript KSII載體用Bss HII線性化。表達(dá)野生型HIV U5 RNA的相似載體(在Myers等(1994)中進(jìn)行了描述，見上述)用作對照。在體外轉(zhuǎn)錄之前，用Eco RI將其線性化。
如前述(Dropulic等(1992)，見上述)通過這些載體的體外轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生放射性標(biāo)記的U5 HIV RNA和核酶RNA。放射性標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄物在含有40mM Tris-HCl pH7.5、6mM MgCl2、2mM亞精胺和10mMNaCl的1×轉(zhuǎn)錄緩沖液中一起保溫(靶與核酶的摩爾比為1∶2)。在加入含有95％甲酰胺、20mM EDTA、0.05％溴酚藍(lán)和0.05％二甲苯靛FF之前，將樣品加熱至65℃，然后冷卻至37℃5分鐘。然后通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分辨產(chǎn)物，并通過放射自顯影進(jìn)行檢測。
如圖3中所見，當(dāng)野生型U5-HIV RNA(圖3，第1泳道)與含有+115位點單核酶轉(zhuǎn)錄物一起保溫(圖3，第2泳道)時，容易觀察到切割(圖3，第3泳道)。這種切割產(chǎn)生產(chǎn)物PI和P2。當(dāng)野生型HIV RNA與含有導(dǎo)向或者相同位點(圖3，第4和5泳道)或者不同位點(圖3，第6和7泳道)雙核酶的RNA一起保溫時，也可以見到切割。當(dāng)含導(dǎo)向兩個不同位點核酶的轉(zhuǎn)錄物與野生型HIV RNA一起保溫時，產(chǎn)生產(chǎn)物P1、P2和P3。P3由+133位點的切割產(chǎn)生。
相比之下，當(dāng)含修飾U5的crHIV RNA(圖3，第1泳道)或者與導(dǎo)向+115位點的單核酶，或者與導(dǎo)向+115位點或+133位點的雙核酶一起保溫，檢測不到切割產(chǎn)物(圖3，第10、12和14泳道)。因此，這些結(jié)果證實，crHIV U5 RNA抗核酶切割，而野生型HIV-U5 RNA被抗U5核酶切割。此外，這些結(jié)果證實，與病毒野生型毒株相比，當(dāng)條件復(fù)制型載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞時，本發(fā)明方法可以用來賦予條件復(fù)制型載體(包括非crHIV載體的載體)選擇性復(fù)制的優(yōu)勢。實施例3該實施例描述含核酶的條件復(fù)制型載體在胞內(nèi)切割野生型病毒RNA的能力。具體地說，該實施例描述crHIV載體在胞內(nèi)切割野生型HIV RNA的能力。
通過將基因組共轉(zhuǎn)染到Jurkat細(xì)胞中，測試crHIV載體介導(dǎo)的抑制野生型HIV的效力。通過在Opti-MEN培養(yǎng)基(Life Technologies，Gibco BRL，Gaitherburg，MD)中洗滌大約106 Jurkat細(xì)胞，然后用大約0.6μg野生型HIV RNA(即pNL4-3)和大約1.8μg crHIV DNA共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。用摩爾比大約為1∶3的野生型HIV與crHIV前病毒以確保轉(zhuǎn)染野生型HIV的所有細(xì)胞也都含有crHIV前病毒。DNA在細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑溶液(Life Technologies)中混合30分鐘，然后與Jurkat細(xì)胞一起保溫大約3-6小時，此后加入含有10％胎牛血清(FBS)的完全RPMI1640培養(yǎng)基。如前述(Dropulic等(1992)，見上述)，每2-4天收獲含病毒的上清液，通過細(xì)胞上清液中的逆轉(zhuǎn)錄酶活性分析病毒水平。
crHIV基因組對野生型HIV復(fù)制的作用示于圖4中。當(dāng)野生型HIV與crHIV-1.1共轉(zhuǎn)染時，相對于共轉(zhuǎn)染野生型HIV和對照病毒的細(xì)胞(圖4，實心方框)，病毒生長延遲(圖4，空心方框)，但不抑制病毒生長。由于抗U5核酶在共定位條件下(例如Dropulic等(1992)，見上述)可以抑制體內(nèi)HIV復(fù)制，因此所見的病毒生長可能是以下原因之一(a)優(yōu)先將野生型HIV RNA包裝到子代病毒粒子中，(b)抗核酶切割的野生型HIV RNA的產(chǎn)生，或(c)crHIV RNA中非功能性核酶的積累。
通過共轉(zhuǎn)染野生型HIV與含有雙核酶的crHIV載體，測試“逃逸”病毒生長的本質(zhì)。如果優(yōu)先包裝野生型HIV是病毒生長的原因，那么含有雙核酶crHIV的培養(yǎng)物應(yīng)該具有與含有單核酶crHIV培養(yǎng)物相似的生長動力學(xué)。然而，如果病毒生長由變?yōu)榭购嗣缸饔玫囊吧虷IVRNA所產(chǎn)生(即由于病毒逆轉(zhuǎn)錄酶不精確)，那么含有crHIV-1.12(即導(dǎo)向兩個病毒位點)的培養(yǎng)物的病毒生長動力學(xué)應(yīng)該表現(xiàn)出比含有crHIV-1.11(即導(dǎo)向單個病毒位點)的培養(yǎng)物更延遲?；蛘撸绻绻姷皆诤胁煌p核酶crHIV的培養(yǎng)物中病毒生長延遲相當(dāng)，那么啟示一定比例的單個表達(dá)的核酶在體內(nèi)不起作用。
如圖4中所見，含有crHIV-1.11(圖4，空心打叉方框)或crHIV-1.12(圖4，打點方框)的培養(yǎng)物表現(xiàn)出病毒生長開始比含有單個轉(zhuǎn)錄核酶的crHIV-1.1(圖4，空心方框)延遲。然而，在crHIV-1.11和crHIV-1.12之間病毒生長開始的延遲是相似的，表明第三種可能性的正確性，即單個轉(zhuǎn)錄核酶切割靶RNA的動力學(xué)效率低于雙核酶的效率。這啟示，由于共轉(zhuǎn)染實驗是以過量摩爾的含核酶crHIV基因組進(jìn)行的，因此一定比例的胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄核酶可以形成非功能性的、可能錯誤折疊的構(gòu)象。
探測多核酶通過提供功能性核酶與野生型HIV RNA聯(lián)合的更大可能性解除該動力學(xué)限制的能力。關(guān)于這些實驗，將Jurkat細(xì)胞用野生型HIV和crHIV-1.111共轉(zhuǎn)染，crHIV-1.111含有導(dǎo)向+115位點的三核酶。正如圖5中所見(打點方框)，甚至培養(yǎng)22天后，使用三核酶沒有證據(jù)表明病毒生長。鑒于正常初級T細(xì)胞通常在感染HIV后不久(例如大約1周)死亡，因此這些結(jié)果特別重要。
此外，這些結(jié)果證實，含核酶的條件復(fù)制型載體(諸如crHIV載體)，特別是含多核酶的載體可以用來在胞內(nèi)與野生型病毒基因組(諸如HIV)競爭。實施例4該實施例描述支持含核酶的條件復(fù)制型載體，特別是crHIV載體在胞內(nèi)切割野生型病毒RNA能力的機(jī)制的研究。
關(guān)于這些實驗，如本文所述，使用逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢查來自野生型HIV和crHIV-1.111共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物的細(xì)胞上清液RNA。使用圖6A-C中所述的引物進(jìn)行RT-PCR。即使用引物R1和R2檢測核酶RNA，使用引物V1和V3檢測野生型HIV RNA，使用引物V2和V3檢測crHIV RNA。引物R1(TGTGACGTCGACCACACAACACTGATG[SEQ ID NO8]和R2(TGTGACGTCGACTCTAGATGTGCCCGTTTCGGC[SEQ ID NO9]每種包含一個SalI限制位點，通過與該核酶雜交序列結(jié)合，擴(kuò)增抗U5核酶RNA。在crHIV-1.111表達(dá)細(xì)胞中，見到單核酶、雙核酶和三核酶擴(kuò)增產(chǎn)物。引物VI(GGTTAAGCTTGAATTAGCCCTTCCAGTCCCC[SEQ ID NO10]和V2(GGTTGGATCCGGGTGGCAAGTGGTCAAAAAG[SEQ ID NO11]每種包含Bam HI或Hin dIII限制位點，并擴(kuò)增野生型HIV RNA。V3(CGGATCCACGCGTGTCGACGAGCTCCCATGGTGATCAG[SEQ ID NO12]引物與上述VI引物一起包含Bam HI和其它限制位點。該引物組由crHIV特異性多接頭序列擴(kuò)增crHIV RNA。
為了進(jìn)行RT-PCR，采用TrizolTM(Life Techologies)分離病毒粒子和胞內(nèi)RNA。由微量離心的細(xì)胞沉淀直接分離胞內(nèi)病毒RNA。從首先通過以12,000×g微量離心5分鐘清除細(xì)胞和沉淀的培養(yǎng)物上清液中分離病毒粒子RNA。將TrizolTM加入無細(xì)胞上清液中，在加入氯仿進(jìn)行相分離之前，將混合物保溫5分鐘。將水相轉(zhuǎn)移至新試管中，利用糖原用異丙醇沉淀該RNA。重建RNA沉淀后，逆轉(zhuǎn)錄這些病毒RNA，然后使用放射性標(biāo)記的引物通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增。
于42℃，在含有50mM Tris-HCl pH8.3、75mM KCl、3mMMgCl2、5mM DTT、1mM dNTPs和20單位(U)RNA酶抑制劑的第一鏈緩沖液中，加入25U MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶，進(jìn)行1小時逆轉(zhuǎn)錄。完成逆轉(zhuǎn)錄后，將逆轉(zhuǎn)錄酶于65℃加熱滅活10分鐘。然后將整個混合物直接加入PCR緩沖液中，以組成含有終濃度為10mM Tris-HCl pH8.3、50mM KCl和1.5mM MgCl2的混合物。使用2.5U Taq酶，將該混合物擴(kuò)增30個周期。然后通過變性PAGE分辨放射性標(biāo)記的PCR產(chǎn)物，并通過放射自顯影進(jìn)行檢測。
如圖7所見(第4泳道)，crHIV-1.111核酶RNA存在于共轉(zhuǎn)染野生型HIV-1和crHIV-1.111前病毒基因組后20多天的細(xì)胞上清液中。通過單核酶、雙核酶和三核酶RNA PCR產(chǎn)物的存在，證明這一點。相比之下，在轉(zhuǎn)染對照野生型HIV的培養(yǎng)物(第2泳道)中，沒有見到這類產(chǎn)物。在此期間，細(xì)胞看來是正常的，沒有crHIV誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的明顯跡象。這證明，即使沒有觀察到逆轉(zhuǎn)錄酶活性，crHIV也包裝到病毒顆粒中。此外，這表明crHIV可以由HIV基因功能在胞內(nèi)互補(bǔ)。
因此，這些結(jié)果表明，crHIV通過抑制野生型HIV的傳播，抑制野生型HIV的復(fù)制。結(jié)果進(jìn)一步表明，例如其它病毒載體的其它條件復(fù)制型載體和/或含有其它遺傳抗病毒劑的載體同樣可以用來抑制野生型病毒的復(fù)制和傳播。實施例5該實施例描述支持含核酶的條件復(fù)制型載體，特別是crHIV載體在胞內(nèi)切割野生型病毒RNA能力的機(jī)制的進(jìn)一步研究。
一個可能的機(jī)制是，野生型HIV RNA和crHIV RNA都可以包裝到子代病毒粒子中，由于核酶和靶RNA的共定位，在這小病毒體積中發(fā)生有效的切割?；蛘?，因為在胞內(nèi)而不是在HIV病毒粒子內(nèi)野生型HIV RNA的切割占優(yōu)勢，因此可能發(fā)生選擇性地將crHIV RNA包裝到子代病毒粒子中。本文探究這些機(jī)制。
通過與病毒粒子與細(xì)胞有關(guān)的病毒RNA的RT-PCR，在單獨轉(zhuǎn)染野生型HIV(圖8，第2和6泳道)或共轉(zhuǎn)染野生型HIV和crHIV-1.111(圖8，第4和8泳道)的細(xì)胞培養(yǎng)物中檢測crHIV-1.111抑制野生型HIV傳播的方法。crHIV-1.111僅存在于共轉(zhuǎn)染后產(chǎn)生的子代病毒粒子(圖8，第4泳道)。相比之下，轉(zhuǎn)染對照野生型HIV的培養(yǎng)物產(chǎn)生的病毒粒子僅含有野生型HIV RNA(圖8，第2泳道)。在共轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)物中，證明在胞內(nèi)同時存在野生型HIV RNA和crHIV RNA(圖8，第8泳道)。因此，盡管在胞內(nèi)既合成野生型HIV RNA，也合成crHIVRNA，但選擇性地將crHIV RNA包裝到子代病毒粒子中。這啟示，crHIV-1.111通過在包衣殼之前選擇性地切割野生型HIV基因組RNA，同時允許某些亞基因組野生型RNA翻譯為生產(chǎn)病毒的蛋白，抑制野生型HIV的傳播。
為了測試野生型基因組RNA是否被crHIV RNA選擇性地切割，通過Northern雜交檢測存在于共轉(zhuǎn)染后大約20天獲得的Jurkat細(xì)胞培養(yǎng)物中存在的胞內(nèi)RNA類型。由pNL4-3 U5區(qū)的0.21kb Bgl II片段分離圖6所示的用于Northern印跡分析的探針。
圖9表明這些實驗的結(jié)果。轉(zhuǎn)染野生型HIV的培養(yǎng)物表達(dá)所有野生型HIV RNA種類，即基因組和亞基因組RNA種類(圖9，第1泳道)。相比之下，共轉(zhuǎn)染crHIV-1.111的培養(yǎng)物不表達(dá)顯著量的野生型HIV基因組(9.7kb)RNA(圖9，第2泳道)。在共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)物中(圖9，第2泳道)中觀察到低分子量的RNA(反映野生型HIV亞基因組RNA的存在)。這些樣品中不清晰的HIV RNA啟示，這些低分子量RNA中可能存在某些降解的基因組HIV RNA。相比之下，來自對照野生型HIV細(xì)胞的不清晰的野生型HIV RNA(圖9，第1泳道)是由于在HIV感染晚期觀察到的由顯著CPE發(fā)生的RNA降解。
因此，這些結(jié)果證明，野生型HIV基因組RNA在含有野生型HIV和crHIV-1.111基因組的細(xì)胞中被選擇性地切割和降解，允許選擇性地將crHIV RNA包裝到病毒粒子中。另外，這些結(jié)果表明，該方法可能同樣用于其它病毒，特別是用于其它RNA病毒。實施例6該實施例描述含核酶的條件復(fù)制型載體，特別是crHIV載體在野生型輔助病毒存在下，經(jīng)歷完整的病毒復(fù)制周期能力的研究。
為了證實crHIV基因組在輔助野生型HIV基因組存在下經(jīng)歷完整的病毒復(fù)制周期，在幾種條件下檢測含crHIV基因組的病毒顆粒的產(chǎn)生。具體地說，首先在激活的ACH2細(xì)胞(AIDS試劑參比程序，Rockville，Maryland)中檢測含crHIV基因組的病毒顆粒的產(chǎn)生。這些細(xì)胞包含潛伏感染HIV-1的細(xì)胞系。下一步，檢測得自這些培養(yǎng)物的任何crHIV顆粒感染未受感染Jurkat細(xì)胞和產(chǎn)生crHIV DNA的能力。
關(guān)于這些實驗，用大約2.5μg載體DNA轉(zhuǎn)染大約106ACH2細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后大約24小時，用50nM 12-O-肉豆蔻酰佛波醇13-乙酸酯(TPA)刺激細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后大約72小時，從細(xì)胞上清液中分離RNA。采用實施例4所述R1和R2引物進(jìn)行RT-PCR。如圖10A所見，在轉(zhuǎn)染crHIV-1.11后(第4泳道)，但不是在轉(zhuǎn)染pGEM 3Z對照質(zhì)粒(Promega，Madison，WI)(第2泳道)后激活的ACH2細(xì)胞產(chǎn)生的病毒粒子中檢測到crHIV核酶RNA。因此，crHIV載體轉(zhuǎn)染到受感染CD4+細(xì)胞中導(dǎo)致含有crHIV RNA的病毒顆粒的產(chǎn)生。
下一步，檢測得自這些培養(yǎng)物的crHIV病毒粒子感染未受感染的Jurkat細(xì)胞并產(chǎn)生crHIV前病毒的能力。通過用TrizolTM分離細(xì)胞DNA、用Eco RI酶切該DNA，然后使用實施例4所述R1和R2引物通過PCR擴(kuò)增核酶RNA，檢測這類前病毒。圖10B說明在感染得自轉(zhuǎn)染crHIV的ACH2細(xì)胞的細(xì)胞上清液后的Jurkat細(xì)胞中產(chǎn)生crHIVDNA。即在這種情況下，見到crHIV-1.11核酶DNA的特異性擴(kuò)增(圖10B，第2泳道)。相比之下，單獨感染受刺激ACH2細(xì)胞上清液的細(xì)胞(即在缺乏感染crHIV-1.111的ACH2細(xì)胞的情況下)沒有顯示出核酶DNA產(chǎn)物(圖10C，第1泳道)。
由于crHIV載體只在野生型輔助HIV基因組的存在下傳播，因此檢測含有crHIV基因組的未受感染細(xì)胞在感染野生型HIV后被解救的能力。通過首先用crHIV-1.11(即作為crHIV載體的代表)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，然后用野生型HIV(即pNL4-3)超感染，進(jìn)行這些實驗。因此，用大約2.5μg crHIV DNA轉(zhuǎn)染大約106Jurkat細(xì)胞。讓這些細(xì)胞在感染野生型HIV病毒貯液之前生長大約72小時。轉(zhuǎn)染crHIV-1.11的Jurkat細(xì)胞與pNL4-3貯液(2×105 TCID50單位/106細(xì)胞)一起于37℃保溫大約2小時，在Opti-MEMI還原血清培養(yǎng)基中洗滌3次，然后重懸浮于完全培養(yǎng)基(具有10％FBS的RPMI 1640)中。感染后大約5天，按實施例4所述方法從細(xì)胞上清液中分離RNA。
關(guān)于TCID50測定，用5倍限制稀釋液將含有HIV的上清液在96孔板上鋪平板。然后將大約104MT4細(xì)胞(AIDS試劑參比程序，Rockville，Maryland；和Harada等，Science，229，563-566(1985))加入稀釋的病毒上清液中，將所得的上清液培養(yǎng)7天，直至發(fā)生完全的病毒生長。MT4細(xì)胞是修飾的T細(xì)胞，它含有來自HTLV-1的Tax基因，后者為類似于HIV-1中Tat的反式激活因子基因。然后分析上清液的逆轉(zhuǎn)錄酶活性并按前述計分(Dropulic等(1992)，見上述)。用Reed和Muench的方法(Tech.in HIV Res.，Johnson等，eds.，Stocton Press，71-76(1990))測定該組織培養(yǎng)物的感染劑量(TCID50)。
轉(zhuǎn)染crHIV的Jurkat細(xì)胞超感染野生型HIV，導(dǎo)致crHIV基因組解救到病毒顆粒中(圖10C，第4泳道)。在超感染野生型HIV后，crHIV基因組被包裝到病毒顆粒中。在此期間，這些細(xì)胞看來是正常的，沒有顯著的細(xì)胞毒性跡象。
這些結(jié)果證實，crHIV基因組在與野生型HIV輔助病毒互補(bǔ)后，能夠經(jīng)歷整個復(fù)制周期。這些結(jié)果也證實，其它病毒基因組在與相應(yīng)的野生型病毒互補(bǔ)后，可能能夠經(jīng)歷整個復(fù)制周期。實施例7該實施例描述先前實施例中報道的逃逸病毒生長。
通過采用前述RT-PCR分析病毒粒子RNA，檢測來自轉(zhuǎn)染野生型HIV或共轉(zhuǎn)染野生型HIV和crHIV-1.11的培養(yǎng)物的逃逸病毒生長的本質(zhì)。病毒生長早期培養(yǎng)物(即轉(zhuǎn)染野生型HIV第+11天的培養(yǎng)物，共轉(zhuǎn)染crHIV-1.11第+19天的培養(yǎng)物)產(chǎn)生的病毒主要含有crHIVRNA(圖11；轉(zhuǎn)染野生型HIV的培養(yǎng)物，第2泳道，共轉(zhuǎn)染crHIV-1.11的培養(yǎng)物，第4泳道)。相比之下，病毒生長晚期的培養(yǎng)物(即轉(zhuǎn)染野生型HIV第+17天的培養(yǎng)物，共轉(zhuǎn)染crHIV-1.11第+23天的培養(yǎng)物)主要含有野生型HIV RNA(圖11；轉(zhuǎn)染野生型HIV的培養(yǎng)物，第6泳道，共轉(zhuǎn)染crHIV-1.11的培養(yǎng)物，第8泳道)。因此，共轉(zhuǎn)染野生型HIV和crHIV-1.11前病毒的細(xì)胞的病毒生長(圖11，第4和8泳道)看來似乎是由從胞內(nèi)核酶限制作用逃逸的野生型HIV的生長導(dǎo)致的。很明顯，甚至在病毒生長晚期培養(yǎng)物中，crHIV基因組仍占總HIV基因組相當(dāng)大的比例(圖11，第4和8泳道)。這提示，盡管野生型HIV基因組占優(yōu)勢，然而crHIV通過該培養(yǎng)物傳播，盡管其效率低于野生型HIV基因組的效率。
這證明，crHIV載體以及其它條件復(fù)制型載體可以有效地與野生型病毒基因組競爭病毒復(fù)制。實施例8該實施例進(jìn)一步描述先前實施例中報道的逃逸病毒生長的本質(zhì)。
通過測定傳染性野生型HIV的效價，研究逃逸病毒生長期間將crHIV RNA包裝到病毒粒子中的作用。在病毒生長對數(shù)期培養(yǎng)物(即第+14天的野生型HIV培養(yǎng)物，第+16天的crHIV-1.1培養(yǎng)物，第+20天的crHIV-1.11或crHIV-1.12培養(yǎng)物)的病毒上清液上進(jìn)行限制稀釋TCID50的測定(如實施例6中所述)。在采用逆轉(zhuǎn)錄酶測定之前，將樣品歸一化。野生型HIV、crHIV-1.1、crHIV-1.11和crHIV-1.12的培養(yǎng)物上清液的感染劑量分別為1.3×104TCID50/ml、5.4×103TCID50/ml、3.8×103TCID50/ml和3.8×103TCID50/ml。因此，在逃逸病毒生長期間crHIV RNA包裝到病毒粒子中導(dǎo)致產(chǎn)生的傳染性野生型HIV顆粒數(shù)的降低。
下一步檢測傳染性野生型HIV效價的降低是否為切割逃逸病毒粒子內(nèi)野生型HIV RNA的結(jié)果。通過引物延伸評價存在于共轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液中病毒粒子的RNA切割產(chǎn)物。使用圖6中鑒定的、含有Hin dIII限制位點的PE引物(GGTTAAGCTTGTCGCCGCCCCTCGCCTCTTG[SEQ ID NO13]。在包含50mM Tris-HCl pH8.3、75mM KCl、3mMMgCl2、5mM DTT、1mM dNTPs和20U RNA酶抑制劑的第一鏈緩沖液中，在其中加入25U MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶，于42℃進(jìn)行2小時跨過該切割位點的引物延伸。從得自共轉(zhuǎn)染crHIV培養(yǎng)物的濃縮病毒粒子制劑中分離病毒RNA。通過于4℃以2,000×g離心15分鐘，除去細(xì)胞和沉淀。然后通過于4℃以30,000×g超離心4小時濃縮病毒。然后采用TrizolTM，如前所述從病毒沉淀中分離病毒RNA。
在病毒生長晚期從轉(zhuǎn)染野生型HIV和共轉(zhuǎn)染crHIV-1.11的培養(yǎng)物(即轉(zhuǎn)染野生型HIV第+17天的培養(yǎng)物，共轉(zhuǎn)染crHIV-1.11第+23天的培養(yǎng)物)上清液中分離病毒RNA。如圖12所示，這些培養(yǎng)物中的病毒粒子既含有野生型HIV基因組RNA，也含有crHIV基因組RNA。在轉(zhuǎn)染野生型HIV(圖12，第1泳道)和共轉(zhuǎn)染crHIV-1.11(圖12，第2泳道)的培養(yǎng)物中都觀察到引物延伸的全長cDNA。盡管進(jìn)行了廣泛的引物延伸分析，但沒有檢測可能由U5 RNA切割產(chǎn)生的的較小的cDNA。因此，傳染性野生型HIV RNA效價的降低不是由于野生型HIV RNA的病毒內(nèi)切割引起的，而是由于在子代病毒粒子內(nèi)被crHIVRNA進(jìn)行數(shù)量置換引起的。
因此，這些結(jié)果表明，本文所述方法可以用來用按照本發(fā)明的條件復(fù)制型載體，從子代病毒粒子中取代野生型基因組，諸如HIV基因組和其它基因組。實施例9該實施例證明，用質(zhì)?；蛑亟McrHIV-1.111病毒攻擊后，crHIV載體可以抑制野生型HIV的復(fù)制。
Jurkat細(xì)胞用HIV貯液(克隆pNL4-3)感染，然后用或者(1)含crHIV-1.111構(gòu)建物的質(zhì)粒DNA或者(2)在293細(xì)胞中包裝的重組crHIV-1.111病毒(即突變crHIV-1.M)(Nadlini等，Science，272，263-267(1996))進(jìn)行攻擊。對這些細(xì)胞進(jìn)行DLS脂類介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Thierry等，PNAS，92，9742-9746(1995))或crHIV介導(dǎo)的傳遞。通過在原始感染HIV后12天使用逆轉(zhuǎn)錄酶分析測定病毒的復(fù)制。野生型陽性對照培養(yǎng)物表現(xiàn)出正常水平的野生型HIV生長。當(dāng)通過DLS介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染用突變crHIV-1.M攻擊感染野生型HIV的細(xì)胞時，不影響野生型HIV病毒的生長。相比之下，當(dāng)通過DLS介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，用編碼抗HIV核酶的crHIV-1.111攻擊感染野生型HIV的細(xì)胞時，顯著抑制野生型HIV病毒的生長(即復(fù)制)。此外，當(dāng)用野生型HIV攻擊突變crHIV-1.M時，不影響野生型HIV的復(fù)制。相反，當(dāng)用crHIV-1.111攻擊野生型HIV時，顯著抑制野生型HIV的復(fù)制。該數(shù)據(jù)表明，crHIV載體可以用來在胞內(nèi)顯著抑制野生型HIV的復(fù)制。實施例10該實施例描述條件復(fù)制型載體在癌的治療處理中的用途。
可以構(gòu)建治療癌的條件復(fù)制型病毒載體，使其在正常細(xì)胞中的復(fù)制能力有缺陷，因為它缺乏其復(fù)制所需的病毒蛋白。然而，當(dāng)該載體感染癌細(xì)胞時，該癌細(xì)胞的獨特性質(zhì)提供一種因子(例如最好是促進(jìn)癌細(xì)胞異常生長的同一突變細(xì)胞蛋白)，它促進(jìn)該缺陷型治療癌的載體復(fù)制。因此，該方法不同于用于治療病毒感染的方法，因為不發(fā)生病毒載體選擇性地包裝，而是因為在該細(xì)胞中包裝載體衍生的子代病毒粒子而優(yōu)先裂解癌細(xì)胞。然而，該方法類似于用于病毒感染的方法，因為它可以使用輔助病毒表達(dá)載體選擇性地在癌細(xì)胞中繁殖該條件復(fù)制型載體。該載體和/或輔助病毒表達(dá)載體可以制成對腫瘤特異性因子應(yīng)答，由此促進(jìn)載體選擇性地在腫瘤細(xì)胞中傳播。
可以在該治療方法中利用的腫瘤特異性因子包括(但不限于)在以下水平上作用的那些因子(1)病毒進(jìn)入細(xì)胞的水平(例如允許病毒載體選擇性地進(jìn)入癌細(xì)胞中，而不進(jìn)入正常細(xì)胞中的腫瘤特異性受體的存在)；(2)病毒轉(zhuǎn)錄水平(例如與正常細(xì)胞相反，一種突變癌細(xì)胞蛋白將允許治療癌的載體選擇性地在癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄其RNA；以及(3)病毒成熟和釋放(例如突變癌細(xì)胞蛋白可以例如通過使這些突變細(xì)胞蛋白與病毒蛋白或基因組聯(lián)合和導(dǎo)致促進(jìn)病毒成熟和釋放，允許該治療癌的條件復(fù)制型載體選擇性地成熟)。因此，存在于癌細(xì)胞中的突變蛋白可以與病毒復(fù)制周期許多階段的病毒蛋白(或基因組RNA或DNA)相互作用。可以操作這些相互作用，產(chǎn)生治療癌的條件復(fù)制型載體，后者在正常細(xì)胞中為缺陷型，而在癌細(xì)胞中可以復(fù)制。
具體地說，該方法可以用來治療T細(xì)胞白血病。T細(xì)胞白血病為預(yù)后差的嚴(yán)重癌形式。許多白血病T細(xì)胞為CD4+。因此，可以使用野生型HIV作為該載體骨架，構(gòu)建治療抗T細(xì)胞白血病的條件復(fù)制型載體。由于HIV顯然通過CD4糖蛋白進(jìn)入細(xì)胞，因此該載體能夠在病毒進(jìn)入細(xì)胞水平上起作用。
可以通過例如將缺失導(dǎo)入野生型HIV中，將該載體制成治療癌的載體?？梢园辞笆龇椒?，通過產(chǎn)生DNA形式的HIV基因組并進(jìn)行定點誘變，使該HIV基因組突變。通過用其它腫瘤抑制突變或陰性癌基因互補(bǔ)病毒缺陷，或通過利用與病毒蛋白相互作用的其它腫瘤特異性因子，同樣可以利用該方法。例如可以缺失tat基因，后者編碼的蛋白對HIV復(fù)制是重要的。在缺乏Tat的情況下，HIV不再能夠增量調(diào)節(jié)其表達(dá)，后者對HIV復(fù)制是絕對必要的。Tat蛋白通過結(jié)合與HIV啟動子聯(lián)合的TAR RNA莖-環(huán)結(jié)構(gòu)起作用，并能夠?qū)IV表達(dá)增量調(diào)節(jié)100倍以上。因此，沒有Tat，基于HIV的載體不表達(dá)HIV蛋白，將不繁殖并且不殺傷正常(即非癌性)T細(xì)胞。
然而，白血病T細(xì)胞通常包含功能改變的分子，它或者突變、過量表達(dá)，或者沉默。該改變狀態(tài)的分子功能與正常細(xì)胞無關(guān)。在其非突變狀態(tài)中(但不是其突變狀態(tài))，該分子在細(xì)胞增殖和/或細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)中起作用。與該突變狀態(tài)有關(guān)的變化可以用來特異性地促進(jìn)條件復(fù)制型病毒載體的繁殖。這可以在存在或缺乏輔助病毒表達(dá)載體的情況下進(jìn)行。例如Tat的缺陷可以由驅(qū)動腫瘤特異性啟動子的輔助表達(dá)載體互補(bǔ)，這里該啟動子來自過量表達(dá)的白血病細(xì)胞的一個基因。這樣一種載體僅可以在白血病T細(xì)胞中復(fù)制，而不能在正常細(xì)胞中復(fù)制。在白血病T細(xì)胞中的病毒表達(dá)和繁殖可以導(dǎo)致細(xì)胞裂解和死亡，同時產(chǎn)生新生病毒。該載體也可以攜帶另一元件，以促進(jìn)細(xì)胞殺傷(例如編碼毒素、細(xì)胞因子或促進(jìn)免疫導(dǎo)向的抗原的序列)。
其它方法和策略同樣可以用于其它治療癌的條件復(fù)制型載體的構(gòu)建中。實施例11該實施例描述第二代crHIV構(gòu)建物(cr2HIV)的開發(fā)，它的繁殖性能優(yōu)于crHIV-1.111載體。
第二代載體能夠增加crHIV產(chǎn)生細(xì)胞的crHIV顆粒生產(chǎn)。更多crHIV顆粒的產(chǎn)生促進(jìn)它們傳播，并防止培養(yǎng)物中野生型HIV的過生長。由于缺乏阻斷超感染野生型HIV的蛋白的編碼序列，這些載體含有所有天然野生型HIV的序列，但不編碼Tat基因。在Tat基因上三個不同位點上制成的抗Tat三聯(lián)核酶盒([SEQ ID NO19])取代該Tat基因。另外，缺失該Tat剪接位點，使得Tat核酶選擇性地切割野生型HIV基因組RNA，而不是已剪接的野生型HIV RNA，后者互補(bǔ)Tat中的缺陷，并促進(jìn)crHIV復(fù)制。與先前不編碼非(或許是)蛋白性遺傳抗病毒劑(諸如免疫原)蛋白的載體相反，第二代載體編碼這些蛋白，但只在Tat的存在下表達(dá)這些蛋白。在含有野生型HIV和crHIV基因組的細(xì)胞中，由于不僅野生型HIV產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白，而且crHIV基因組也產(chǎn)生結(jié)構(gòu)蛋白，因此不僅選擇性地包裝crHIV基因組，而且生產(chǎn)的病毒粒子多于crHIV-1.111細(xì)胞。因此，由于不僅由野生型HIV模板產(chǎn)生病毒粒子，而且由crHIV模板產(chǎn)生病毒粒子，因此賦予該載體選擇性包裝的優(yōu)勢。
第二代載體的特征也是包含或編碼核酶，其催化域?qū)蛟撦d體本身以外的區(qū)域。與包含或編碼導(dǎo)向HIV前導(dǎo)序列U5區(qū)的核酶的crHIV-1.111(它需要將修飾的U5序列加入該crHIV載體的前導(dǎo)序列中)相反，第二代載體的核酶導(dǎo)向的區(qū)域不在該載體中，由此消除了修飾該載體序列的需要。這減小可以通過野生型HIV與修飾crHIV U5序列重組形成抗性HIV的可能性。因此，野生型HIV與crHIV序列的重組可能沒有對野生型HIV提供益處；將核酶序列加入野生型HIV中只可能對野生型HIV有害。
第二代載體的另一特征為加入大量的不同核酶，每種核酶都導(dǎo)向不同位點，以減小野生型HIV形成抗核酶突變體的可能性。
在安全目的的該載體系統(tǒng)的另一改進(jìn)中，可以通過加入以安全方式特異性促進(jìn)crHIV復(fù)制和傳播的遺傳元件/因子，進(jìn)一步修飾條件復(fù)制型疫苗、“輔助載體”構(gòu)建物。一個實施方案是將核酶導(dǎo)入該輔助載體中，以防止它與該載體進(jìn)行遺傳重組產(chǎn)生野生型病毒。因此，上述cr2HIV載體可以與Tat輔助表達(dá)載體互補(bǔ)，以促進(jìn)其傳播。通過將抗HIV的核酶插入該輔助表達(dá)載體中，最大限度地減小重組機(jī)會，因為該載體遇到輔助載體RNA可能導(dǎo)致它們相互剪切和破壞。因此，可以以多種方式修飾該輔助表達(dá)載體，以有助于特定的預(yù)防或治療策略。因此，由于cr2HIV載體(1)復(fù)制并因此持久性地刺激宿主免疫應(yīng)答，以及(2)由于它們得自HIV并在抗原上變化，允許該宿主識別多樣化表位，因此r2HIV載體具有作為抗HIV疫苗的實用性。
本文引用的所有參考文獻(xiàn)包括專利、專利申請和出版物通過引用整個結(jié)合到本文中。
盡管已經(jīng)描述了本發(fā)明，重點在推薦實施方案上，但本領(lǐng)域技術(shù)人員會明顯看出，在推薦實施方案中可以產(chǎn)生變化，并使用這些變化，并且除本文具體描述的實施方案外，可以實施本發(fā)明。本發(fā)明將包括這類變化和其它實施。因此，本發(fā)明包括以下權(quán)利要求書限定的本發(fā)明精神和范圍內(nèi)包括的所有修改。
序列表(1)一般資料(i)申請人Dropulic，BoroPitha，Paula M.(ii)發(fā)明題目條件復(fù)制型病毒載體及其用途(iii)序列數(shù)19(iv)通訊地址(A)地址Leydig，Voit & Mayer，Ltd.
(B)街區(qū)Two Prudential Plaza，Suite 4900(C)城市芝加哥(D)州IL(E)國家美國(F)郵政編碼60601(v)計算機(jī)可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，版本#1.25(vi)當(dāng)前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S(B)填寫日期1996年11月27日(C)分類(vi)先前申請數(shù)據(jù)(A)申請?zhí)朥S 08/563,459(B)填寫日期1995年11月28日(C)分類(viii)代理律師/代理人資料(A)姓名Kilyk Jr.John(B)登記號30，763(C)參考/檔案號71899(ix)電訊資料(A)電話(312)616-5600(B)傳真(312)616-5700(C)電傳25-3533(2)有關(guān)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO1GTGTGCCCGT CTGTTGTGTG ACTCTGGTAA CTAGAGATC39(2)有關(guān)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO2GTGTGCCCAC CTGTTGTGTG ACTCTGGCAG CTAGAGAAC39(2)有關(guān)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長度3個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型RNA(xi)序列描述SEQ ID NO3NUH3(2)有關(guān)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度40個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型DNA(其它核酸)(xi)序列描述SEQ ID NO4CACACAACAC TGATGAGGCC GAAAGGCCGA AACGGGCACA 40(2)有關(guān)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度40個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型DNA(其它核酸)(xi)序列描述SEQ ID NO5ATCTCTAGTC TGATGAGGCC GAAAGGCCGA AACCAGAGTC 40(2)有關(guān)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO6GTGTGCCCGC CTGTTGTGTG ACTCTGGTAA CTAGAGATC39(2)有關(guān)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO7GTGTGCCCGT CTGTTGTGTG ACTCTGGCAA CTAGAGATC39(2)有關(guān)SEQ ID NO8的資料(i)序列特征(A)長度27個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型DNA(其它核酸)(xi)序列描述SEQ ID NO8TGTGACGTCG ACCACACAAC ACTGATG 27(2)有關(guān)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型DNA(其它核酸)(xi)序列描述SEQ ID NO9TGTGACGTCG ACTCTAGATG TGCCCGTTTC GGC 33(2)有關(guān)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征(A)長度31個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型DNA(其它核酸)(xi)序列描述SEQ ID NO10GGTTAAGCTT GAATTAGCCC TTCCAGTCCC C31(2)有關(guān)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長度31個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型DNA(其它核酸)(xi)序列描述SEQ ID NO11GGTTGGATCC GGGTGGCAAG TGGTCAAAAA G31(2)有關(guān)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長度38個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型DNA(其它核酸)(xi)序列描述SEQ ID NO12CGGATCCACG CGTGTCGACG AGCTCCCATG GTGATCAG 38(2)有關(guān)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征(A)長度31個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型DNA(其它核酸)(xi)序列描述SEQ ID NO13GGTTAAGCTT GTCGCCGCCC CTCGCCTCTT G 31(2)有關(guān)SEQ ID NO14的資料(i)序列特征(A)長度112個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型DNA(其它核酸)(xi)序列描述SEQ ID NO14AAGCTTGCCT TGAGTGCTCA AAGTAGTGTG TGCCCACCTG TTGTGTGACT CTGGCAGCTA 60GAGATCCCAC AGACCCTTTT AGTCAGTGTG GAAAATCTCT AGCAGTGGCG CC 112(2)有關(guān)SEQ ID NO15的資料(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO15GTGTGCCCNN CTGTTGTGTG ACTCTGGNAN CTAGAGANC39(2)有關(guān)SEQ ID NO16的資料(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型DNA(其它核酸)(xi)序列描述SEQ ID NO16GTGTGCCCAT CTGTTGTGTG ACTCTGGTAA CTAGAGATC39(2)有關(guān)SEQ ID NO17的資料(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO17GTGTGCCCGT CTGTTGTGTG ACTCTGGTAG CTAGAGATC39(2)有關(guān)SEQ ID NO18的資料(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO18GTGTGCCCGT CTGTTGTGTG ACTCTGGTAA CTAGAGAAC39(2)有關(guān)SEQ ID NO19的資料(i)序列特征(A)長度152個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線狀(ii)分子類型DNA(其它)(xi)序列描述SEQ ID NO19GATCGAATTC CTGCTATGTT CTGATGAGTC CGAAAGGACG AAACACCCAT TTCCCGGGTT 60TAGGATCCTG ATGAGCGGAA AGCCGCGAAA CTGGCTCCGG CCGTTTTAGG CTCTGATGAG 120CTGGAAACAG CGAAACTTCC TGGTCGACGA TC 15權(quán)利要求
1.條件復(fù)制型病毒載體，其特征在于僅在允許所述載體復(fù)制的宿主細(xì)胞中復(fù)制的能力，其中所述載體包含至少一種核酸序列，該核酸序列的存在、轉(zhuǎn)錄或翻譯賦予允許所述載體復(fù)制的宿主細(xì)胞中的所述載體的選擇性優(yōu)勢高于衍生所述載體的相應(yīng)野生型病毒毒株或者助手。
2.權(quán)利要求1的條件復(fù)制型病毒載體，其中所述至少一種核酸序列包含一個核苷酸序列，它包含或編碼在這種情況下表達(dá)的遺傳抗病毒劑，后者不利地影響非所述載體的病毒的復(fù)制和/或表達(dá)。
3.權(quán)利要求2的條件復(fù)制型病毒載體，其中所述所述遺傳抗病毒劑選自反義分子、核酶和免疫原。
4.權(quán)利要求2的條件復(fù)制型病毒載體，其中所述遺傳抗病毒劑為核酶。
5.權(quán)利要求4的條件復(fù)制型病毒載體，其中所述載體得自人免疫缺陷病毒。
6.權(quán)利要求4的條件復(fù)制型病毒載體，其中所述載體得自披膜病毒科。
7.權(quán)利要求4的條件復(fù)制型病毒載體，其中所述核酶的催化域切割SEQ ID NO3的核苷酸序列。
8.權(quán)利要求4的條件復(fù)制型病毒載體，其中所述核酶由選自SEQID NO4和SEQ ID NO5的序列編碼。
9.權(quán)利要求5的條件復(fù)制型病毒載體，其中所述病毒野生型毒株包含SEQ ID NO1編碼的核苷酸序列，所述載體如果是DNA，則包含選自SEQ ID NO2、4、5、6、7、15、16、17和18的一個核苷酸序列，所述載體如果是RNA，則包含由選自SEQ ID NO2、4、5、6、7、15、16、17和18的一個核苷酸序列編碼的核苷酸序列。
10.權(quán)利要求5的條件復(fù)制型病毒載體，其中所述載體缺乏來自人免疫缺陷病毒的tat基因及其剪接位點，其中所述人免疫缺陷病毒為野生型。
11.權(quán)利要求10的條件復(fù)制型病毒載體，其中所述載體包含一個抗Tat三聯(lián)核酶盒代替所述tat基因及其剪接位點，其中三聯(lián)核酶盒中每個核酶的催化域切割野生型人免疫缺陷病毒核酸分子上的不同位點。
12.權(quán)利要求11的條件復(fù)制型病毒載體，其中所述野生型人免疫缺陷病毒核酸分子包含tat，該三聯(lián)核酶盒中每個核酶的催化域切割tat內(nèi)的不同位點。
13.權(quán)利要求11的條件復(fù)制型病毒載體，其中每個核酶的催化域切割野生型人免疫缺陷病毒核酸分子一個區(qū)內(nèi)的核苷酸序列，對此該載體本身中沒有抗核酶類似物。
14.條件復(fù)制型病毒載體，其特征在于，僅在允許所述載體復(fù)制的宿主細(xì)胞中復(fù)制的能力，其中所述載體包含至少一種核酸序列，該核酸序列的存在、轉(zhuǎn)錄或翻譯賦予感染所述載體的宿主細(xì)胞的選擇性優(yōu)勢高于感染衍生所述載體的相應(yīng)野生型病毒毒株或者助手的細(xì)胞。
15.權(quán)利要求14的條件復(fù)制型病毒載體，其中所述至少一種核酸序列包含編碼多種藥物抗性的核苷酸序列。
16.權(quán)利要求15的條件復(fù)制型病毒載體，其中所述載體得自人免疫缺陷病毒。
17.權(quán)利要求15的條件復(fù)制型病毒載體，其中所述載體得自披膜病毒科。
18.權(quán)利要求16的條件復(fù)制型病毒載體，其中所述至少一種核酸序列包含選自編碼突變蛋白酶的核苷酸序列和編碼突變逆轉(zhuǎn)錄酶的核苷酸序列的核苷酸序列。
19.權(quán)利要求1的條件復(fù)制型病毒載體，其中所述載體還包含至少一種另一核酸序列，該核酸序列的存在、轉(zhuǎn)錄或翻譯賦予感染所述載體的宿主細(xì)胞的選擇性優(yōu)勢高于感染衍生所述載體的相應(yīng)病毒野生型毒株或者助手的細(xì)胞。
20.權(quán)利要求19的條件復(fù)制型病毒載體，其中所述至少一種另一核酸序列包含編碼多種藥物抗性的序列。
21.權(quán)利要求19的條件復(fù)制型病毒載體，其中其中所述載體得自人免疫缺陷病毒。
22.權(quán)利要求19的條件復(fù)制型病毒載體，其中所述載體得自披膜病毒科。
23.權(quán)利要求21的條件復(fù)制型病毒載體，其中所述至少一種另一核酸序列包含選自編碼突變蛋白酶的核苷酸序列和編碼突變逆轉(zhuǎn)錄酶的核苷酸序列的核苷酸序列。
24.權(quán)利要求23的條件復(fù)制型病毒載體，其中所述載體選自crHIV-1.1、crHIV-1.11、crHIV-1.12和crHIV-1.111。
25.包含權(quán)利要求1的載體和藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物。
26.包含權(quán)利要求14的載體和藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物。
27.包含權(quán)利要求19的載體和藥學(xué)上可接受載體的藥物組合物。
28.包含權(quán)利要求1的載體的宿主細(xì)胞。
29.包含權(quán)利要求14的載體的宿主細(xì)胞。
30.包含權(quán)利要求19的載體的宿主細(xì)胞。
31.一種載體，其中所述載體如果是DNA，則包含選自SEQ IDNO2、4、5、6、7、15、16、17和18的核苷酸序列，所述載體如果是RNA，則包含由選自SEQ ID NO2、4、5、6、7、15、16、17和18的核苷酸序列編碼的核苷酸序列。
32.產(chǎn)生載體的方法，該載體得自野生型人免疫缺陷病毒，能夠僅在允許所述載體復(fù)制的宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，該載體具有核酶，后者包含于所述載體中或由所述載體編碼，它切割野生型人免疫缺陷病毒的核酸，但不切割該載體本身及其轉(zhuǎn)錄物(如果有的話)；該方法包括(a)獲得載體，后者得自野生型人免疫缺陷病毒，能夠僅在允許所述載體復(fù)制的宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，以及(b)將以下序列加入該載體中(a)一種核酸序列，它包含或編碼在這種情況下也表達(dá)的一種核酶，后者的催化域切割野生型人免疫缺陷病毒的核酸，但不切割該載體本身及其轉(zhuǎn)錄物(如果有的話)。
33.權(quán)利要求32的方法，其中步驟(b)包括(i)使所述載體缺失包含或編碼野生型人免疫缺陷病毒U5序列的核苷酸序列，以及(ii)將一個核苷酸序列插入(i)的載體中，所述載體如果是DNA，則該核苷酸序列選自SEQ ID NO2、6、7、15、16、17和18的核苷酸序列，所述載體如果是RNA，則該核苷酸序列由選自SEQ IDNO2、6、7、15、16、17和18的核苷酸序列編碼的核苷酸。
34.權(quán)利要求32的方法，其中所述載體在允許所述載體復(fù)制1次以上的宿主細(xì)胞中復(fù)制。
35.修飾載體的方法，該方法包括(a)獲得載體，以及(b)將一種核酸序列加入(a)的載體中，所述載體如果是DNA，則該核苷酸序列選自SEQ ID NO2、4、5、6、7、15、16、17和18的DNA序列，所述載體如果是RNA，則該核苷酸序列由選自SEQ ID NO2、4、5、6、7、15、16、17和18的核苷酸序列編碼的核苷酸序列。
36.不用包裝細(xì)胞系而繁殖和選擇性包裝條件復(fù)制型載體的方法，該方法包括(a)使該條件復(fù)制型載體與能夠被另一載體感染的細(xì)胞接觸，該另一載體的載體類型與該條件復(fù)制型載體相同，它由于是具有復(fù)制能力的野生型而不同于該條件復(fù)制型載體；(b)使(a)的細(xì)胞與所述(a)的另一載體接觸；以及(c)在有助于繁殖所述條件復(fù)制型載體的條件下培養(yǎng)(b)的細(xì)胞。
37.分離和純化的核酸分子，它選自包含選自SEQ ID NO2、6、7、15、16、17和18的核苷酸序列的DNA分子以及包含由選自SEQ ID NO2、6、7、15、16、17和18的核苷酸序列編碼的核苷酸序列的RNA分子。
38.抑制病毒野生型毒株在宿主細(xì)胞中復(fù)制的方法，該方法包括使能夠感染該病毒野生型毒株的該宿主細(xì)胞與權(quán)利要求1的載體接觸，該載體的存在、轉(zhuǎn)錄或翻譯抑制該病毒野生型毒株在該宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。
39.抑制病毒野生型毒株在宿主細(xì)胞中復(fù)制的方法，該方法包括使能夠感染該病毒野生型毒株的該宿主細(xì)胞與權(quán)利要求14的載體接觸，該載體的存在、轉(zhuǎn)錄或翻譯抑制該病毒野生型毒株在該宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。
40.抑制病毒野生型毒株在宿主細(xì)胞中復(fù)制的方法，該方法包括使能夠感染該病毒野生型毒株的該宿主細(xì)胞與權(quán)利要求19的載體接觸，該載體的存在、轉(zhuǎn)錄或翻譯抑制該病毒野生型毒株在該宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。
41.抑制病毒野生型毒株在宿主細(xì)胞中復(fù)制的方法，該方法包括使能夠感染該病毒野生型毒株的該宿主細(xì)胞與權(quán)利要求13的載體接觸，該載體的存在、轉(zhuǎn)錄或翻譯抑制該病毒野生型毒株在該宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。
42.權(quán)利要求41的方法，它還包括使該宿主細(xì)胞與選自細(xì)胞毒性藥物、蛋白酶抑制劑和逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的藥劑接觸。
43.抑制病毒野生型毒株在宿主細(xì)胞中復(fù)制的方法，該方法包括使能夠感染該病毒野生型毒株的該宿主細(xì)胞與權(quán)利要求18的載體接觸，該載體的存在、轉(zhuǎn)錄或翻譯抑制該病毒野生型毒株在該宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。
44.權(quán)利要求43的方法，它還包括使該宿主細(xì)胞與選自細(xì)胞毒性藥物、蛋白酶抑制劑和逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑的藥劑接觸。
45.權(quán)利要求38的方法，其中所述病毒引起癌。
46.權(quán)利要求38的方法，其中所述宿主細(xì)胞尚未與所述病毒野生型毒株接觸，并且其中所述方法還包括使所述宿主細(xì)胞與輔助表達(dá)載體接觸，其中所述輔助表達(dá)載體互補(bǔ)所述不能復(fù)制的條件復(fù)制型病毒載體。
47.權(quán)利要求46的方法，其中所述輔助表達(dá)載體以細(xì)胞特異性方式互補(bǔ)所述條件復(fù)制型病毒載體。
48.在宿主細(xì)胞中表達(dá)目的基因的方法，該方法包括(a)使所述宿主細(xì)胞與權(quán)利要求1的條件復(fù)制型病毒載體和助手接觸，其中所述病毒載體還包含該目的基因，并能夠在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)該基因，以及(b)在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)該目的基因。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述目的基因在所述宿主細(xì)胞中的表達(dá)抑制野生型病毒在所述宿主細(xì)胞中的復(fù)制。
50.在宿主細(xì)胞中表達(dá)目的基因的方法，該方法包括(a)使所述宿主細(xì)胞與權(quán)利要求14的條件復(fù)制型病毒載體和助手接觸，其中所述病毒載體還包含該目的基因，并能夠在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)該基因，以及(b)在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)該目的基因。
51.在宿主細(xì)胞中表達(dá)目的基因的方法，該方法包括(a)使所述宿主細(xì)胞與權(quán)利要求19的條件復(fù)制型病毒載體和助手接觸，其中所述病毒載體還包含該目的基因，并能夠在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)該基因，以及(b)在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)該目的基因。
52.檢測藥物/因子和蛋白之間相互作用的方法，該方法包括使該藥物/因子與權(quán)利要求28的宿主細(xì)胞接觸，其中該載體編碼并表達(dá)一種蛋白；以及(b)檢測該藥物/因子和該突變蛋白之間的相互作用。
全文摘要
本發(fā)明提供條件復(fù)制型病毒載體,提供制備、修飾、繁殖和選擇性包裝以及使用這樣一種載體的方法,提供與該載體相關(guān)的具有特定核苷酸序列和氨基酸序列的分離分子、包含這樣一種載體的藥物組合物和宿主細(xì)胞、這樣一種載體篩選藥物的用法。這些方法包括病毒感染、特別是HIV感染的預(yù)防和治療處理,因此也涉及病毒疫苗和癌的治療,特別是病毒病因?qū)W的癌的治療。其它方法包括這類條件復(fù)制型病毒載體在基因治療和其它應(yīng)用中的用法。
文檔編號G01N33/15GK1207775SQ96199726
公開日1999年2月10日 申請日期1996年11月27日 優(yōu)先權(quán)日1995年11月28日
發(fā)明者B·德羅普利, P·M·皮特哈 申請人:約翰斯·霍普金斯大學(xué)醫(yī)學(xué)院