本發(fā)明涉及免疫磁珠制備，具體涉及一種應(yīng)用于免疫檢測(cè)的免疫磁珠及其制備方法。

背景技術(shù)：

1、納米磁珠通常由大量固定在非磁性基質(zhì)中的磁性納米顆粒組成，尺寸范圍在幾十納米到幾百微米之間。非磁性基質(zhì)通常為二氧化硅或有機(jī)聚合物。球形顆粒的粒徑越小，比表面積(表面積與體積之比)就越大，粒子表面的原子所占比例也越多，更容易與其他原子結(jié)合形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，具有很高的化學(xué)活性。珠粒通常分散在液體懸浮液中，例如乙醇、異丙醇、疊氮化鈉溶液、純水。懸浮液中的磁珠由于其獨(dú)特的磁性以及與外加磁場(chǎng)的相互作用，已成為生物和化學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用最廣泛的納米材料之一。鐵磁性材料存在自發(fā)磁化強(qiáng)度，在無外加磁場(chǎng)時(shí)也具有磁性。由于納米材料的小尺寸效應(yīng)，當(dāng)鐵磁材料的體積低于某一臨界值(氧化鐵通常小于30nm)的時(shí)候會(huì)表現(xiàn)出超順磁性。超順磁性是指顆粒粒徑小于臨界尺寸且溫度低于居里溫度并高于轉(zhuǎn)變溫度時(shí)表現(xiàn)為順磁性，而在施加外磁場(chǎng)的情況下它會(huì)被磁化，表現(xiàn)出磁性，且磁化率遠(yuǎn)超于一般的順磁體。超順磁顆粒只在外加磁場(chǎng)存在的時(shí)候才表現(xiàn)出磁性，這使得它在生物體內(nèi)環(huán)境中的應(yīng)用具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。磁性納米粒子具有的超順磁性，為樣品的分離、富集和提純提供了很大方便，在免疫檢測(cè)方面也受到廣泛關(guān)注。

2、作為一種直徑為納米至微米級(jí)別具有磁性球形復(fù)合材料，磁珠可以在外加磁場(chǎng)的作用下實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物質(zhì)的高效分離；而通過在磁珠上修飾識(shí)別分子如抗體等，利用特異性的免疫學(xué)反應(yīng)，可用于高效專一地結(jié)合相應(yīng)的抗原/抗體，進(jìn)而形成免疫復(fù)合物，在外加磁場(chǎng)的作用下，能夠?qū)崿F(xiàn)免疫復(fù)合物與其他物質(zhì)的高效分離，從而達(dá)到陽性或陰性選擇特定靶標(biāo)的目的。由于免疫磁珠具有分離速度快、效率高、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)，因此免疫磁珠在免疫檢測(cè)、細(xì)胞分離、生物大分子純化和分子生物學(xué)等領(lǐng)域有著極其廣泛的使用。。

3、然現(xiàn)有的免疫磁珠的粒徑均一性、表面活性官能團(tuán)的含量、穩(wěn)定性及制備方法的簡(jiǎn)單化依然有待提高，因此，提出一種應(yīng)用于免疫檢測(cè)的免疫磁珠及其制備方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明目的在于提供一種應(yīng)用于免疫檢測(cè)的免疫磁珠及其制備方法，該方法制備工藝簡(jiǎn)單，制得的免疫磁珠均一性、穩(wěn)定性好。

2、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供一種應(yīng)用于免疫檢測(cè)的免疫磁珠的制備方法，包括如下步驟：

3、s1：碳包覆鐵納米粒子制備；

4、s2：所述碳包覆鐵納米粒子進(jìn)行等離子體氨化處理，得到氨基碳包覆鐵納米粒子；

5、s3：將所述氨基碳包覆鐵納米粒子用去離子水洗1-2次，調(diào)節(jié)乙醇水溶液的ph至4.5-5.5，加入清洗后的氨基碳包覆鐵納米粒子，加入硅烷偶聯(lián)劑對(duì)其表面改性，室溫反應(yīng)12-24h，然后置于第一緩沖溶液中，加入免疫配基生物活性物質(zhì)，攪拌溫育，用第二緩沖溶液磁力分離洗滌3-4次，加入牛血清蛋白，在4℃下混合反應(yīng)過夜，封閉磁珠，得到免疫磁珠；

6、s4：將所述免疫磁珠用純水洗滌3次，溶解在ph為7.0-7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，于4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

7、優(yōu)選的，所述碳包覆鐵納米粒子的制備步驟為：

8、s21:按一定質(zhì)量比取蔗糖和硝酸鐵，將所述蔗糖和蔗糖質(zhì)量1％的十二烷基苯磺酸鈉加入到乙醇水溶液中充分溶解得到蔗糖溶液，向所述蔗糖溶液中加入質(zhì)量濃度為82％的水合肼溶液，并用濃氨水調(diào)節(jié)溶液至ph為10得到混合溶液a，所述水合肼溶液加入體積為蔗糖溶液體積的80％-120％；

9、s22:將硝酸鐵和與s21步驟等量的十二烷基苯磺酸鈉一同充分溶解到無水乙醇中得到混合溶液b；

10、s23:將溶液b以50-90滴/min的速率滴加到混合溶液a中，滴加過程保持物理攪拌和超聲攪拌，滴加完畢后得到混合溶液c，將所述混合溶液c置于烘箱中，在80℃調(diào)節(jié)下烘干得到前驅(qū)體，將所述前驅(qū)體在氮?dú)鈿夥障拢?50℃下碳化2h，然后提升溫度到1000℃，退火7h，冷卻至室溫后研磨得到所述碳包覆鐵納米粒子。

11、優(yōu)選的，所述氨基碳包覆鐵納米粒子的制備步驟為：

12、s31：在微波等離子體裝置中加入所述碳包覆鐵納米粒子，使用2.45ghz微波源激發(fā)等離子體，通入氨氣和氮?dú)?，激發(fā)nh3、n2等離子體，微波功率為1.5～3kw，氨氣和氮?dú)獾谋壤秊?-3:1，氨氣和氮?dú)饪倸怏w流速為100-150sccm，反應(yīng)溫度200-400℃，反應(yīng)3-5h得到氨基碳包覆鐵納米粒子；

13、s32：反應(yīng)完畢后關(guān)閉微波電源，繼續(xù)通入氨氣和氮?dú)怏w系以5-15℃/min速率冷卻至常溫，關(guān)閉氨氣和氮?dú)怏w系，取出所述氨基碳包覆鐵納米粒子。

14、優(yōu)選的，s21步驟中蔗糖和硝酸鐵的質(zhì)量比為5:1。

15、優(yōu)選的，步驟s3中第一緩沖溶液為0.1m?pbs含0.05％吐溫-20，ph7.0-7.4，第二緩沖溶液為0.1m?pbs，0.1％bsa，0.05％吐溫-20。

16、優(yōu)選的，步驟s3中硅烷偶聯(lián)劑為3-縮水甘油丙基三甲氧基硅烷、氨丙基三乙氧基硅烷和氨丙基三甲氧基硅烷中的任意一種。

17、優(yōu)選的，步驟s3中免疫配基為以下物質(zhì)中的一種：酶、抗體、抗原、dna、rna。

18、本發(fā)明還提出一種免疫磁珠，所述免疫磁珠結(jié)構(gòu)為包括有氨基碳包覆鐵納米粒子以及偶聯(lián)連接于氨基碳包覆鐵納米粒子外的免疫配基。

19、本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明通過以蔗糖為碳源、以硝酸鐵為金屬源,經(jīng)過液相還原一高溫退火的方法成功制備了碳包覆金屬鐵納米粒子，采用等離子方式激發(fā)nh3、n2等離子體，使碳包覆金屬鐵納米粒子連接氨基等含氮基團(tuán)，氨基等官能團(tuán)可以提供孤對(duì)電子，使磁珠表面具有一定的親電性，從而與部分帶正電荷的分子發(fā)生范德華力相互作用，有效提高了磁珠的吸附能力。整個(gè)免疫磁珠的制備方法簡(jiǎn)單，通過調(diào)整碳包覆鐵納米粒子的反應(yīng)參數(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)粒子大小的設(shè)計(jì)，達(dá)到控制尺寸的目的。本發(fā)明提出的免疫磁珠大小均一性穩(wěn)定，吸附性能好，儲(chǔ)存簡(jiǎn)單易取用。

技術(shù)特征：

1.一種應(yīng)用于免疫檢測(cè)的免疫磁珠的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用于免疫檢測(cè)的免疫磁珠的制備方法，其特征在于，所述碳包覆鐵納米粒子的制備步驟為：

3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用于免疫檢測(cè)的免疫磁珠的制備方法，其特征在于，所述氨基碳包覆鐵納米粒子的制備步驟為：

4.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用于免疫檢測(cè)的免疫磁珠的制備方法，其特征在于，s21步驟中蔗糖和硝酸鐵的質(zhì)量比為5:1。

5.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用于免疫檢測(cè)的免疫磁珠的制備方法，其特征在于，步驟s3中第一緩沖溶液為0.1m?pbs含0.05％吐溫-20，ph7.0-7.4，第二緩沖溶液為0.1m?pbs，0.1％bsa，0.05％吐溫-20。

6.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用于免疫檢測(cè)的免疫磁珠的制備方法，其特征在于，步驟s3中硅烷偶聯(lián)劑為3-縮水甘油丙基三甲氧基硅烷、氨丙基三乙氧基硅烷和氨丙基三甲氧基硅烷中的任意一種。

7.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用于免疫檢測(cè)的免疫磁珠的制備方法，其特征在于，步驟s3中免疫配基為以下物質(zhì)中的一種：酶、抗體、抗原、dna、rna。

8.一種利用權(quán)利要求1-7任意一項(xiàng)權(quán)利要求提出的制備方法制得的免疫磁珠，其特征在于，所述免疫磁珠結(jié)構(gòu)為包括有氨基碳包覆鐵納米粒子以及偶聯(lián)連接于氨基碳包覆鐵納米粒子外的免疫配基。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種應(yīng)用于免疫檢測(cè)的免疫磁珠及其制備方法，所述免疫磁珠制備步驟包括碳包覆鐵納米粒子制備、等離子體氨化處理、加入免疫配基生物活性物質(zhì)偶聯(lián)和存儲(chǔ)。所述免疫磁珠結(jié)構(gòu)為包括有氨基碳包覆鐵納米粒子以及偶聯(lián)連接于氨基碳包覆鐵納米粒子外的免疫配基。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，成本低，磁珠大小可控，免疫磁珠檢測(cè)靈敏度高。

技術(shù)研發(fā)人員：朱云楓,明宏艷,栗召輝,劉盛瑩
受保護(hù)的技術(shù)使用者：廣州國際旅行衛(wèi)生保健中心（廣州海關(guān)口岸門診部）
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/26