專利名稱：光學篩選顯微細胞的方法和儀器的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及為研究或診斷目的而鑒別或篩選細胞的方法和儀器。更具體講，本發(fā)明涉及光學鑒別有或沒有特殊表面分子的細胞，其是用常規(guī)染色方法來觀察細胞的形態(tài)特征，例如對癌癥的辨別。
染色的細胞是常規(guī)細胞形態(tài)研究的基礎。一般是將細胞放在載玻片上，然后染色，再通過顯微鏡對其進行光學和肉眼觀察。由顯微圖像得到的光學或肉眼信息也可被用于自動掃描儀中，如圖像分析儀。
19世紀后葉，Ehrlieh報道了血細胞的生態(tài)學，生理學和病理學，其通過建立檢測和區(qū)別白血病和貧血的方法將血液學帶進了新紀元。Ehrlih觀察到酸性，堿性和中性染料與細胞成份如白血細胞(WBC)的顆粒和胞核有專一反應。
Romanowsky通過將多色染色用于細胞而進一步發(fā)展了血液學。目前，Wright染色(對Romanowsky染色的修飾)常被用于細胞的視覺檢測。將外周血涂片染色并通常用于對異常形態(tài)變化的視覺檢查。細胞類型的分類和細胞分化的階段在鑒定疾病的方法中是關鍵因素。盡管可利用自動血液分析儀和流動血細胞計數(shù)器，但仍需要對細胞的直接視覺(顯微的)評估。
當在外周血涂片上發(fā)現(xiàn)異常時，免疫研究也是重要的。因此測定白血病的特殊亞類以便更好地選擇治療疾病方法并盡可能地給患者提供專一的預后是必要的。例如，在急性白血病中，外周血中的胚細胞顯著增加。由于缺乏分化，鑒別這些未成熟的細胞是淋巴細胞還是粒細胞是困難的。如果快速繁殖的胚細胞亞群被發(fā)現(xiàn)是帶T11受體，則白血病可分類為急性成淋巴細胞白血病(ALL)，T-細胞類。一般講，T譜系ALL要比B譜系ALL的預后差。另外，也常常根據(jù)它們的分化程度，將這些白血病進一步分成亞組。組Ⅰ和組Ⅱ顯示出在早期胸腺前體細胞上可見的抗原;而在組Ⅲ中表達的那些與在成熟T細胞上發(fā)現(xiàn)的表面抗原相似。
免疫實驗首先通過利用光學顯微鏡測定淋巴細胞的亞類而發(fā)展起來的。Coombs和其它人在1970年觀察到了人淋巴細胞和羊血紅細胞(RBC)間形成的玫瑰花結(jié)。后者研究發(fā)現(xiàn)，所有或至少大部分胸腺衍生的淋巴細胞(T-細胞)在適宜條件下都會顯出玫瑰花結(jié)形成現(xiàn)象。這些研究利用了Ficoll分離的淋巴細胞并且采用光顯微鏡，用適宜的時間對分離的淋巴細胞進行了亞型分類。
現(xiàn)在淋巴細胞亞類通常是在帶有熒光標記的單克隆抗體的樣品中對細胞進行熒光標記來測定。該熒光標記的單克隆抗體結(jié)合到表達抗原的細胞表面上的抗原上。細胞樣品然后通過用熒光顯微鏡或高尖端流動血細胞計數(shù)儀分析。當用流動血細胞計數(shù)儀時，必須由專門訓練的技術(shù)人員進行細胞樣品的制備，數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析。流動血細胞計數(shù)儀包括激光和復雜的光學系統(tǒng)，高能量計算機和電及流體系統(tǒng)。流體血細胞計數(shù)儀的部件系統(tǒng)必須定期和經(jīng)常地進行維護和校準。雖然目前流動血細胞計數(shù)儀是作為淋巴細胞亞類的測定或癌癥免疫表現(xiàn)型的標準方法，但該方法仍有幾個缺陷，這包括儀器價格昂貴，需要正確操作該儀器的專門技能。流動血細胞計數(shù)法對一般病理學家來講的另一個缺點是只有大的機構(gòu)能負擔流動血細胞計數(shù)儀的費用。另外，送樣品到另一機構(gòu)進行流動血細胞計數(shù)分析往往需3天或更多天才能得到結(jié)果。因此，對一般病理學家來講最好是有一種快速，廉價，簡單和容易的篩選方法。
淋巴細胞亞類也可利用由本發(fā)明的受讓人，Coulter Electronics，Inc，開發(fā)的自動儀和方法來測定。一種改善的簡單自動儀和用其的方法披露于US申請?zhí)?87，646，1990，9，20提出，標題為“AUTOMATED ANALYZER AND METHOD FOR SCREENING CELLS OR FORMED BODIES FOR ENUMERATION OF POPULATIONS EXPRESSING SELECTED CHARACTERISTICS”，其是1987，3，13提出的同一標題的US申請?zhí)?25，345的繼續(xù)申請。該申請將電子視覺孔徑原理，用于鑒定和/或計算所定義的胞群或形成的群體的選擇生物分子的專一性和顯微鏡材料技術(shù)結(jié)合起來。自動分析儀可和特殊的溶解試劑和/或偶聯(lián)到顯微中心球或變化組分的支持物上的抗體合起來使用。
第二個申請，US系列號285，856，1988，12，16提出，標題為“METHOD AND APPARATUSFOR SCREENING CELLS OR FORMED BODIES WITH POPULATIONS EXPRESSING SELECTED CHARACTERISTICS”，披露了從全血樣品或部分全血樣品直接篩分亞類。
第三個申請，US號339，156，1989，4，14提出，標題為“METHOD AND APPARATUS FOR SCREENING CELLS OR FORMED BODIES WITH POPULATIONS EXPRESSING SELECTED CHARACTERISTICS UTILIZING AT LEAST ONE SENSING PARAMETER”，披露了多份或五份白血細胞差別，淋巴細胞亞類和由全血樣品或帶血紅細胞和/或通過消除群體排除了白血細胞的群體和/或帶有一或多種光或電參數(shù)的白血細胞亞類的樣品進行的重疊測定。
第四個申請，US No.07/525，231，1990，5，17提出，標題為“METHOD AND APPARATUS FOR SCREENING OBSCURED OR PARTIALLY OBSCURED CELLS”，披露了暗細胞分析，其是利用具有能結(jié)合到暗細胞上的專一抗體中心球產(chǎn)生由一個細胞群體到另一細胞群體的暗色細胞的辨別特征。上述四篇對比申請在此收入為參考文獻。
實現(xiàn)本發(fā)明的方法和儀器可用各種免疫反應，如包括反應物和形成的胞體或細胞的免疫反應。本發(fā)明也用于形成的胞體懸浮液分析，如其中的一些細菌和病毒。這里所用的細胞定義為動物或植物細胞，其包括細胞類細菌，真菌，它們是分開辨別的或在聚集中辨別的。細胞是能以獨立單位起作用的生命物質(zhì)的最小結(jié)構(gòu)聚集。例如，細胞可是人體血紅細胞(RBC)和WBC群體，來自組織或血樣的癌細胞或其它異常細胞。形成的胞體定義為一些細菌和病毒，細胞和形成的胞體適宜標記。這樣它們就能按與鑒別人體血細胞的同樣方式，通過本發(fā)明的方法和儀器進行光學鑒別。
雖然已在上面申請中使用的術(shù)語“反應物”定義為溶解劑和單克隆抗體，但反應物包括各種試劑，它們可檢測和與細胞或形成的胞體上的一或多個專一分子反應。一些實例如下反應物 專一性分子抗體 抗原藥 藥物受體激素 激素受體生長因子 生長因子受體這些反應物可偶聯(lián)或結(jié)合到細胞上的專一分子上。這些反應物是起化學反應的部分;但這些反應物不必進行化學變化。
先有技術(shù)中披露了用光學顯微鏡和抗體標記的中心球測定淋巴細胞亞型的方法。該方法來自加利福尼亞，Richmond的Bio-Rad實驗室。該方法可鑒別T和B淋巴細胞?？贵w標記的中心球被用來結(jié)合到顯有所需表面抗原的細胞上。兩種不同顏色的抗體標記的中心球被用來區(qū)別T和B淋巴細胞。顯微學家通過抗體標記中心球結(jié)合到細胞上來鑒別對具體抗原呈陽性的細胞。沒有抗體標記的中心球結(jié)合到其上的細胞代表了陰性細胞群體，其表達不令人感興趣的抗原。但該方法受到這樣的限制，即淋巴細胞必須利用分離介質(zhì)，如Ficoll-Hypaque，首先從全血樣品中分離出來。粒細胞污染可導致假的非陽性細胞值增加和吞噬細胞數(shù)目的增加。另外，由于首先從全血細胞中去除了其它細胞，因此僅能進行淋巴細胞亞型測定。另外由于這些細胞不是用常規(guī)Romanowsky或Wright類染色，而染色僅用于測定細胞的存活性，因此，限制了細胞形態(tài)學評估。又由于細胞是在懸浮液中而不是在常規(guī)的載玻片上評估的，從而進一步限制了形態(tài)學評估。
本發(fā)明提供一種光學篩選細胞的方法和儀器以鑒定細胞的形態(tài)和細胞所表達的特性。將細胞與一或多個不同組的中心球混合，每組中心球上都結(jié)合有可與某種特異性分子結(jié)合的反應物，該特異分子可存在于一種或多種類型的細胞上。將細胞和中心球在載玻片上制成涂片并用賴特氏型染色劑染色。然后由操作人員和/或自動地觀測細胞，如果有的話，則可鑒定與不同的中心球結(jié)合的細胞的類型。
樣品可以是任何細胞懸液，例如得自全血樣品或其一部分，在樣品中可除去紅血細胞或保持紅血細胞完整。中心球組可單獨或同時混入相同或不同的樣品部分，最好與之混合。不同的中心球組具有為光學差異的不同光學特性。中心球組之間的不同光學特性可為顏色、大小、形狀或其組合特性。
當血樣中包括大量對特異性抗原呈陽性的細胞時，則出現(xiàn)成群的細胞?？赡繙y或光學觀測細胞群作為快速篩選程序。據(jù)觀察細胞群在混合容器中形成聚集的邊緣或在載片上呈顯微凝集。
也可利用可與一種或多種類型的細胞上的某種特異性分子結(jié)合的第一反應物光學篩選細胞。作為一個例子，第一反應物可以是以不足以先與一組中心球結(jié)合的濃度獲得的。在這種情況下，可將第一反應物與細胞混合而使細胞結(jié)合其上，然后將具有與之結(jié)合的第二反應物的一組中心球加到第一反應物與細胞的混合物中。在這種情況下第二反應物是可與第一反應物結(jié)合以使中心球與細胞結(jié)合的類型。與中心球結(jié)合的第一反應物和第二反應物也可與細胞同時混合。同樣，與中心球結(jié)合的第二反應物可與第一反應物混合以使第一反應物與第二反應物結(jié)合，然后具有與之結(jié)合的第一和第二反應物的中心球可與細胞混合。
特異性分子可以是存在于樣品中的癌細胞的特異性分子?？蓪┘毎瞥梢环N或多種樣品涂片，用一或多個不同組的中心球加以鑒定。這就提供了一種獲得癌癥篩選信息的簡單而快速的方法，病理學家可以此來進行治療和預后或免除制作一種或多種進一步的涂片或其它流動細胞檢測程序。


圖1是本發(fā)明的一種光學篩選分析儀實施方案的方框圖;
圖2是本發(fā)明的第二種光學篩選分析儀實施方案的方框圖;
圖3是本發(fā)明的特定光學篩選分析儀實施方案的方框圖;
圖4是染色后的載玻片的光學圖像，它顯示了中心球與某一特異性細胞抗原的結(jié)合;
圖5是染色后的載玻片的光學圖像，它顯示了中心球與不同的特異性細胞抗原的結(jié)合;
圖6是染色后的載玻片的光學圖像，它顯示了中心球與表明CLL類型的進一步不同的特異性細胞抗原結(jié)合;
圖7是染色后的載玻片的光學圖像，它顯示了中心球不與進一步分化的CLL類型的另一種特異性細胞抗原的結(jié)合;
圖8是染色后的載玻片的光學圖像，它顯示了中心球與嗜中性白細胞上某一特異性細胞抗原結(jié)合;
圖9是著色不同的中心球的光學圖像，它顯示了中心球與嗜中性白細胞上另一種特異性細胞抗原結(jié)合;
圖10是圖8和圖9的著色不同和大小不同的中心球的光學圖像，它顯示了不同的中心球與嗜中性白細胞上不同的細胞抗原結(jié)合;
圖11是中心球與一種類型的細胞上特異性細胞抗原結(jié)合而不與其它類型細胞上的抗原結(jié)合的光學圖像;
圖12是染色后的載玻片的光學圖像，它顯示了中心球與一種類型的細胞上不同的特異性細胞抗原結(jié)合而不與其它類型細胞上的抗原結(jié)合;
圖13是染色后的載玻片的光學圖像，它顯示了其上結(jié)合有第二反應物的中心球與可與細胞上特異性細胞抗原結(jié)合的第一反應物結(jié)合;
圖14是染色后的載玻片的光學圖像，它顯示了中心球與骨髓中的嗜中性白細胞上特異性細胞抗原結(jié)合;
圖15是染色后的載玻片的光學圖像，它顯示了中心球不與被懷疑的HTLV-1樣品中的第一種特異性細胞抗原結(jié)合;
圖16是染色后的載玻片的光學圖像，它顯示了中心球與圖15所示的被懷疑的HTLV-1樣品中的第二種特異性細胞抗原結(jié)合。
參見圖1，本發(fā)明的第一種光學細胞篩選實施方案一般以參照符號10表示。光學細胞篩選儀10包括生物樣品12，該樣品至少包含第一組生物細胞(未示出)，如全血樣品中或來自全血樣品的細胞。
樣品12通過線路14與至少一種通過線路18的反應物16合并。反應物16可包括一種螯合劑，如標準EDTA，它作為抗凝血劑，加到樣品12中以便阻止嗜中性白細胞吞食中心球。
反應物16也包括多組或第一組中心球，其具有對可存在于與之結(jié)合的至少一種類型的細胞上的特定抗原有專一性的抗體。對于血液，細胞可表達可與一種或多種特異性抗體結(jié)合的抗原。一般來說，抗原是抗體可與之結(jié)合的分子，因此，對于血液或其它活細胞，反應可被規(guī)定為第一種類型的分子與第二種類型的分子特異地進行化學反應。然后合并的樣品12和反應物16最好用按功能命名的混合臺20進行混合。然后將一部分混合物置于載玻片上，用按功能命名的涂片制備臺22制做涂片。然后在按功能命名的染色臺24內(nèi)給涂片染色。
染色應為一種可用于區(qū)分各種細胞特性的組織學染色。對于血液細胞，染色最好是如前所述的所謂“賴特氏”型染色，染色后便可在常規(guī)情況下用顯微鏡區(qū)分細胞的形態(tài)。一些可用于本發(fā)明方法的其它類型的組織學染色劑的實例有蘇木精、結(jié)晶紫和吉姆薩氏血液染劑。蘇木精可用作一般的組織染色顯示動物組織中的細胞核。結(jié)晶紫可用作細菌染色顯示被膜。吉姆薩氏血液染色可用于顯示白細胞、立克次氏體、細菌和內(nèi)含體的區(qū)別。然后用光學分析儀26光學觀測染色后的載玻片。光學篩選載玻片上的細胞以確定哪些類型的細胞上結(jié)合有中心球。這可鑒定細胞上是否存在特定的受體或抗原并由此鑒定樣品的狀態(tài)，這一點將在下文中進一步描述。
在光學篩選儀器10中，樣品12或者是全血樣品，其中保留有紅血細胞或者只是有或無血小板或RBC'S和所有WBC群體的部分全血樣品。本發(fā)明的第二種光學細胞篩選儀實施方案一般以參考符號28表示，可參見圖2。光學細胞篩選儀28包括生物樣品30，該樣品可以是全血樣品，也可以是至少包括白血細胞的血液樣品。生物樣品30也可得自其它生物流體或組織，即骨髓、尿、脊髓液或胸膜液或淋巴腺。
需要時，紅血細胞可用按功能命名的去除臺32從混合物中除去。紅血細胞也可以多種方式用去除臺32從混合物中除去。紅血細胞可被細胞溶解劑溶解。下文中描述了一種這樣的優(yōu)選細胞溶解劑和可與之一起使用的猝滅劑。紅血細胞也可用多個磁性中心球除去，中心球上具有與之結(jié)合的紅血細胞特異的抗體(未示出)。被結(jié)合的紅血細胞保留在磁場中，除去剩余的樣品以除去紅血細胞。例如，可以使用的一種特定的紅血細胞特異性抗體公開于美國專利4，752，563，題為MONOCLONAL ANTIBODY FOR RECOVERY OF LEUKOCYTES IN HUMAN PERIPHERAL BLOOD AND METHOD OF RECOVERY EMPLOYING SAID MONOCLONAL ANTIBODY，本文授引該文獻作為參考。除了樣品緩沖液之外或代替樣品緩沖液，可包括一種緩沖液。也可使用優(yōu)選的RBC細胞溶解劑和紅血細胞特異性中心球的組合物。有關紅血細胞去除的詳細情況可參見本文前面提到的本發(fā)明受讓人的4個申請。
然后樣品30通過線路34與通過線路38的反應物合并。合并的樣品30和反應物32最好混合起來?？稍诖耸褂玫暮线m的混合儀器可詳見1990年5月1日提交的題為METHOD AND APPARATUS FOR RAPID MIXING OF SMALL VOLUMES FOR ENHANCING BIOLOGICAL REACTIONS的美國專利申請517，309，該申請是1987年5月13日提交的同一題目的美國專利申請025，337的繼續(xù)申請，在此援引作為參考。需要的話，通過使用混合器可加快反應速度，而不會明顯破壞細胞重要特性。混合器20可利用相同類型的混合儀器，但也可以是其它類型的溫和混合儀器，例如簡單的輥筒式搖擺器，因為反應速度并不是至關重要的。
然后用載玻片制備臺40將一部分去除了紅血細胞的混合物在載玻片上濃縮，制成涂片。一旦經(jīng)濃縮令人感興趣的細胞和除去過量的水份(如通過載玻片離心分離)制得載玻片后，立即按前述方法在染色臺42內(nèi)給載玻片染色。然后再用分析儀44對染色后的載玻片作光學分析，分析儀44可以與分析儀26相同。關于在與反應物36混合之前紅血細胞的去除，見光學細胞篩選儀28。一般來說，當用磁性中心球去除紅血細胞時這是優(yōu)先選用的。這也可使用較少的令人感興趣的中心球，因為去除紅血細胞后就不會干擾中心球的結(jié)合了。當使用細胞溶解劑時，最好是在反應物36和樣品30合并之后去除紅血細胞，這樣細胞暴露于細胞溶解劑的時間較短。
自動或半自動光學細胞篩選儀實施方案示于圖3，一般以參照符號46表示。光學細胞篩選儀46包括樣品制備儀48，它可在需要時除去紅血細胞或血小板和加入一個或多個有不同抗體結(jié)合其上的不同的中心球組，其中的抗體對可存在于樣品中的一種或多種類型的細胞上的不同抗原是特異的。樣品制備儀48也最好使樣品與中心球混合以便細胞與中心球迅速結(jié)合。
然后用載玻片制備儀50將等分試樣或一部分制得的樣品在載玻片上制成涂片。載玻片制備儀50可以是含有紅血細胞的載玻片的常規(guī)載玻片制備儀，也可以是用于去除了紅細胞的樣品的載玻片旋轉(zhuǎn)儀。
然后在染色儀52內(nèi)給載玻片染色。一旦將載玻片染色后?？闪⒓从霉鈱W顯微鏡54光學觀測或分析樣品。光學顯微鏡54可有多個輸出端，即供使用者雙眼觀看的目測輸出端56，拍攝細胞和中心球照片用的照相機輸出端58，除目測輸出端56之外的可供使用者觀測用的錄像輸出端60，從顯像輸出端60可制得掃描帶，和圖像分儀機輸出端62，它可自動掃描和鑒定細胞的形態(tài)及中心球的顏色和/或大小?？墒褂枚喾N類型的常規(guī)圖像分析儀，例如Inovision Corp Research Triangle Park，North Carolina銷售的圖像分析儀和Perceptics Corpora-tion，Knoxville，Tennessee銷售的Bio Vision工作臺。
對于血液樣品，每種生物樣品含有至少第一組生物細胞(未示出)，包括至少一種白血細胞群體，其具有至少一種可定義的亞型，例如全血樣品中或來自全血樣品的白血細胞群體。如本文所使用的，白血細胞亞型是特異性單克隆抗體可與之結(jié)合的白血細胞群體的亞型。世界衛(wèi)生組織和國際免疫學學會已為單克隆抗體下了定義。單克隆抗體已用定義細胞或細胞群的特異性的群集標示(CD)命名法定義，這些單克隆抗體對該CD群是特異的。在下列實例例中使用了某些CD群。表Ⅰ中示出了單克隆抗體的命名、特異性和一些商業(yè)來源。
表Ⅰ區(qū)分的群 抗體 特異性(商業(yè)來源)CD2(gp50) T11(Coulter) E玫瑰花結(jié)受體OKT11(ortho);
Leu5a(BD)CD4(gp56) T4(Coulter) 助細胞/誘導劑TOK4a(ortho);
Leu3a(BD)CD5(gp67) T1(Coulter) 所有成熟的T-細胞，成熟的淋巴細胞，B-細胞亞型CD7(gp40) 3A1(Coulter) T-細胞，多數(shù)T-ALLCD8(gp32-33) T8(Coulter) 細胞毒性/抑制劑TOKT8(Ortho);
Leu2a(BD)
CD10(gp100) J5(Coulter) 普通急性淋巴母細胞抗CALLA(BD) 白血病抗原，前B細胞，粒細胞CD13(150) MY7(Coulter) 單核細胞，粒細胞，CF11-6CD14(gp55) MO2，MY4(Coulter) 單核細胞，少數(shù)粒細胞CD19(gp95) B4(Coulter) 黑猩猩B細胞，前BALLCD20(gp35) B1(Coulter) 除血漿細胞外的所有Leu16(BD) B細胞，B腫瘤細胞骨髓瘤除外，一些非T-ALL細胞CDW29(gp135) 4B4(Coulter) 助細胞/誘導劑TCD33(gp67) MY9(Coulter) 早期髓樣前期細胞，髓樣細胞，AML
CD34(gp115) HPCA-1(BD) 髓樣前期細胞CD41(p130，115) PLT-1(Coulter) 血小板和巨核細胞agp-分子量為4道爾頓的糖蛋白Coulter-Coulter Immunology Division of Coulter Corpora-tion(Hialeah，F(xiàn)lorida)BD-Becton-Dickimson免疫細胞測定系統(tǒng)ortho-ortho診斷系統(tǒng)(Raritan，New Jersey)另外，可舉例說明的有三種其它抗體，它們尚無CD命名。一種抗體是N特異性抗體，公開于美國專利4，931，395，題為MONOCLONAL ANTIBOOY SPECIFIC TO NEUTROPHILS。第二種抗體是N和E特異性抗體，公開于美國專利4，865，971，題為MONOCLONAL ANTIBODY SPECIFIC TO A COMMON DETERMINANT SITE OF NEUTROPHILS AND EOSINOPHILS，在此授引這兩篇專利文獻作為參考。第三種抗體是所謂HLA-DR(p29/34)，如Coulter提供的I3，其對MHCⅡ類HLADR、單核細胞、巨噬細胞、B細胞和活化T-細胞具有特異性。
雖然并非所有CD的實例都有一個以上的所列商業(yè)來源，但實際上所有CD的實例都可從上面所列的一個以上來源或其它易于辨認的商業(yè)來源獲得。
所用的磁性中心球可以是任何適宜類型的，在實施例中使用的是直徑為0.7和1.3微米，具有10%(重量/體積)固體的聚苯乙烯磁性中心球(Bangs Laboratories of Carmel，Indiana銷售的產(chǎn)品)。非磁性中心球也可以是任何適宜類型的，在實施例中使用的是直徑1.05，2.17和3.06微米，具有8%(重量/體積)固體的無表面活性劑硫酸化聚苯乙烯膠乳中心球(Inter-facial Dynamics of Protland，Oregon銷售的IDC中心球)。
雖然這些特異性中心球用于舉例說明，但也可使用其它常規(guī)來源的其它類型和大小的中心球。一般說來，最好使用直徑為5微米或更小的中心球，因為有多個中心球結(jié)合到每個細胞上較好。同樣，用較小尺寸的中心球可更好地保持載玻片和細胞的形態(tài)。然而，也可使用較大直徑的中心球，10微米直徑的非磁性中心球已被采用。但在這種情況下，多個細胞將與每個中心球結(jié)合，而不是多個中心球與每個細胞結(jié)合。
可以看出本發(fā)明的方法是足夠特異的，單個的中心球即可表明抗原/受體存在于細胞上。然而，為了消除由于重合造成的潛在的假讀數(shù)，認為只有結(jié)合兩個或多個中心球的細胞才表明受體存在。一般來說，根據(jù)中心球的數(shù)目/濃度不同，一個以上的中心球?qū)⑴c每個顯示特定抗原/受體的細胞結(jié)合。
一般來說，操作步驟如下1.將完全混合的全血加到EDTA管中(即試管中已含有EDTA)，如果未在EDTA中采血。血液最好在EDTA中采集。
2.從EDTA管中取100μl血液加到試管中。
3.將適量的中心球加到血液中并渦旋混合物大約2-3秒鐘。
4.蓋上試管并溫和混合一段時間以使細胞與中心球結(jié)合。已發(fā)現(xiàn)大約10分鐘就足夠了。
5.混合后，取出等分試樣，制做血液涂片。涂片應類似于常用于計數(shù)差異的外周血涂片。
6.當載玻片完全干燥后，用賴特氏或賴特氏/吉姆薩氏染劑染色，染色方法與常規(guī)不同載玻片的染色方法相同。
7.用表明具有與之連接的中心球的細胞的40×或100X物鏡在油浸沒透鏡上觀看載玻片。
8.當某種細胞類型與兩個或多個中心球牢固結(jié)合時可看到定量的陽性結(jié)果。細胞群體中特殊抗原的陽性程度可反映在被中心球結(jié)合的群體的細胞數(shù)目上。
按照總的白細細計數(shù)所建議的中心球與全血之比如下
白血細胞計數(shù)(細胞/μl)(1.17微米中心球的1%溶液)0-20，000 10μl20，001-75，000 20ml大于75，000 30ml如果需要排空血小板，則在將血液加到試管(上述步驟2)之前使用下列程序。
1.將200μl EDTA抗凝全血加到試管中。
2.加入20μl磁性PLT-1中心球。
3.混合一段足夠的時間以使細胞與中心球結(jié)合。已發(fā)現(xiàn)15秒至2分鐘的時間就足夠了。
4.置于磁場中5分鐘。
5.除去上清液(從全血中除去具有結(jié)合的血小板的中心球)。
6.用于上述步驟2。
圖4說明了利用本發(fā)明的方法所確定的CD2對淋巴細胞的專一性。許多結(jié)合有T11專一性抗體的非磁性中心球64已顯示被結(jié)合至RBC′S68還未被除去的載玻片上的淋巴細胞上。有一些游離(未結(jié)合)的T11中心球64′。嗜中性白細胞70證實了T11中心球64的專一性，因為它們不與嗜中性白細胞70結(jié)合。
盡管附圖是按照標準的繪圖習慣繪制成黑白的，但是實際的染色載玻片是有色的。關于這一點，如同常規(guī)，各種細胞的顏色如下嗜中性白細胞細胞質(zhì)為線粉色且較小，各種顆粒為線粉色至藍黑色。細胞核為深藍紫色。
胚細胞細胞質(zhì)為藍色且染色不均勻，細胞核為紫色。
淋巴細胞細胞質(zhì)為藍色，細胞核為深藍紫色。
嗜曙紅細胞細胞質(zhì)被染色成紅橙色的大型球狀顆粒所遮蔽。細胞核為深藍紫色。
單核細胞細胞質(zhì)為藍灰色，細胞核為深藍紫色。
嗜堿性細胞顆粒體為深紫色，細胞核為輕淺的線色。顆粒體遮蔽了細胞質(zhì)。
紅血細胞細胞為紅色，但中部顏色較淺。
血小板細胞為線藍色，具有較少的藍色顆粒。
另外，磁性類型的中心球為紅棕色，非磁性中心球為白色。這使得細胞和中心球彼此易于區(qū)別。根據(jù)需要，中心球也可以是產(chǎn)生差異的其它顏色、大小和形狀。
圖5顯示了結(jié)合了4B4專一性抗體的許多非磁性中心球72與許多的血小板74結(jié)合，而這些血小板似乎是由中心球72團聚在一起。由于4B4專一性抗體如所示的那樣與血小板結(jié)合并且也將與某些L′S結(jié)合，因此在對樣品進行4B4型L′S分析前，首先應排空血小板。
圖6說明了結(jié)合有B1專一性抗體的許多中心球76與存在B細胞CLL的淋巴細胞78結(jié)合。中心球76是3μm的中心球，而中心球64和72則是2μm的中心球。該圖顯示了許多淋巴細胞78上結(jié)合了中心球76，暗示了B細胞CLL的存在，因為正常血液中很少有L′S為B1型淋巴細胞。
圖7中，淋巴細胞78在另一樣品部分中再次與許多中心球80混合，該中心球80上結(jié)合了J5專一性抗體。中心球80將與某些類型的CLL結(jié)合。因此，中心球80的未結(jié)合(已顯示兩個游離的中心球80連接一個RBC68)則說明淋巴細胞78缺乏J5結(jié)合的CALLA。
圖8說明的是三種中性白細胞82，每種細胞具有許多的中心球84，其上結(jié)合了N和E專一性抗體，如前面所提到的。該圖說明了N和E中心球?qū)κ戎行园准毎?2的專一性。在每一實例中均對整個載玻片或其大部分進行了測定以證實中心球不與其專一性之外的任何其它WBC′S結(jié)合。
圖9說明的是兩種嗜中性白細胞86，每種細胞上均結(jié)合了許多中心球88。中心球88上再次結(jié)合有N和E專一性抗體。在此，中心球為磁性，直徑相當于1μm，非磁性中心球在載玻片上為白色，磁性中心球的顏色為淡棕色，它能夠從顏色上以及大小區(qū)別于非磁性中心球。
這一差別在圖10中得到最好說明，其中已證實單個嗜中性白細胞90上結(jié)合了許多2μm的非磁性白色中心球92，而中心球92上則結(jié)合了N專一性抗體(如前所述)。嗜中性白細胞90上也結(jié)合了許多1μm磁性淡棕色中心球94，而中心球94上則結(jié)合了N和E專一性抗體。從而使得同時鑒定為具有兩個或多個感興趣抗原的特定細胞能夠被鑒定。
如圖4-10所示，RBC′S通常不被除去。圖4-10所示的涂片是通過觀察具有所有細胞的血細胞的常規(guī)方式制備的。而且，細胞離心能夠破壞細胞，尤其是異常細胞的形態(tài)，因此是不可取的。但是，當僅存在相當于或低于約1000-2000WBC′S/μ1的極低WBC計數(shù)時，能夠非常容易地除去RBC′S。WBC′S的濃度大大地有助于其觀察。應該以最少限度地影響剩余細胞形態(tài)的方式除去RBC′S。
一個可取的除去RBC′S的方式是向樣品中加入溶解液，然后再加入終止液。優(yōu)選的溶解液可以是濃度約為0.21%(w/v)的檸檬酸-水合物與濃度約為0.02%(w/v)的皂素的混合物。優(yōu)選的終止液可以是濃度約為2.9%(w/v)的氯化鈉與濃度約為0.59%(w/v)的碳酸氫鈉的水溶液。推薦使用制菌劑，如濃度約為0.01%(w/v)的疊氮化鈉，但它并不需要在溶解液和終止液中同時使用。
一般來說，利用上述溶解液和終止液時，其方法如下1.向試管中加入100μl EDTA全血。
2.向血液中加入適當量的中心球，如40μl濃度為2×107/ml的中心球。
3.溫和地混合足夠時間，如約10-30分鐘，使細胞與中心球結(jié)合。
4.取出35ml混合物，加至12×75mm的試管中。
5.加入500μl溶解液并輕微渦動。
6.迅速加入250μl終止液。
7.保溫約1分鐘。
8.根據(jù)需要，加入100ml 5%BSA于PBS中的緩沖液。
9.將400ml混合物加至細胞離心裝置中，并以500rpm的轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)5分鐘以將細胞轉(zhuǎn)至載玻片上。
10.步驟10與第頁上所述方法的步驟6-8相同。
也可利用前面所述的磁性中心球除去RBC′S。
圖11顯示的是排除了除WBC′S之外的所有細胞的細胞離心載玻片。除去可能存在的RBC′S并根據(jù)需要除去其它細胞，然后將剩余的細胞旋轉(zhuǎn)離心至載玻片上以濃縮細胞，并除去過量的水分。這有助于觀察所需細胞，由于這類細胞在全血樣品中的數(shù)量相對較少，因此難以定位。圖11證實許多中心球96上結(jié)合了T11專一性抗體，該中心球96與三種淋巴細胞98結(jié)合，但它不與嗜中性白細胞100或單核細胞102結(jié)合，這后兩種細胞也暴露于中心球96。
圖12是通過細胞離心制得的另一個載玻片，它說明許多中心球104上結(jié)合了N和E專一性抗體，該中心體104與數(shù)個嗜中性白細胞106結(jié)合但不與單核細胞108結(jié)合。
盡管通過特定的實例說明了通過大小和顏色區(qū)別的中心球的使用，但也可通過它們所具有的不同形狀區(qū)別中心球。
在本發(fā)明的實施過程中還觀察到兩個另外的現(xiàn)象，即裝邊和載玻片凝集。這兩種現(xiàn)象均稱作細胞團集。裝邊現(xiàn)象發(fā)生在具有大量的對特定抗原陽性的細胞的全血樣品中。該現(xiàn)象是全血與中心球在反應容器(如試管)中混合或保溫的過程中被觀察到的。陽性細胞和中心球趨向于沿全血外表面凝集，在試管上形成一個細微的邊。該邊僅可在陽性樣品中見到。在顯微鏡載玻片上也可觀察到類似的凝集現(xiàn)象。將一滴全血加到載玻片上并通過輕輕振動載玻片將其與一滴包衣了抗體的乳汁珠混合，就可在含有大量的對相應的特定抗原陽性的細胞的樣品中觀察到肉眼可見的凝集現(xiàn)象。該凝集現(xiàn)象在載玻片上表現(xiàn)為在紅血背景下的白色團塊，肉眼可見。
這些凝集反應能夠在適宜的條件下提供一個快速篩選高WBC數(shù)的方法。利用每微升約為或高于40-50，000個細胞的總WBC細胞數(shù)(正常WBC細胞的范圍為4-11，000個/μl)已觀察到這些現(xiàn)象。盡管無需借助其它裝置就可用肉裝觀察到細胞團聚，但仍可利用手動或自動操作的顯微鏡裝置或其它光學儀器。另外，也可通過用光束對混合容器進行手動或自動光學掃描而用肉眼觀察到裝邊現(xiàn)象，當發(fā)生裝邊現(xiàn)象時光束會產(chǎn)生衍射圖案。
圖13說明許多中心球110上結(jié)合了第二反應物，該第二反應物與第一反應物結(jié)合，而第一反應物反過來又與細胞112上的特定分子結(jié)合。在這種情況下，該細胞表達與第一反應物相結(jié)合的CD34抗原。第一反應物，如HPCA-1不易以直接與中心球110結(jié)合的適宜濃度得到。因此，將第二反應物(這里是山羊抗鼠抗體)與中心球結(jié)合。該第二反應物將與任何鼠抗體結(jié)合，因此中心球110將與結(jié)合到細胞112上的中心球上的第一反應物結(jié)合。與第二反應物結(jié)合的第一反應物和中心球110也將同時與樣品結(jié)合在一起?；蛘撸蓪⒌谝环磻锱c中心球110上的第二反應物結(jié)合，然后，與第二反應物結(jié)合并且也與第一反應物結(jié)合的中心體110將通過第一反應物而與樣品結(jié)合。單獨與細胞112結(jié)合而無中心球110的第一反應物則不能通過肉眼或顯微鏡加以區(qū)別。
一般來說，第一種方法的步驟如下1.步驟1與第18頁上所述方法的步驟1和2相同。
2.加入10μl的第一反應物，并且渦動混合物約2-3秒鐘。
3.將混合物保溫約10分鐘。
4.加入10μl其上結(jié)合了第二反應物的中心球。
5.步驟5與第18頁上所述方法的步驟4-8相同。
圖5-12所述的其它類型方法也可用在圖13所述的反應物結(jié)合類型上?？上虻诙悠凡糠种屑尤刖哂胁煌磻锏钠渌M中心球，這些中心球具有區(qū)別于彼此的不同大小和/或顏色。也可在第一樣品部分中將具有不同反應物的一套或多套中心球與第一和第二反應物結(jié)合。但是，在這一方法中其它反應物必須是不同于第二反應物的其它類型，否則中心球也將與第二反應物結(jié)合。例如，當?shù)诙磻锸强故罂贵w時，其它反應物可以是豬、兔或其它不同類型的抗體。
利用圖13所述的不同方法的目的是為了確定各種方法的效果。第一個例子是，通過溫和渦動將5μlT4抗體加到100μl全血中。將該混合物靜置或保溫10分鐘。保溫之后，加入10μl中心球，輕輕渦動并在滾筒式振蕩器上混合10分鐘，然后按照前述方法制除片。其結(jié)果是中心球與L′S的正常結(jié)合，兩個實例分別為37%和44%。
在第二個例子中，是將中心球和T4抗體同時加入，并在滾筒上振蕩10分鐘，然后制成載玻片。其結(jié)果是兩個實例的百分數(shù)分別下降為28和31。
在第三個例子中，是在無任何抗體的情況下加入中心球并混合，然后制成載玻片。在此例中，正如所料，未發(fā)現(xiàn)中心球與細胞結(jié)合。
在另一例子中，是將T4抗體與樣品在滾筒中振蕩10分鐘，然后加入中心球并混合10分鐘，最后制成載玻片。它產(chǎn)生正常的百分數(shù)36。
在最后一個例子中，是將中心球與T4抗體一起混合并靜置10分鐘。然后將該混合物加至樣品部分并混合10分鐘，最后制成載玻片。得到較低的百分數(shù)23和27。一種解釋是混合物中剩余的部分游離抗體封閉了中心球所要結(jié)合的某些位點。
圖14顯示的是骨髓樣品中的幾個嗜中性白細胞114，每個細胞上均結(jié)合了許多中心球116。中心球116上結(jié)合了N專一性抗體。該例子說明了該方法對除血液之外的其它類型液體(這里是骨髓)的效力。
圖15和圖16進一步說明了本發(fā)明的實例。
母申請的方法同樣可用于篩選癌細胞，如同在母申請中所提到和在下面將要更具體敘述的那樣。不同類型的癌細胞表達出不同的特定分子，從而可以利用特定的單克隆抗體來協(xié)助區(qū)分各種類型的癌癥。這種區(qū)分極其重要，因為時間是關鍵，并且不同類型的癌癥需要采用不同的治療方法。
而且，僅通過細胞染色并觀察細胞的形態(tài)可能不足以確定具體的癌癥類型。或者，病理學家可能需要進一步的信息以證實形態(tài)評估的結(jié)果。當需要這類信息時，通常是利用帶有熒光單克隆抗體的流動血細胞計數(shù)儀器來提供該信息。
表Ⅱ顯示了一個這類流動血細胞計數(shù)單克隆抗體板。
表Ⅱ白血病/淋巴瘤免疫表現(xiàn)型鑒定板相關/限制MAb B-細胞 T-細胞 髓單核細胞HLA-DR + -a+bCD19 + - -CD10 +c- -CD20 +d- -CD2 - + -CD5 -c+ -CD7 - + -fCD13 - - +CD33 - - +CD14 - - +g
a后胸腺T細胞惡性腫瘤通常為HLA-DR，而T-細胞急性白血病和淋巴瘤幾乎總是HLA-DR。
bHLA-DR普通存在于成髓細胞上，但不存在于前髓細胞上。因此，成單核細胞及其子代始終為HCA-DR;急性前髓細胞白血病(M3)幾乎總是HLA-DR。
c非常頻繁，CD10在濾泡淋巴瘤中為陽性。
d由于CD20在個體發(fā)育時出現(xiàn)較晚，因此它不象CD19在急性白血病中那樣普遍地表達。但是，它幾乎總是存在于B細胞淋巴瘤中。
eCD5在正常循環(huán)的B細胞小亞群上共同表達。它是鑒別慢性淋巴細胞白血病的有用標記物，在此處CD5于亞性腫瘤B細胞上同時表達。
fCD7以小百分比存在于別的普通急性骨髓白血病中。它通常為后胸腺T細胞惡性腫瘤陰性，因此它的缺乏可用于T細胞惡性腫瘤的早期檢測。
gCD14實際上限制于成熟的單核細胞。因此，它被用于從胚細胞或單核細胞前體中分離單核細胞，胚細胞和單核細胞前體通常為HLA-DR陽性，CD14陰性。
表Ⅱ選自Landay、A.L.and Dugue，R.E.In press，1991 Hematopoietic Neoplasmas.Manual of Clinical Laboratory Immunology，American Societyfor Microbiology，Washington，D.C.該表是利用流動血細胞計數(shù)單克隆抗體熒光染料加以說明的，但是正如前面所述，這類流動血細胞計數(shù)儀器不是總能夠得到，從而大大地耽擱了時間。
本申請人發(fā)現(xiàn)，在沒有流動血細胞計數(shù)儀器的情況下使用本發(fā)明的中心球時同樣可以應用信號測定?？衫闷渖辖Y(jié)合了各種單克隆抗體的不同組中心球的板子來對樣品中存在的癌癥類型這一信息進行快速篩選。例如，利用在一個或多個涂片上幾套可光學區(qū)分的中心球或利用每一涂片上的不同組中心球或者將二者結(jié)合在一起，可提供快速篩選的信息。存在于不同組中心球上的大多數(shù)或全部中心球可包括如下單克隆抗體HLA-DR -如但不限于I3B淋巴細胞 -如但不限于CD19T-細胞 -如但不限于CD2單核細胞 -如但不限于CD14骨髓細胞 -如但不限于CD33申請人也已發(fā)現(xiàn)，KC-48似乎也能提供有關骨髓白血病的信息。
利用本發(fā)明，對從病理學家那獲得的并被鑒定為急性骨髓白血病(AML)的樣品進行信息篩選，以證實它確為AML癌癥。AML是一種早期癌癥，其成熟細胞很少。因此，與中心球結(jié)合了的單克隆抗體應與未成熟細胞結(jié)合以區(qū)分該類癌細胞。利用其中13和KC48單克隆抗體為輕微陽性至中等陽性(即在每一細胞上按中等數(shù)量與中等數(shù)量的細胞結(jié)合)的各個涂片，通過快速篩選板證實了上述推斷。T11單克隆抗體中心球與樣品中的少量成熟L′S結(jié)合。骨髓(這里是CD34)單克隆抗體中心球僅為很弱的陽性，而MY4和B4單克隆抗體中心球為陰性，即不與任何細胞結(jié)合。
如果快速篩選板的結(jié)果是確定性的，那么病理學就可在不需其它信息的情況下決定治療方案。如果快速篩選板的結(jié)果不是確定的，那么病理學家可通過例如流動血細胞計數(shù)儀器獲得進一步的信息。
也可利用本發(fā)明獲得進一步的信息，例如，如果原始快速篩選板上顯示的是T-細胞陽性癌癥，則可利用另外的載玻片來提供進一步的信息。例如，然后利用CD4、CD8和CD10來進一步確定癌癥的類型。一些不同類型的癌癥包括上面所提到的ALL和AML、慢性淋巴細胞白血病(CLL)以及人T-細胞親淋巴性病毒-1(HTLV-1)白血病。HTLV-1染色的細胞與B-細胞癌在形態(tài)上可能難以區(qū)分，但是其差別是很大的。通過在兩個分開的染色樣品中使用中心球或者在一個染色過的載玻片上使用兩組可區(qū)分的中心球，可以將這兩類癌癥區(qū)分開來。舉例來說，兩組中心球之一上可以結(jié)合有T4單克隆抗體，而另一組中心球上可以結(jié)合有T8單克隆抗體。如果僅T4組中心球與細胞結(jié)合，那么癌癥很可能是HTLV-1。如果T8組中心球也與大部分細胞結(jié)合，那么癌癥可能不是HTLV-1，還必須對樣品更多的信息作進一步的分析。當病理學家為了證實HTLV-1型白血病時，他可以對血清樣品作進一步的分析以證實HTLV-1病毒的存在。
在圖15中，是用一對癌細胞120來說明被懷疑為HTLV-1癌的樣品，其中加入了結(jié)合有CD8專一性抗體的中心球。利用了一個游離的中心球122，細胞120很明顯地不與中心球122結(jié)合。
圖16說明的是在圖15中所說明的懷疑為HTLV-1癌樣品的不同樣品部分中的一對癌細胞120。在該樣品部分中，結(jié)合了CD4專一抗性的許多中心球124很明顯地與細胞120結(jié)合。無CD8專一性抗體結(jié)合于細胞120而有CD4專一性抗體結(jié)合于細胞120這一情況強有力地說明細胞120為HTLV-1白血病細胞。
如果病理學家已測定出該癌癥為淋巴瘤類型的癌癥，則僅需快速篩選板提供有關是B-細胞還是T-細胞淋巴瘤方面的信息。
另一個提供快速癌癥篩選信息的方法是利用磁性中心球并在結(jié)合后通過磁力排除結(jié)合細胞。在這一例子中，首先制備一個無中心球的標準涂片以作為對照。然后將通過磁力排除過的第二塊涂片與對照涂片進行比較。如果感興趣的形態(tài)細胞或其大部分被除去，那么癌癥或其部分細胞則對與中心球一起使用的那類單克隆抗體陽性。在這種情況下單獨排除過的涂片將為需要篩選的每一種單克隆抗體所利用。
權(quán)利要求
1.一種光學篩選顯微癌細胞的方法，其包括提供包含大量細胞，其中至少一部分顯示是癌細胞的樣品；將至少第一部分所述細胞和至少第一組中心球結(jié)合起來，該中心球具有至少能結(jié)合到所述細胞上的第一反應物，該反應物對至少第一特異分子有專一性，該專一分子存在于至少一種類型的癌細胞上；在含所述中心球的載玻片上制備所述細胞的涂片；用組織學染色法將所述涂片染色；和用顯微鏡光學觀察至少一些細胞以便至少鑒定可與所述第一組中心球結(jié)合的細胞是否存在，從而提供辨別癌癥信息。
2.權(quán)利要求1定義的方法，其包括提供全血樣品或部分全血樣品并用Wright類染料將所述涂片染色。
3.權(quán)利要求2定義的方法，其中所述第一反應物是對至少所述第一特異分子有專一性的抗體，該專一分子是第一細胞抗原。
4.權(quán)利要求2定義的方法，其包括加螯合劑到所述樣品中以防止嗜中性白細胞群體吞食所述中心球。
5.權(quán)利要求2定義的方法，其包括將所述涂片進行圖像分析。
6.權(quán)利要求2定義的方法，其包括鑒定至少一些所述細胞的形態(tài)特征并鑒定所述特征細胞上結(jié)合的中心球的存在或不存在。
7.權(quán)利要求1定義的方法，其包括對所述涂片進行圖像分析。
8.權(quán)利要求1定義的方法，其包括將所述第一批所述細胞與具有至少能結(jié)合到其上的第二反應物的至少第二組中心球結(jié)合，該第二組反應物對至少第二特異分子是專一性的，第二特異分子存在于至少一種類型細胞上，所述第二組中心球具有與所述第一組中心球不同的光學特征，用顯微鏡光學觀察至少一些所述細胞以至少鑒定與第二組中心球結(jié)合的細胞是否存在。
9.權(quán)利要求8定義的方法，其包括同時將所述第一批的所述細胞與至少所述第一和第二組中心球結(jié)合。
10.權(quán)利要求8定義的方法，其中所述第一和第二組的所述中心球在大小上存在著物理差異。
11.權(quán)利要求8定義的方法，其中所述第一和第二組所述中心球在顏色上存在著光學差異。
12.權(quán)利要求1定義的方法，其包括將至少第二批所述細胞與具有至少可結(jié)合到該細胞上的第二反應物的至少第二組中心球相結(jié)合，該第二反應物對至少第二特異分子有專一性，該第二特異分子存在于至少第二類癌細胞上;在含所述中心球的載玻片上制備所述細胞的涂片;用組織學型染料將所述涂片染色;和用顯微鏡光學觀察至少一些所述細胞以至少鑒定可與所述第二組中心球結(jié)合的細胞是否存在。
13.權(quán)利要求12定義的方法，其中所述第一和第二組所述中心球在大小上存在著物理差異。
14.權(quán)利要求12定義的方法，其中第一和第二組所述中心球在顏色上存在著光學差異。
15.權(quán)利要求12定義的方法，其中所述第一反應物是CD4單克隆抗體，所述第二反應物是CD8單克隆抗體，可與所述CD4和CD8單克隆抗體中心球結(jié)合的細胞是否存在是HTLV-1白血病的標志。
16.權(quán)利要求1定義的方法，其包括將許多不同批的所述細胞分別與不同組的中心球結(jié)合，每組中心球具有可結(jié)合到所述細胞上的不同反應物，不同反應物對不同的特異分子有專一性，不同的特異分子存在不同類型的癌細胞上;在含所述中心球的不同載玻片上制備所述不同細胞的不同涂片;用組織學染劑將每一涂片染色;和用顯微鏡光學觀察每一所述涂片上的至少一部分所述細胞，以便至少鑒定可與所述種類中心球結(jié)合的細胞是否存在，從而提供了一種快速鑒定癌癥的方法。
17.權(quán)利要求1定義的方法，其包括將第一批所述細胞與許多種類中心球混合，每種中心球具有可與所述細胞結(jié)合的不同反應物，不同的反應物對不同的特異性分子是專一的，不同特異性分子存在于至少一種癌細胞上，各種所述中心球相互具有不同的光學特征，用顯微鏡從光學上觀察至少一部分細胞并至少鑒定可與所述不同組中心球結(jié)合的細胞是否存在。
18.權(quán)利要求17定義的方法，其包括同時將所述第一批所述細胞與所述的多組中心球混合。
19.權(quán)利要求17定義的方法，其中每組所述中心球在大小或顏色上存在著物理學差異。
20.權(quán)利要求1定義的方法，其包括提供全血樣品或部分全血樣品和至少一些所述細胞的形態(tài)學特征，鑒定在許多所述細胞上存在著許多與之結(jié)合的中心球。
21.權(quán)利要求1定義的方法，其包括將所述第一批所述細胞與所述第一組中心球結(jié)合。
22.光學篩選顯微癌細胞方法，其包括提供樣品，該樣品包括大量細胞，其中至少一些細胞顯示是癌細胞;在載玻片上制備第一批所述細胞的第一涂片;用組織學染色將所述第一涂片染色;用顯微鏡從光學上觀察至少一部分所述細胞，以至少鑒定潛在癌細胞的存在;將至少第二批所述細胞與至少結(jié)合了第一反應物的至少一組中心球結(jié)合，該第一反應物對至少一種特異分子是專一性的，該特異分子存在于至少一種癌細胞上;用可與所述中心球結(jié)合的任何細胞從上述第二批中除去所述種類中心球;在含所述中心球的載玻片上制備所述細胞的第二涂片;用組織學染色將所述第二涂片染色;和在所述第二涂片上光學觀察至少一些所述第二批細胞并將所述第二涂片與所述第一涂片進行比較以鑒定所述潛在癌細胞是否存在。
23.用于光學鑒定樣品中的癌癥微觀細胞的儀器，樣品包括許多細胞，其中至少一些細胞顯示是癌細胞，該儀器包括用于將至少第一批所述細胞與至少第一組中心球結(jié)合的裝置，該中心球含至少可與所述細胞結(jié)合的第一反應物，該反應物對至少第一特異分子有專一性，該特異分子存在于至少一種癌細胞上;用于在含所述中心球的載玻片上制備所述細胞涂片的裝置。用組織學染色將所述涂片染色的裝置;和用顯微鏡從光學上觀察至少一些細胞以至少鑒定與所述第一種微球體結(jié)合的細胞是否存在，從而提供癌癥鑒定信息的裝置。
24.權(quán)利要求23定義的儀器，其包括所述樣品是全血樣品或部分全血樣品，和用Writht型染色將所述涂片染色的裝置。
25.權(quán)利要求24定義的儀器，其中所述第一反應物是抗體，其對至少所述第一特異分子是專一性的，該特異分子是第一細胞抗原。
26.權(quán)利要求24定義的儀器，其包括用于加螯合劑到所述樣品中以防止嗜中性白細胞群體吞食所述中心球的裝置。
27.權(quán)利要求24中定義的儀器，其包括用于圖像分析所述涂片的裝置。
28.權(quán)利要求24定義的儀器，其包括用于定至少一些所述細胞的形態(tài)特征的裝置和用于鑒定結(jié)合在所述特征細胞上是否存在結(jié)合的中心球的裝置。
29.權(quán)利要求23定義的儀器，其包括用于圖像分析所述涂片的裝置。
30.權(quán)利要求23定義的儀器，其包括用于將所述第一批所述細胞與至少第二組中心球結(jié)合的裝置，該中心球具有可結(jié)合到所述細胞上的第二反應物，該反應物對至少第二特異分子有專一性，該特異分子存在于至少一種細胞上，所述第二組中心球與所述第一組中心球存在著不同光學特征，和用顯微鏡從光學上觀察至少一些所述細胞以至少鑒定可與第二組中心球結(jié)合的細胞是否存在的裝置。
31.權(quán)利要求30定義的儀器，其包括用于同時將所述第一批所述細胞與至少第一和第二組中心球結(jié)合的裝置。
32.權(quán)利要求30定義的儀器，其中所述第一和第二組所述中心球在大小上存在著物理學差異。
33.權(quán)利要求30定義的儀器，其中第一和第二組所述中心球在顏色上存在著光學差異。
34.權(quán)利要求23中定義的儀器，其包括用于將至少第二批所述細胞與至少第二組中心球結(jié)合的裝置。該中心球具有可結(jié)合到所述細胞上的第二反應物，該反應物對至少第二特異分子有專一性，該特異分子存在于至少第二種癌細胞上;用于在含中心球的涂片上制備所述細胞涂片的裝置;用組織學染色將所述涂片染色的裝置;和用顯微鏡從光學上觀察至少一些所述細胞以至少鑒定可與所述第二組中心球結(jié)合的細胞是否存在的裝置。
35.權(quán)利要求34定義的儀器，其中所述第一和第二組所述中心球的大小上存在著物理學差異。
36.權(quán)利要求34定義的儀器，其中第一和第二組所述中心球在顏色上存在著光學差異。
37.權(quán)利要求34定義的儀器，其中所述第一反應物是CD4單克隆抗體，所述第二反應物是CD8單克隆抗體，可與所述CD4和CD8抗體中心球結(jié)合的細胞存在與否是HTLV-1白血病的標志。
38.權(quán)利要求23定義的儀器，其包括用于將許多不同批的所述細胞分別與不同組的中心球結(jié)合的裝置，每組中心球含可結(jié)合到所述細胞上的不同反應物，該不同反應物對不同的特異分子有專一性、而不同特異分子存在于不同類型的癌細胞上;用于在含所述中心球的不同載玻片上制備所述不同細胞的不同涂片的裝置;用組織學染色將每種所述載玻片染色的裝置;和用顯微鏡從光學上觀察在每種所述載玻片上的至少一些所述細胞以至少鑒定可與所述組中心球結(jié)合的細胞是否存在，從而提供快速鑒定癌癥方法的裝置。
39.權(quán)利要求23定義的儀器;其包括將所述第一批所述細胞與許多組的中心球相結(jié)合的裝置，每組中心球含可結(jié)合到所述細胞上的不同反應物，該反應物對不同特異分子有專一性，該特異分子存在于至少一種癌細胞上，各種所述中心球相互存在著不同光學特征，和用顯微鏡光學觀察至少一些所述細胞以鑒定可與所述不同組中心球結(jié)合的細胞是否存在的裝置。
40.權(quán)利要求39定義的儀器，其包括同時將所述第一批所述細胞與所述許多組中心球結(jié)合的裝置。
41.權(quán)利要求39定義的儀器，其中每個所述組中心球都在大小或顏色上存在著差異。
42.權(quán)利要求23定義的儀器，其包括所述樣品是全血樣品或部分全血樣品，和用于定至少一些所述細胞的形態(tài)特征的裝置，其還包括鑒定在所述特征細胞上的許多結(jié)合的中心球的存在。
43.權(quán)利要求23定義的儀器，其包括將所述第一批所述細胞與所述第一組中心球混合的裝置。
44.用于在樣品中光學鑒定癌癥的微觀細胞的儀器，樣品包括許多細胞，其中至少一些細胞顯示是癌細胞，該儀器包括在載玻片上制備第一批所述細胞的第一涂片的裝置;用組織學染色將所述第一涂片染色的裝置;用顯微鏡光學觀察至少一些細胞以至少鑒定存在的潛在癌細胞的裝置;將至少第二批所述細胞與至少一組中心球結(jié)合的裝置，該中心球具有至少一種可與所述細胞結(jié)合的第一反應物，該反應物對存在于至少一種癌細胞上的至少一種特異分子有專一性;用可與所述中心球結(jié)合的任何細胞從所述第二批細胞中除去所述組中心球的裝置;在含所述中心球的載玻片上制備所述第二批細胞的第二涂片的裝置;用組織學染色將所述第二涂片染色的裝置;在所述第二涂片上光學觀察至少一些所述第二批細胞的裝置和將所述第二涂片與所述第一涂片比較以鑒定所述潛在類型癌細胞是否存在的裝置。
全文摘要
用于鑒定細胞和癌細胞表達的形態(tài)學和選擇性特征或性質(zhì)的光學鑒別法和儀器，該方法及儀器的詳細內(nèi)容見說明書。
文檔編號G01N1/31GK1062212SQ9111106
公開日1992年6月24日 申請日期1991年11月23日 優(yōu)先權(quán)日1990年11月23日
發(fā)明者康思坦斯·馬瑞·哈耶克, 托馬斯·魯塞爾 申請人:科特公司