專利名稱：：利用散射光的測定方法及測定裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及利用散射光的方法測定混合物樣品中被分析物質(zhì)、特別是尿或血漿等生物物質(zhì)、定性定量測定作為其成分的葡萄糖、丙酮和尿素的方法及裝置，特別涉及利用反司托克斯-拉曼(Anti-Stokes-Raman)光散射的測定方法及裝置。利用光散射方法定量測定物質(zhì)濃度的方法有多種。在利用拉曼散射方法中，有利用拉曼散射強(qiáng)度與試料中的葡萄糖濃度成比例關(guān)系的無損測定方法(參見特開平7-49309號專利公報(bào))。為了抑制樣品產(chǎn)生的熒光，利用近紅外光作為激發(fā)光，用透鏡匯聚來自樣品的散射光，使用頻率特性曲線凹下的濾光片屏蔽瑞利散射光后，用分光器分光可獲得樣品中目標(biāo)物質(zhì)的拉曼散射光譜，從而對目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行定量測量。在現(xiàn)有技術(shù)中，為了避開生物物質(zhì)、從活體取出的物質(zhì)或其它的熒光發(fā)生物質(zhì)混合物產(chǎn)生的熒光，采用波長比該熒光波長長的激光作為激發(fā)光源來定量測定目標(biāo)物質(zhì)(見《激光拉曼分光與臨床醫(yī)學(xué)》尾畸幸洋等著OplusE1992492-99)。但是，由于拉曼散射強(qiáng)度隨激發(fā)光波長的四次方成反比地減弱，所以，如果用近紅外光作激發(fā)光，與用可見光光源激發(fā)相比，檢測出的光強(qiáng)度明顯變?nèi)?。此外，在使用比可見光波長長的激光時(shí)，還必須使對應(yīng)該激光的檢測器和分光器適用于長波長。但當(dāng)前近紅外線的平面元件或矩陣元件的價(jià)格非常昂貴。在使用近紅外波長光測定拉曼散射的方法中，還有利用傅立葉變換的FT拉曼分光方法，F(xiàn)T拉曼分光裝置是大型儀器，其缺點(diǎn)是在測定過程中花費(fèi)的時(shí)間長。在利用上述拉曼散射或光散射方法測定樣品時(shí)，來自樣品的目標(biāo)散射光譜往往被來自樣品的熒光抵消。若樣品是生物體本身，在從血液、尿、糞便、唾液、淚液等分離出的物質(zhì)的情況下，或在食品、水果、農(nóng)產(chǎn)品等情況下熒光特別強(qiáng)。通過拉曼散射光譜可以觀察比激發(fā)光的光量子能量高的光譜邊界(以下用反司托克斯線表示)和比激發(fā)光的光量子能量低的光譜邊界(下面用司托克斯線表示)。司拉克斯線是由于光照射到特定分子上時(shí)，保持光量子的分子中的少部分放出所保持的光量子后沒有回到原來的振動能級上而返回到與電子的基態(tài)不同的振動能級(比基態(tài)高的能級)上產(chǎn)生的譜線。反司托克斯線是由于在比原來的基態(tài)能量高的能級上的電子釋放出入射的光量子的大部分后沒有返回到原來的能級上，與照射的光的一部分一起躍遷到基態(tài)產(chǎn)生的譜線。也就是說，因?yàn)榉此就锌怂咕€和司托克斯線的能量的寬度都等于振動激發(fā)態(tài)的能量與基態(tài)能量的差，所以反司托克斯線與司托克斯線的移動波數(shù)出現(xiàn)在以激發(fā)光為對稱的位置上。只要激發(fā)光譜與熒光光譜交叉的范圍不寬，熒光光譜存在相對激發(fā)光量子能量低的范圍即在波長長的范圍內(nèi)，從量子理論上考慮，通過照射的光能，處在基態(tài)或其它能級的電子只被照射的光能激勵，在從該激發(fā)能級躍遷到基態(tài)的時(shí)間內(nèi)是通過瞬間限于多能級上發(fā)生的，即熒光一般產(chǎn)生在比激發(fā)光量子能量低的范圍(長波側(cè))。因此，如果觀測拉曼散射分析中的反司托克斯線，則通過避開熒光影響，通過拉曼分光分析方法可以獲得試料樣品中目標(biāo)物質(zhì)成分的光譜，借助于觀察目標(biāo)物質(zhì)的光譜變化和強(qiáng)度進(jìn)行被分析物質(zhì)的定性和定量分析。在反司托克斯-拉曼散射的研究中，有將泵光和探測器光射入被測定物質(zhì)測定反司托克斯-拉曼散射的相干的反司托克斯-拉曼分光(CARS)方法。這種分光法的原理是將兩束不同頻率的光射入樣品中，當(dāng)這兩束入射光的量子能量差與拉曼散射躍遷的頻率一致時(shí)，只使拉曼散射的躍遷頻率的譜發(fā)生強(qiáng)迫振動，利用物質(zhì)內(nèi)部的強(qiáng)制振動產(chǎn)生相位同步的非線性振動。因此，在用CARS方法的反司托克斯-拉曼散射光譜中與通常的線性拉曼散射光譜的濃度和目標(biāo)物質(zhì)的拉曼散射強(qiáng)度的關(guān)系不同，光與物質(zhì)的非線性相互作用變得明顯。另外，多光子吸收躍遷，高次相干的過程引起的散射，感應(yīng)拉曼散射和周波與高次諧波發(fā)生等非線形現(xiàn)象共存，其光譜也不一定能線性地反映目標(biāo)樣品的濃度。因此不能把CARS作為定量分析方法使用。另外，在分光系統(tǒng)中，需要幾個(gè)激光光源，因此，增大了裝置規(guī)模。反司托克斯-拉曼散射光譜與司托克斯-拉曼散射光譜的強(qiáng)度比由以下的玻爾茲曼分布公式近似表示。式中h普朗克常數(shù)k玻爾茲曼常數(shù)T絕對溫度V拉曼移動波數(shù)圖1表示根據(jù)玻爾茲曼分布、假定絕對溫度為300K時(shí)顯示出的反司托克斯線與司托克斯線強(qiáng)度比的計(jì)算值。在樣品溫度為300K下，強(qiáng)度比在-1000cm-1(用波數(shù)的負(fù)號表示反司托克斯-拉曼散射在比激發(fā)波長短的短波長側(cè)移動)時(shí)為0.008，在-1500cm-1時(shí)為0.007。因此，可以認(rèn)為用通常的線性拉曼分光方法不可能檢測出反司托克斯-拉曼散射光。本發(fā)明的第一目的是通過把檢測波長設(shè)置在比激發(fā)波長短的短波長側(cè)即使不采用昂貴的FT拉曼分光裝置和用于長波長的CCD元件作為光檢測器也能利用與現(xiàn)有技術(shù)中相同的拉曼分光系統(tǒng)檢測出反司托克斯-拉曼散射光。本發(fā)明的第二個(gè)目的是在將上述方法作為樣品的分析方法時(shí)，通過避開在激發(fā)樣品時(shí)產(chǎn)生的熒光可以準(zhǔn)確地進(jìn)行定性和定量分析。本發(fā)明將激發(fā)光照射樣品、利用從樣品中產(chǎn)生的散射光中的反司托克斯散射光測定分析樣品中的被分析物質(zhì)的方法。使本發(fā)明的方法適用于定量分析方法時(shí)，把樣品中的被分析物質(zhì)的濃度和反司托克斯-拉曼散射強(qiáng)度間的相關(guān)性合適的移動波數(shù)選擇為該被分析物質(zhì)的固有的測定移動波數(shù)，檢測出在該測定移動波數(shù)的反司托克斯-拉曼散射強(qiáng)度，然后根據(jù)檢測曲線定量分析樣品中的被分析物質(zhì)。上述測定的移動波數(shù)能使被分析物質(zhì)的濃度與反司托克斯-拉曼散射強(qiáng)度間的相互關(guān)系的相關(guān)系數(shù)R為0.6以上，最好移動波數(shù)為0.8以上。相關(guān)系數(shù)R的值可根據(jù)下式計(jì)算出R=&Sigma;i=1n{(xi-X)(yi-Y)}[&Sigma;i=1n(xi-X)2][&Sigma;i=1n(yi-Y)2]]]>式中xi各被分析物質(zhì)各點(diǎn)的濃度yi對應(yīng)xi的拉曼散射光譜強(qiáng)度X各被分析物質(zhì)的濃度平均值Y拉曼散射光譜強(qiáng)度的平均值適于本發(fā)明方法的合適的樣品的一個(gè)例子是尿、血漿等生物物質(zhì)。被分析物質(zhì)的一個(gè)例子是葡萄糖、酮體和尿素等包含在生物物質(zhì)中的成分。本發(fā)明的測定裝置包括帶有激發(fā)光源并將激發(fā)光照射在樣品上的激發(fā)光源單元、激發(fā)光照射到樣品上的樣品單元、激發(fā)光照射在樣品上并匯聚從樣品產(chǎn)生的散射光的聚光光學(xué)調(diào)整單元、從被匯聚光光學(xué)調(diào)整單元匯聚的散射光中在已提高反司托克斯-拉曼散射光的接收光密度狀態(tài)下利用光檢測器檢測上述散射光的接收光單元。在具體的優(yōu)選的例子中，聚光光學(xué)調(diào)整單元作為聚光系統(tǒng)具有象散的透鏡，接收光單元在比激發(fā)光波長短的短波長的光成象位置上具有受光口，并檢測從該受光口入射的散射光。為了能使接收光單元的光檢測器檢測出反司托克斯-拉曼散射強(qiáng)度，接收光單元還可以裝有使從受光口入射的散射光分光的衍射光柵等機(jī)構(gòu)例如分光器，或者也可在聚光光學(xué)調(diào)整單元上裝有只使要檢測的反司托克斯-拉曼散射光的移動波數(shù)的光透過的帶通濾光器。激光光源單元最好裝有只使照射在樣品上的激發(fā)光波長的光透過的帶通濾光器。聚光光學(xué)調(diào)整單元也可以在具有象散的透鏡的光入射側(cè)使樣品產(chǎn)生的散射光匯聚，并作為平行光引導(dǎo)到該具有象散的透鏡上，也可以裝有象散小的透鏡。雖然為了除去激發(fā)光波長成分，聚光光學(xué)調(diào)整單元裝有使激發(fā)光波包含在頻率特性曲線凹下范圍內(nèi)的全息攝影頻率特性曲線凹下的濾波器，但最好裝有屏蔽激光波長和比其波長長的長波側(cè)的光的截止濾光器。在全息攝影頻率特性曲線凹下的濾光器的情況下，最好使上述頻率特性曲線凹下的范圍與激發(fā)光光源單元的帶通范圍對稱的。接收光單元的受光口也可以是分光器的入口狹縫，或者也可以是單芯光纖的一個(gè)端面。采用光纖時(shí)可以將光纖的另一端面引導(dǎo)到分光器或光檢測器上。為了能改變達(dá)到最高受光密度的波長，最好使聚光光學(xué)調(diào)整單元的具有象散的透鏡與受光口間的距離是可調(diào)的。為了提高反司托克斯-拉曼散射光的產(chǎn)生效率，樣品單元最好裝備有球狀容器和使保持該容器的部分成為反射面的積分球形容器的支座。另外，為了通過補(bǔ)償光源光強(qiáng)度的變化提高測定數(shù)據(jù)的再現(xiàn)性，還可裝有取出激發(fā)光的一部分作為檢測參照光用的光學(xué)系統(tǒng)，最好根據(jù)該參照光的檢測強(qiáng)度校正反司托克斯-拉曼散射光的檢測強(qiáng)度。另外，如果還設(shè)置在遍及比激發(fā)光波長短的短波長側(cè)的確定范圍內(nèi)使反司托克斯-拉曼散射光的接收光靈敏度保持一定而進(jìn)行計(jì)算的處理單元、該處理單元將表示反司托克斯-拉曼散射的存在概率的玻爾茲曼分布和利用本發(fā)明的反司托克斯-拉曼散射光的接收光密度增強(qiáng)因素相乘、然后對其結(jié)果進(jìn)行修正則可以提高定量分析的精度，這也是很可取的。本發(fā)明的測定方法是利用反司托克斯-拉曼線測定生物物質(zhì)和其它物質(zhì)的方法，即使檢測器的靈敏度僅達(dá)到1000nm，由于反司托克斯-拉曼線出現(xiàn)在比激發(fā)光短的短波長側(cè)，也可以利用激發(fā)光例如使用1064nm的激發(fā)光對物質(zhì)的拉曼散射進(jìn)行測定。這樣還可以擴(kuò)展檢測器的使用范圍。在把本發(fā)明的測定方法用于對生物物體容易產(chǎn)生熒光的樣品進(jìn)行測定時(shí)，為了避開熒光也沒有必要選擇激光光源的波長，即使采用比較便宜的具有大的振動能量的激光器也能在避開熒光的同時(shí)對物質(zhì)的拉曼散射進(jìn)行測定。從即使不考慮避開熒光也可以解決的點(diǎn)和受檢測器靈敏度制約變小的這點(diǎn)出發(fā)也可以擴(kuò)展可利用的激發(fā)光波長的范圍。因?yàn)楦咻敵龅募す夤庠吹恼駝硬ㄩL受到限制，所以激發(fā)波長的選擇范圍變寬這件事在使用高輸出激光光源時(shí)具有很大好處。另外，由于可以避免熒光，所以可以提高S/N(信噪比)，從而可以測定少量的樣品。由于生物物質(zhì)樣品只能少量獲得，所以這種方法對測定特定生物物質(zhì)特別有用。本發(fā)明的特定裝置將第一波長的激發(fā)光照射到樣品上，用具有象散的透鏡聚集由樣品產(chǎn)生的散射光，在該透鏡的光軸上通過在透鏡側(cè)的位置上而不是在由激發(fā)光波長的光成象位置上接收光，由于提高了比激發(fā)光波長短的那個(gè)波長的反司托克斯-拉曼散射光的接收光密度，所以可以用現(xiàn)有技術(shù)中難以利用的常規(guī)的拉曼測定裝置測定反司托克斯-拉曼散射光。圖1表示根據(jù)波爾茲曼分布在絕對溫度為300K時(shí)的反司托克斯-拉曼線與司托克斯-拉曼線的強(qiáng)度比計(jì)算值的曲線；圖2為概略地表示本發(fā)明裝置的斜視圖；圖3A、B是表示光學(xué)調(diào)整單元的聚光透鏡的功能圖，圖3A是使聚光透鏡的入射光變成平行光的情況，圖3B是單一聚光透鏡的情況；圖4是表示透鏡光學(xué)材料的BK7的折射率隨波長變化的曲線；圖5A、B、C示出了各接收光位置情況下的各波長位置的光密度比；圖6A、B表示使反司托克斯-拉曼散射光譜的接收光靈敏度保持一定的過程的流程圖，圖6A表示利用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)計(jì)算校正反函數(shù)存儲的過程，圖6B表示測定未知樣品的過程；圖7是顯示在測定中使用的裝置的一部分的方框圖；圖8是表示在圖7的測定裝置中使用的容器和容器支座的分解斜視圖；圖9A是表示用現(xiàn)有裝置系統(tǒng)測定的99％酮體的拉曼散射光譜圖；圖9B是它的放大圖；圖10A是表示用實(shí)施例中的裝置測定的99％酮體的拉曼散射光譜圖；圖10B是它的放大圖；圖11A是用實(shí)施例的裝置測定的1M葡萄糖水溶液的拉曼散射光譜圖；圖11B是它的放大圖；圖12表示人尿的散射光譜的波形圖；圖13是表示把人尿制備成含2M葡萄糖的樣品的散射光譜圖；圖14是表示該樣品的反司托克斯-拉曼散射光譜的波形圖；圖15是葡萄糖濃度改變后的尿樣品的反司托克斯-拉曼散射光譜圖；圖16是顯示-1131cm-1附近的反司托克斯-拉曼散射強(qiáng)度與葡萄糖濃度間的對應(yīng)關(guān)系圖；圖17是表示反司托克斯-拉曼散射強(qiáng)度與葡萄糖濃度(32-1000mg/dl)在-2000～-100cm-1范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)R的圖；圖18是表示反司托克斯-拉曼散射強(qiáng)度與葡萄糖濃度(32～514mg/dl)在-2000～-100cm-1范圍內(nèi)的相關(guān)系數(shù)R的圖；圖19A是用本實(shí)施例的裝置測定的將人血漿制備成含有1M葡萄糖樣品的拉曼散射光譜的圖；圖19B是它的放大圖；圖20是表示在-1130cm-1附近的反司托克斯-拉曼散射強(qiáng)度與葡萄糖濃度間的對應(yīng)關(guān)系的圖；圖21是表示人血漿中的葡萄糖濃度與反司托克斯-拉曼散射強(qiáng)度在-2000～0cm-1的對應(yīng)關(guān)系圖；圖22是在人尿中含酮體的樣品的散射光譜圖；圖23是表示該樣品的反司托克斯-拉曼散射光譜圖；圖24是表示在人尿中含尿素的樣品的散射光譜圖；圖25是表示該樣品的反司托克斯-拉曼散射的光譜圖；圖26是表示在人尿中含葡萄糖，酮體和尿素的樣品的散射光譜圖；圖27是表示該樣品的反司托克斯-拉曼散射光譜圖；圖28是表示人尿中含葡萄糖、酮體和尿素的樣品的反司托克斯-拉曼散射光譜中的葡萄糖濃度與光譜強(qiáng)度間的對應(yīng)關(guān)系圖；圖29是表示人尿中含有葡萄糖，酮體和尿素的樣品的反司托克斯-拉曼散射光譜中的酮體濃度與光譜強(qiáng)度的對應(yīng)關(guān)系的圖；圖30是表示在人尿中含有葡萄糖、酮體和尿素的樣品的反司托克斯-拉曼散射光譜中的尿素濃度與光譜強(qiáng)度的對應(yīng)關(guān)系圖。圖2是表示本發(fā)明裝置的概略構(gòu)成圖。2代表激發(fā)光源，例如是氬離子激光器(514.5nm，100mW)等適合的高輸出功率型激光裝置。來自激光器2的激發(fā)光束4通過用于除去側(cè)邊帶的帶通濾光器6，然后通過準(zhǔn)直透鏡8照射在樣品室10中的樣品上。樣品為氣體或液體時(shí)將其裝在樣品盒中，而在固體樣品情況下不需要樣品盒。為了接收調(diào)整來自樣品的散射光設(shè)置了聚光光學(xué)調(diào)整單元16。作為聚光光學(xué)調(diào)整單元的一個(gè)例子包括攝影透鏡12和聚光透鏡14。攝影透鏡12是通過將激發(fā)光激發(fā)樣品產(chǎn)生的散射光沿90°角方向接收變成平行光的組件，是用象散小的材料制作的復(fù)合透鏡，通常將該攝影透鏡的象散設(shè)計(jì)成盡可能小。因此，可以用這種一般的攝影透鏡。當(dāng)攝影透鏡12在樣品中產(chǎn)生的散射光從一點(diǎn)產(chǎn)生時(shí)，最好是使450-650nm的所述波長的光為平行光。聚光透鏡14是有象散的透鏡，例如由作為一般透鏡材料的BK7制成。聚光透鏡14接收來自攝影透鏡12的平行光并匯聚在相應(yīng)波長的焦點(diǎn)上。在被聚光透鏡14所要求的波長的焦點(diǎn)位置上設(shè)置分光器18的入口狹縫19作為受光口，該入口狹縫19的寬度約200μm。入口狹縫19設(shè)置的位置是要檢測的反司托克斯-拉曼散射光匯聚的位置。分光器是300G/mm、工作波長500nm的衍射光柵20的單分光器，其分辨率為6.8cm-1(0.18nm/大格柵)，在分光器18上，22，24，26分別為平面鏡。檢測器28是液氮冷卻型(EEV元件)的256×1024大格柵的CCD攝影元件(美國EG&amp;G公司制造，200-1100nm波長靈敏度)，對被分光器18分光的多個(gè)波長同時(shí)進(jìn)行接收檢測。由該分光器18和檢測器28構(gòu)成單色器。由檢測器28檢測的信號通過光纖30傳送給作為數(shù)據(jù)處理裝置的個(gè)人計(jì)算機(jī)32進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。在圖2中，為了從散射光中除去激發(fā)光成分，在攝影透鏡12與聚光透鏡14之間配置在頻率特性曲線凹下范圍內(nèi)含激發(fā)光波長的全息照相頻率特性曲線凹下的濾光器34。該全息照相頻率特性曲線凹下的濾光器例如可以從KAISEROPTICALSYSTEMS，INC.(美國)購買。該全息照相頻率特性曲線凹下的濾光器34具有例如完全遮住包含在頻率特性曲線凹下范圍波長的光而使頻率特性曲線凹下范圍以外波長的光的80％透過的特性。圖3A和圖3B是用于說明聚光透鏡14功能的圖。圖3A適用于圖2的光學(xué)系統(tǒng)，從樣品中產(chǎn)生的散射光經(jīng)攝影透鏡12變成平行光，該平行光40入射到聚光透鏡14中，當(dāng)白色的平行光40照射到具有象散的聚光透鏡14上時(shí)，按照不同的波長在不同位置上成象。按照本發(fā)明，利用由于在聚光透鏡14上的波長不同而引起焦點(diǎn)位置的變動，通過在反司托克斯-拉曼散射光匯聚的位置配置微小的受光口，可以提高反司托克斯-拉曼散射光的接收密度。在光學(xué)調(diào)整單元中，省去攝影透鏡12也可以通過具有象散透鏡的聚光透鏡14直接接收從樣品中產(chǎn)生的散射光。圖3B示出了沒有攝影透鏡12情況下的聚光透鏡14的功能圖。聚光透鏡14配置在離開樣品散射光發(fā)生點(diǎn)10a兩倍焦點(diǎn)距離或更遠(yuǎn)的位置上，散射光發(fā)生點(diǎn)10a的象由于波長的不同而成象在不同的位置上。在這種情況下也與圖3A的情況相同，利用在聚光透鏡14上的波長的不同使焦點(diǎn)位置變動，通過在匯聚反司托克斯-拉曼散射光的位置上配置小的受光口可以提高反司托克斯-拉曼散射光的接收光密度。可以使用BK7、人造石英、蘭寶石、SF11等光學(xué)玻璃作為具有象散的聚光透鏡14的材料，作為一個(gè)例子，在圖4A的表中和圖4B的曲線示出了利用一般的光學(xué)材料BK7情況下的折射率隨波長的變化。在300-700nm范圍內(nèi)折射率變化較大。不限于BK7，對于其它光學(xué)玻璃在300-700nm的范圍內(nèi)折射率變化大這一點(diǎn)是共同的。利用氬離子激光器作為激發(fā)光源測定拉曼散射光譜時(shí)，-4000～4000cm-1(負(fù)范圍表示反司托克斯-拉曼散射光譜)的范圍相當(dāng)于波長420-650nm。即在適合的情況下，反司托克斯-拉曼線的范圍是聚光透鏡象散影響大的范圍，從而可以有效地利用象散。當(dāng)利用透鏡的象散時(shí)，可以使比激發(fā)光波長長的范圍的光密度降低后射入狹縫，而使比激發(fā)光波長短的波長范圍的光提高密度后射入狹縫。如果用拉曼散射光譜表示，可以使反司托克斯線的接收光密度提高后射入入口狹縫。在表1中示出了在聚光透鏡焦點(diǎn)距離為10mm(波長為500nm以下)的情況下，隨不同入射光波長的象散變化的焦點(diǎn)距離。表中的數(shù)值代表焦點(diǎn)的位置(mm)。表1</tables>當(dāng)根據(jù)表1的象散引起的移動的距離長度計(jì)算焦點(diǎn)的光密度時(shí)，其結(jié)果如圖5A-圖5C所示。圖5A是假定波長500nm的光的焦點(diǎn)成直徑為200μm的圓形的象、計(jì)算在該成象位置上的由其它波長(用拉曼移動波數(shù)表示)的光成象的大小(面積)，并把波長為500nm的光的密度作為1時(shí)的計(jì)算密度比的曲線。圖5B和圖5C是分別在移動波數(shù)為-2000cm-1，-4000cm-1的光的焦點(diǎn)位置上進(jìn)行同樣的計(jì)算并把各自波長的光密度作為1時(shí)的結(jié)果。波數(shù)0cm-1為激發(fā)光波長，負(fù)側(cè)為反司托克斯-拉曼范圍，正側(cè)為司托克斯-拉曼和熒光范圍。在圖5B的例中，移動波數(shù)在1000cm-1以上的波長側(cè)密度比已變?yōu)?/2以下。因此，如上所述，通過在比激發(fā)光波長短的短波長側(cè)的焦點(diǎn)位置上配置受光口，可以降低熒光強(qiáng)度密度，使反司托克斯-拉曼散射光密度提高后入射。另外，從圖5A-5C可以看出，通過改變聚光透鏡14和入口狹縫19等與受光口的距離，可以使密度最高，以便可以任意選擇接收光的波長。在實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)處理單元的便攜式計(jì)算機(jī)32中，將表示反司托克斯-拉曼散射的存在概率的圖1的玻爾茲曼分布和通過調(diào)節(jié)分光器的受光口的位置而使激發(fā)光波長短的短波側(cè)的接收光密度增強(qiáng)的因素(圖5B，圖5C)相乘，并對計(jì)算結(jié)果進(jìn)行修正，以便具有按照遍及比激發(fā)光波長短的短波側(cè)的確定范圍內(nèi)的反司托克斯-拉曼散射光的接收光靈敏度一定的方式進(jìn)行計(jì)算的功能。用于實(shí)現(xiàn)該功能的過程展示在圖6A和圖6B中。圖6A表示使反司托克斯-拉曼散射光的接收光靈敏度一定的過程。將分光器的受光口配置在波長比激發(fā)光波長短的光對應(yīng)的焦點(diǎn)位置上，測定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，獲得反司托克斯-拉曼散射光譜。為了使該光譜的靈敏度在遍及確定范圍內(nèi)一定，計(jì)算修正反函數(shù)，然后存儲起來，用該修正反函數(shù)修正已測定的反司托克斯-拉曼散射光譜，然后輸出。接著，如圖6B所示，將分光器的受光口配置在與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測定時(shí)相同的位置上，測定未知的樣品，獲得反司托克斯-拉曼散射光譜。調(diào)出校正反函數(shù)，對該光譜進(jìn)行校正計(jì)算，從而獲得為使接收光靈敏度變?yōu)橐欢ǘＵ^的未知樣品的反司托克斯-拉曼散射光譜。因此，通過進(jìn)行這樣的使接收光靈敏度一定的校正之后，便可以方便地利用光譜強(qiáng)度和光譜的峰面積進(jìn)行定量分析。在圖2的測定裝置中，雖然接收光單元裝備有把從受光口入射的散射光分光并導(dǎo)入光檢測器的分光器，但是也可以在聚光光學(xué)調(diào)整單元16上裝配只使要檢測的反司托克斯-拉曼散射光的移動波數(shù)的光透過的帶通濾光器，而接收光單元不對從受光口入射的散射光分光就可由光檢測器檢測出。圖7和圖8示出了實(shí)際進(jìn)行測定時(shí)所使用的測定裝置，其中與圖2相同的部件用相同的符號表示。在圖7中，由作為激發(fā)光源2的激光裝置發(fā)出的激發(fā)光束4通過棱鏡40產(chǎn)生光路偏轉(zhuǎn)，經(jīng)帶通濾光器6和準(zhǔn)直透鏡8變成細(xì)光束照射在樣品室10的樣品上。樣品室10如參照圖8所詳細(xì)說明的那樣裝備有球形的石英制的流體容器42和保持該流體容器42的積分球形容器支座44。匯聚通過激發(fā)光照射到流體容器42內(nèi)的樣品產(chǎn)生的散射光的聚光光學(xué)系統(tǒng)裝備有作為物鏡的象散小的攝影透鏡12、全息照象頻率特性曲線凹下的濾光器34和具有象散的聚光透鏡14。分光器18和檢測器28如圖2所詳細(xì)示出的那樣。聚光透鏡14裝備有沿其光軸可移動地支撐并通過由個(gè)人計(jì)算機(jī)的位置微調(diào)裝置46控制驅(qū)動的移動器48，以便可以使聚光透鏡14或靠近分光器18的入口狹縫方向或遠(yuǎn)離該入口狹縫方向。為了測定光源強(qiáng)度并可以校正散射光強(qiáng)度，在該測定裝置上設(shè)置校正光學(xué)系統(tǒng)。該校正光學(xué)系統(tǒng)裝備有在橫切帶通濾光器6和單色器8之間的光路沿斜方向配置并取出激發(fā)光束的一部分作為參照光40r的透明板玻璃的分束鏡50、使被該分束鏡50取出的參照光40r的光路偏轉(zhuǎn)的分束鏡52、調(diào)整光量衰減的衰減濾光器54、橫切用于使透過該衰減光濾光器的參照光40r射入分光器18的全息照象頻率特性曲線凹下的濾光器34與聚光透鏡14之間的光路并沿斜方向配置的分束鏡56。參照光40r與來自樣品的散射光一起射入分光器18，與散射光一起被分光，并由檢測器28檢測出。將散射光的檢測強(qiáng)度除以參照光40r的檢測強(qiáng)度，可獲得光源強(qiáng)度變化校正的散射光輸出。在圖7中示出了另外的光源驅(qū)動裝置60和分光器的掃描控制器62，它們被個(gè)人計(jì)算機(jī)32控制。個(gè)人計(jì)算機(jī)32輸入檢測器28的檢測輸出，并對該數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，完成處理裝置的功能。在圖7中還示出了輸出測定數(shù)據(jù)等的輸出裝置64和檢測器28的電源裝置66等。在圖8中示出了在該測定裝置中作樣品室使用的盒42和保持該盒42的盒支座44。盒42是球形的石英制成的流體盒，在球形的流體盒本體的兩側(cè)設(shè)置管狀的入口部60a和出口部60b，球形支座44成積分球形由互相結(jié)合保持盒42的兩部分44a和44b組成，流體盒42裝備有保持流體盒42的球狀部分的積分球部分60、與積分球部分60相連接并保持盒42的入口部60a和出口部60b的保持部62a、62b、激發(fā)光束入射孔64、為了使在盒42內(nèi)產(chǎn)生的散射光沿著與入射光方向成90度角方向取出而朝外方向擴(kuò)展的出射孔66。通過使用這樣的積分球形盒支座使從入射孔64入射的激光束在積分球部分60上多重反射而提高激發(fā)效率，并且匯聚產(chǎn)生的散射光從一個(gè)出射孔66射出，從而增強(qiáng)散射光強(qiáng)度，可以實(shí)現(xiàn)高靈敏度的測定。下面說明測定例子，采用圖7和圖8中所示的測定裝置，將光源的氬離子激光(波長514.5nm，輸出100mW)作為激發(fā)光照射到樣品上進(jìn)行測定。在圖9A和圖9B中示出了利用已有的裝置測定的99％的酮體的拉曼散射光譜，光檢測器的曝光時(shí)間為5秒。圖9B是放大圖。在反司托克斯線側(cè)還觀測到790cm-1附近的C＝0的伸縮振動。其強(qiáng)度比為約0.024，與根據(jù)波爾茲曼分布預(yù)言的理論值(0.0237)相當(dāng)精確地一致。以圖9A，B為代表，在圖10A，B，圖11A，B的光譜中激發(fā)光波長(波長0cm-1)附近的光譜強(qiáng)度也為0這個(gè)事實(shí)是由于在這些光譜中沒有通過參照光測定激發(fā)光強(qiáng)度，而是通過頻率特性曲線凹下的濾光器除去激發(fā)光成分的結(jié)果。圖10A和圖10B是利用圖7、8的裝置測定的例子。光檢測器的曝光時(shí)間為5秒。但是，或這個(gè)實(shí)施例或以下的實(shí)施例在接收由聚光透鏡14聚光的散射光然后引導(dǎo)到分光器的受光口的位置上配置直徑約200μm的單芯光纖的端面，該光纖的另一端被導(dǎo)向分光器18。在這些實(shí)施例的測定中，使受光口的位置靠近聚光透鏡14側(cè)，而不配置在由聚光透鏡14使激發(fā)光波長的光成象的位置上，為使所需要的反司托克斯-拉曼散射光的密度達(dá)到最高，可以調(diào)節(jié)聚光透鏡14的位置。圖10B是圖10A的局部放大圖，790cm-1附近的C＝0伸縮振動的反司托克斯-拉曼線與司托克斯-拉曼線強(qiáng)度的比與圖9的結(jié)果相比約為其的12倍。圖11A和圖11B是用圖7，8的實(shí)施例的裝置測定1M葡萄糖水溶液的拉曼散射光譜，圖11A是顯示的全體象，圖11B是使-200～2000cm-1范圍放大顯示光譜圖。利用激發(fā)光照射的時(shí)間約5秒鐘。顯然，根據(jù)圖11A，B的結(jié)果可以測定葡萄糖水溶液的反司托克斯-拉曼散射。圖12是人尿的散射光譜，大部分是熒光。在為了獲得圖12以下的測定數(shù)據(jù)的測定中，光檢測器的曝光時(shí)間為1秒。圖13，14是用圖7，圖8的實(shí)施例裝置測定在人尿中配制成含有2M葡萄糖的樣品的散射光譜，圖13是表示比激發(fā)光波長的長波側(cè)的+200～+2500cm-1范圍內(nèi)的司托克斯-拉曼散射光譜，圖14是在上述波長短波側(cè)的-200～-2500cm-1范圍內(nèi)的反司托克斯-拉曼光譜。圖13的司托克斯-拉曼散射峰幾乎處在被熒光掩沒的狀態(tài)下。而在圖14的反司托克斯-拉曼散射光譜中可以觀察到明顯的峰。圖15表示用圖7、8的實(shí)施例的裝置測定葡萄糖濃度變化的原樣品的反司托克斯-拉曼散射光譜圖。樣品是把11種濃度不同的葡萄糖水溶液250μl分別混合在11份250μm的人尿中，尿中的葡萄糖濃度按32-1000mg/dl[葡萄糖卡片值(株式會社京都第一科學(xué)制)]配制。圖16是表示在該光譜圖中的-1131cm-1附近的反司托克斯-拉曼散射強(qiáng)度與葡萄糖濃度的相關(guān)關(guān)系圖。在此情況下的相關(guān)系數(shù)R＝0.997，顯示出相關(guān)關(guān)系非常合適?？梢园褕D16的相關(guān)關(guān)系作為檢測線定量分析尿中葡萄糖的濃度。圖17是表示在上述測定的尿和葡萄糖水溶液的混合樣品的反司托克斯-拉曼散射與葡萄糖濃度在-2000～-100cm-1內(nèi)的相關(guān)系數(shù)R的圖。相當(dāng)系數(shù)R在0.9以上的范圍遍及在寬范圍內(nèi)，在這些范圍內(nèi)制作檢測線，便可以定量分析尿中葡萄糖的濃度。雖然圖18與圖17同樣是表示相關(guān)系數(shù)R的反司托克斯-拉曼移動波數(shù)的依存性的圖，但是數(shù)據(jù)濃度范圍變窄為32-514mg/dl的圖。R在0.9以上的范圍變窄。圖19A、B中示出了人的血漿和葡萄糖水溶液的混合液的反司托克斯-拉曼散射光譜。圖19B是圖19A的放大圖。圖20是表示該光譜的-1130cm-1附近的反司托克斯-拉曼散射強(qiáng)度與該葡萄糖濃度的相關(guān)關(guān)系的圖。該測定樣品是在12份250ul的人血漿中分別混合12種濃度不同的葡萄糖水溶液250ul，血漿中葡萄糖濃度被調(diào)制成41，53，66，70，85，95，126，265，520，756，1036mg/dl[葡萄糖卡片值(株式會社京都第一科學(xué)制)和0.5M。這種情況下的相關(guān)系數(shù)R＝0.995，顯示出相關(guān)系數(shù)非常合適?？梢园褕D20的相關(guān)系數(shù)作檢測線定量分析血液中的葡萄糖濃度。圖21是表示人血漿中的葡萄糖濃度與反司托克斯-拉曼散射的-2000～0cm-1的相關(guān)系數(shù)曲線，相關(guān)系數(shù)R在0.9以上的范圍遍及在寬范圍內(nèi)，在這些范圍內(nèi)繪制檢測線可以定量分析血漿中葡萄糖濃度。圖22，23是用圖7、8的實(shí)施例的裝置測定人尿中含酮體的樣品的散射光譜，圖22是表示比激發(fā)光波長長的長波側(cè)的+200～+2500cm-1的司托斯拉曼散射光譜，圖23是表示比激發(fā)光波長短的短波側(cè)的-200～-2500cm-1范圍的反司托克斯-拉曼散射光譜。圖22的司托克斯-拉曼散射峰幾乎處在掩沒在熒光狀態(tài)之下，而在圖23的反司托克斯-拉曼散射光譜上卻可以觀測到明顯的峰。圖24、25是表示利用圖7、8的實(shí)施例的裝置測定的散射光譜測定人尿中含尿素的樣品的散射光譜，圖24是表示比激發(fā)光波長長的長波側(cè)的200～2500cm-1范圍內(nèi)的司托克斯-拉曼散射光譜，圖25是表示在比激光波長短的短波波長側(cè)的-200～-2500cm-1范圍內(nèi)的反司托克斯-拉曼散射光譜。圖24的司托克斯-拉曼散射峰幾乎處在掩沒在熒光狀態(tài)下，而在圖25的反司托克斯-拉曼散射光譜中卻可觀測到明顯的峰。圖26，27是利用圖7、8的實(shí)施例的裝置測定人尿同時(shí)含有葡萄糖、酮體和尿素的樣品的散射光譜，圖26是表示比激發(fā)光波波長長的長波側(cè)的0-2500cm-1范圍內(nèi)的司托克斯-拉羅散射光譜，圖27是表示比激發(fā)光波長短的短波長側(cè)的0～-2500cm-1范圍內(nèi)的反司托克斯-拉曼散射光譜。0cm-1代表激發(fā)光波長，為了校正光源強(qiáng)度的變化同時(shí)檢測參照光。圖26的司托克斯-拉曼散射峰幾乎處在掩沒在熒光的狀態(tài)下，而在圖27的反司托克斯-拉曼光譜中可以觀察到明顯的峰。配制同時(shí)含葡萄糖、酮體和尿素的10種人尿樣品，下面示出了測定的各峰值強(qiáng)度與濃度的相關(guān)關(guān)系。樣品按表2所示那樣配制。樣品號葡萄糖濃度酮體濃度尿素濃度(mg/dl)(mg/dl)(mg/dl)11206.5835.622404.7042.735205.6428.543202.8221.454201.883.5766303.767.1477400.9414.28800.5050.091602.3525.0103801.4115.7圖28是表示反司托克斯-拉曼散射光譜中的-1130cm-1附近的峰值強(qiáng)度與葡萄糖濃度的相關(guān)關(guān)系的圖。這時(shí)的相關(guān)系數(shù)為R＝0.92，表現(xiàn)出合適的相關(guān)關(guān)系。把圖28的相關(guān)關(guān)系繪制成檢測線可以定量分析含有多種成分的尿中的葡萄糖。圖29是表示反司托克斯-拉曼散射光譜中的-789cm-1附近的峰值強(qiáng)度與酮體濃度的相關(guān)關(guān)系。這時(shí)的相關(guān)系數(shù)R＝0.95，表現(xiàn)出合適的相關(guān)關(guān)系。把圖29的相關(guān)關(guān)系繪制成檢測線可以定量分析含有多種成分尿中的酮體濃度。圖30是表示反司托克斯-拉曼散射光譜中的-1016cm-1附近的峰值強(qiáng)度與尿素濃度的相關(guān)關(guān)系圖。這時(shí)的相關(guān)系數(shù)為R＝0.93，表現(xiàn)出合適的相關(guān)關(guān)系。把圖30的相關(guān)關(guān)系繪制成檢測線可以定量分析含有多種成分的尿中的尿素濃度。權(quán)利要求1利用激發(fā)光照射樣品產(chǎn)生的散射光中的反司托克斯-拉曼散射光測定樣品中被分析物質(zhì)的測定方法。2在權(quán)利要求1的測定方法中，把樣品中的被分析物質(zhì)濃度與反司托克斯-拉曼散射強(qiáng)度間的相關(guān)性合適的移動波數(shù)選擇為該被分析物質(zhì)的固有測定移動波數(shù)，檢測在該測定移動波數(shù)的反司托克斯-拉曼散射強(qiáng)度，利用檢測線定量分析被分析物質(zhì)。3在權(quán)利要求2的測定方法中，測定的移動波數(shù)能使被分析物質(zhì)的波度與反司托克斯-拉曼散射強(qiáng)度間的相關(guān)關(guān)系的相關(guān)系數(shù)R為0.6以上，最好為0.8以上。4在權(quán)利要求1的方法中，樣品是生物物質(zhì)。5一種測定裝置，該裝置包括裝有激發(fā)光源將激發(fā)光照射在樣品上的激發(fā)光源單元；將上述激發(fā)光照射到樣品上并匯聚從樣品中產(chǎn)生的散射光的聚光光學(xué)調(diào)整單元；從被上述聚光調(diào)整單元匯聚的散射光中在已提高反司托克斯-拉曼散射光的接收密度狀態(tài)下利用光檢測器檢測出上述散射光的接收光單元。6在權(quán)利要求5的測定裝置中，上述聚光調(diào)整單元作為聚光系統(tǒng)裝備有具有象散的透鏡，上述接收光單元在比激發(fā)光波長短的短波長的光成象位置上具有受光口，并檢測從該受光口入射的散射光。7在權(quán)利要求6的測定裝置中，上述接收光單元裝備有對從受光口入射的散射光進(jìn)行分光并引導(dǎo)到上述光檢測器的分光器。8在權(quán)利要求6的測定裝置中，上述聚光光學(xué)調(diào)整單元裝備有只使需要檢測的反司托克斯-拉曼散射光的移動波數(shù)的光透過的帶通濾光器，上述接收光單元不對從上述受光口入射的散射光進(jìn)行分光就可以用上述光檢測器檢測。9在權(quán)利要求5的測定裝置中，上述激發(fā)光源單元裝備有只使照射在樣品上的激發(fā)光波長透過的帶通濾光器。10在權(quán)利要求6的測定裝置中，上述聚光光學(xué)調(diào)整單元在上述具有象散的透鏡的光入射側(cè)裝備有將樣品產(chǎn)生的散射光匯聚并作為平行光導(dǎo)向上述具有象散的透鏡的象散小的透鏡。11在權(quán)利要求5的測定裝置中，上述聚光光學(xué)調(diào)整單元裝備有為了除去激發(fā)光波長成分而在頻率特性曲線凹下的范圍內(nèi)包含激發(fā)光波長的全息照象頻率特性曲線凹下的濾光器。12在權(quán)利要求11的測定裝置中，上述激發(fā)光源單元裝備有只使照射在樣品上的激發(fā)光波長的光透過的帶通濾光器，上述頻率特性曲線凹下的范圍與上述帶通濾光器的帶通范圍相對稱。13在權(quán)利要求5的測定裝置中，上述聚光光學(xué)調(diào)整單元裝備有為了除去激發(fā)光波長及比其波長長的長波長側(cè)的光的截止濾光器。14在權(quán)利要求7的測定裝置中，上述接收光單元的受光口為權(quán)利要求6所記載的測定裝置的分光器入口狹縫。15在權(quán)利要求6的測定裝置中，上述接收光單元的受光口是單芯光纖的一個(gè)端面，該光纖的另一端面被引導(dǎo)到分光器或光檢測器。16在權(quán)利要求6的測定裝置中，上述聚光光學(xué)調(diào)整單元的具有象散的透鏡與受光口間距離是可調(diào)整的。17在權(quán)利要求5的測定裝置中，上述樣品單元裝備有球形的盒和使保護(hù)該盒的球形部分成為球形反射面的積分式球形盒支座。18在權(quán)利要求5的測定裝置中，還裝備有取出激發(fā)光的一部分作為檢測參照光用的光學(xué)系統(tǒng)。19在權(quán)利要求5的測定裝置中，還裝備有數(shù)據(jù)處理單元，該數(shù)據(jù)處理單元將表示反司托克斯-拉曼散射的存在概率的玻爾茲曼分布和反司托克斯-拉曼散射光的接收光密度增強(qiáng)因素相乘，對該結(jié)果進(jìn)行修正，為了使反司托克斯-拉曼散射光的接收光靈敏度一定而進(jìn)行計(jì)算。全文摘要從激光器(2)發(fā)出的激光光束(4)通過帶通濾光器經(jīng)準(zhǔn)直透鏡(8)照射在樣品上。為了接收來自樣品(10)的散射光設(shè)置有攝影透鏡(12)和聚光透鏡(14)的光學(xué)調(diào)整單元(10)，攝影透鏡(12)接收樣品(10)產(chǎn)生的散射光并使之平行。聚光透鏡(14)是具有象散的透鏡，并將來自攝影透鏡(12)的平行光匯聚。在聚光透鏡(14)時(shí)匯聚光位置上設(shè)置分光器(18)的入口狹縫(19)作為受光口，該入口狹縫(19)的直徑約20μm。入口狹縫(19)配置在使光具有象散的聚光透鏡(14)匯聚反司托克斯—拉曼散射光的位置上。文檔編號G01J3/44GK1159578SQ9612246公開日1997年9月17日申請日期1996年9月20日優(yōu)先權(quán)日1995年9月20日發(fā)明者尾崎幸洋,山口佳則,竇曉鳴,上野山晴三申請人:株式會社京都第一科學(xué)