本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種熱炎寧合劑治療細(xì)菌性肺炎藥效成分的分析方法。

背景技術(shù)：

1、細(xì)菌性肺炎（bacterial?pneumonia）是肺炎占比最高的傳染性疾病，在臨床表現(xiàn)上，患者主要呈現(xiàn)出發(fā)熱、咳嗽、痰壅、呼吸困難以及肺部啰音等癥狀。常見致病菌包括肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌及肺炎克雷伯桿菌。根據(jù)其治病病機(jī)和發(fā)病癥狀，中醫(yī)將其歸入“肺炎喘嗽”的范疇。國醫(yī)大師王烈教授提出“熱毒”理論，指出“熱毒”是細(xì)菌性肺炎的主要病因，為治療細(xì)菌性肺炎提供了新思路。而熱炎寧合劑是有著清熱解毒功效的中藥復(fù)方配方，融合蒲公英、虎杖、北敗醬和半枝蓮等多味中藥材精華，是治療外感風(fēng)熱、內(nèi)郁化火以及咳嗽痰黃等癥狀的理想選擇?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)熱炎寧合劑與抗生素聯(lián)用有抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌作用，蒲公英等主要成分也具有抗感染作用。但該復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)并不清楚，用來治療細(xì)菌性肺炎的有效成分并不明晰，不利于對熱炎寧合劑的質(zhì)量控制和新適應(yīng)癥的開發(fā)。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種熱炎寧合劑治療細(xì)菌性肺炎藥效成分的分析方法。

2、本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的：

3、本發(fā)明提供一種熱炎寧合劑治療細(xì)菌性肺炎藥效成分的分析方法，其特征在于，所述分析方法包括：基于?uplc-q/tof-ms?技術(shù)篩選出熱炎寧合劑的化學(xué)成分；利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫，篩選得到熱炎寧合劑的有效成分并搜集對應(yīng)的作用靶點，構(gòu)建熱炎寧合劑靶點庫；構(gòu)建細(xì)菌性肺炎靶點庫；將細(xì)菌性肺炎靶點庫與熱炎寧合劑靶點庫取交集得到熱炎寧合劑作用于細(xì)菌性肺炎靶點數(shù)據(jù)庫，獲得活性靶點49個；將收集到的活性靶點和對應(yīng)的有效成分使用軟件進(jìn)行可視化，構(gòu)建復(fù)方網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯玫街匾瘜W(xué)成分42個，重點靶點23個；構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；將篩選獲得的活性靶點進(jìn)行?go?富集分析和kegg富集分析，獲得富集顯著性高的通路。

4、優(yōu)選地，熱炎寧合劑的化學(xué)成分的篩選方法包括：

5、配置供試品溶液：量取熱炎寧合劑原液?10?μl加入?10?ml乙腈溶劑中（乙腈:水=1:1）混勻，離心，吸取上清進(jìn)行液相色譜分析和質(zhì)譜分析；

6、配制混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液：精密稱量對照品虎杖苷、大黃素、菊苣酸、野黃芩苷各1?mg，置于不同離心管中，加入?1?ml?乙腈震蕩溶解；各移取?125?μl加入?500?μl?乙腈稀釋，離心，10000?rpm,?10?min；取上清?20?μl，加入?1?ml純水中，離心，10000?rpm,?10?min，取900?μl加入液相小瓶中制備混標(biāo)溶液，上機(jī)進(jìn)行液相色譜分析和質(zhì)譜分析；

7、熱炎寧合劑?unifi?分析平臺的建立：在?tcmsp、batman?、symmap、?etcm?、pubchem?等數(shù)據(jù)庫收集蒲公英、虎杖、北敗醬和半枝蓮的化學(xué)成分進(jìn)行整理，得到可能與熱炎寧合劑相關(guān)的化合物信息，包括化學(xué)成分名稱、結(jié)構(gòu)式、分子式等及化學(xué)結(jié)構(gòu)。將化合物結(jié)構(gòu)式存儲為．mol?模式，整理成?excel?表格放入文件夾，即構(gòu)建熱炎寧合劑化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫,上傳到本地?unifi?分析平臺，對化合物進(jìn)行解析。

8、數(shù)據(jù)處理與分析：人工核對復(fù)方檢出樣品與標(biāo)準(zhǔn)對照品的詳細(xì)信息，保證分析準(zhǔn)確。

9、優(yōu)選地，液相色譜條件為：本實驗用色譜柱為?waters?acquity?up－lc?beh?c18(100?mm?×4.6?mm，1.7?μm?)?；以?1?ml?/?l甲酸水溶液(a)－乙腈(b)為流動相，進(jìn)行梯度洗脫;液相色譜洗脫梯度如下：

10、

11、優(yōu)選地，質(zhì)譜條件為：采用正離子模式（esi+）、?負(fù)離子模式（esi-）分別檢測，掃描時間為?0.2?s，掃描范圍為?50m/z?-2000?da；正離子模式：毛細(xì)管電壓?2.00?kv，離子源溫度?120?℃，脫溶劑溫度?500?℃，脫溶劑氣體氮氣（n2）流量為?1000?l/h，錐形氣體流速?50l/h，使用亮氨酸腦啡肽作為校準(zhǔn)液；負(fù)離子模式：毛細(xì)管電壓?2.50?kv，離子源溫度?100℃，脫溶劑溫度?450?℃，脫溶劑氣體氮氣（n2）的流量為?600?l/h，錐形氣體流速?50?l/h，使用利血平作為校正液。

12、優(yōu)選地，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫為tcmsp?數(shù)據(jù)庫、btaman-tcm?數(shù)據(jù)庫、etcm?數(shù)據(jù)庫和symmap?數(shù)據(jù)庫。

13、優(yōu)選地，細(xì)菌性肺炎靶點庫的構(gòu)建方法為：以“pneumonia”“bacterialpneumonia”為關(guān)鍵詞，訪問?drugbank?數(shù)據(jù)庫、?ttd?數(shù)據(jù)庫、geo?數(shù)據(jù)庫、genecards?數(shù)據(jù)庫、omim?數(shù)據(jù)庫和?pharmgkb?數(shù)據(jù)庫，將數(shù)據(jù)庫獲得的信息目標(biāo)名稱輸入到?uniprot?數(shù)據(jù)庫中，以獲得目的基因名稱；geo?數(shù)據(jù)庫中搜索“pneumonia”、“bacterial?pneumonia”的直接數(shù)據(jù)，得到轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，使用?r?工具進(jìn)行分析，得到公共數(shù)據(jù)庫靶點的交集，作為細(xì)菌性肺炎靶點數(shù)據(jù)庫。

14、優(yōu)選地，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建方法為：根據(jù)細(xì)菌性肺炎靶點庫與熱炎寧合劑靶點庫取得的交集基因，準(zhǔn)備輸入文件，將交集文件中的基因名拷貝到?string?數(shù)據(jù)庫相應(yīng)的方框內(nèi)；選擇“homo?sapiens”?物種，得到構(gòu)建好的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；設(shè)置過濾條件，刪除游離結(jié)點，得到更清楚的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

15、優(yōu)選地，重點靶點為?ace、hmox1、serpine1、mpo、ccl2、il1β、cyp3a4、adrb2、ptgs2、adrb1、mmp9、il6、cftr、il4、btk、cd40lg、rela、nos2、il13、cyp19a1、cyp1a2、cyp1a1和tert。

16、相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：

17、本發(fā)明基于uplc-q/tof-ms技術(shù)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對熱炎寧合劑藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行分析，篩選獲得?42?個化合物，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法構(gòu)建藥物靶點數(shù)據(jù)庫和疾病靶點數(shù)據(jù)庫，取交集得到?49?個靶點，使用?go?和?kegg?富集分析，結(jié)果顯示熱炎寧合劑可影響細(xì)菌的入侵以及調(diào)控炎癥，且?pi3k/akt?通路是熱炎寧合劑治療細(xì)菌性肺炎的核心通路。

技術(shù)特征：

1.熱炎寧合劑治療細(xì)菌性肺炎藥效成分的分析方法，其特征在于，所述分析方法包括：基于uplc-q/tof-ms技術(shù)篩選出熱炎寧合劑的化學(xué)成分；利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫，篩選得到熱炎寧合劑的有效成分并搜集對應(yīng)的作用靶點，構(gòu)建熱炎寧合劑靶點庫；構(gòu)建細(xì)菌性肺炎靶點庫；將細(xì)菌性肺炎靶點庫與熱炎寧合劑靶點庫取交集得到熱炎寧合劑作用于細(xì)菌性肺炎靶點數(shù)據(jù)庫，獲得活性靶點49個；將收集到的活性靶點和對應(yīng)的有效成分使用軟件進(jìn)行可視化，構(gòu)建復(fù)方網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?，得到重要化學(xué)成分和重點靶點；構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；將篩選獲得的活性靶點進(jìn)行g(shù)o富集分析和kegg富集分析，獲得富集顯著性高的通路。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，熱炎寧合劑的化學(xué)成分的篩選方法包括：

3.（4）數(shù)據(jù)處理與分析：人工核對復(fù)方檢出樣品與標(biāo)準(zhǔn)對照品的詳細(xì)信息，保證分析準(zhǔn)確。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，液相色譜條件為：本實驗用色譜柱為watersacquityup－lcbehc18(100mm×4.6mm，1.7μm)；以1ml/l甲酸水溶液(a)－乙腈(b)為流動相，進(jìn)行梯度洗脫;液相色譜洗脫梯度如下：

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，質(zhì)譜條件為：采用正離子模式（esi+）、負(fù)離子模式（esi-）分別檢測，掃描時間為0.2s，掃描范圍為50m/z-2000da；正離子模式：毛細(xì)管電壓2.00kv，離子源溫度120℃，脫溶劑溫度500℃，脫溶劑氣體氮氣（n2）流量為1000l/h，錐形氣體流速50l/h，使用亮氨酸腦啡肽作為校準(zhǔn)液；負(fù)離子模式：毛細(xì)管電壓2.50kv，離子源溫度100℃，脫溶劑溫度450℃，脫溶劑氣體氮氣（n2）的流量為600l/h，錐形氣體流速50l/h，使用利血平作為校正液。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫為tcmsp數(shù)據(jù)庫、btaman-tcm數(shù)據(jù)庫、etcm數(shù)據(jù)庫和symmap數(shù)據(jù)庫。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，細(xì)菌性肺炎靶點庫的構(gòu)建方法為：以“pneumonia”“bacterialpneumonia”為關(guān)鍵詞，訪問drugbank數(shù)據(jù)庫、ttd數(shù)據(jù)庫、geo數(shù)據(jù)庫、genecards數(shù)據(jù)庫、omim數(shù)據(jù)庫和pharmgkb數(shù)據(jù)庫，將數(shù)據(jù)庫獲得的信息目標(biāo)名稱輸入到uniprot數(shù)據(jù)庫中，以獲得目的基因名稱；geo數(shù)據(jù)庫中搜索“pneumonia”、“bacterialpneumonia”的直接數(shù)據(jù)，得到轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，使用r工具進(jìn)行分析，得到公共數(shù)據(jù)庫靶點的交集，作為細(xì)菌性肺炎靶點數(shù)據(jù)庫。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建方法為：根據(jù)細(xì)菌性肺炎靶點庫與熱炎寧合劑靶點庫取得的交集基因，準(zhǔn)備輸入文件，將交集文件中的基因名拷貝到string數(shù)據(jù)庫相應(yīng)的方框內(nèi)；選擇“homosapiens”物種，得到構(gòu)建好的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；設(shè)置過濾條件，刪除游離結(jié)點，得到更清楚的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種熱炎寧合劑治療細(xì)菌性肺炎藥效成分的分析方法，基于超高效液相色譜四級桿飛行時間聯(lián)合質(zhì)譜（UPLC?Q/TOF?MS）對熱炎寧合劑藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行分析，同時聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對其抗感染機(jī)制進(jìn)行預(yù)測，得到GO富集分析和KEGG富集分析結(jié)果，為熱炎寧合劑藥效成分的分析及作用機(jī)制的研究提供了一種新的方法。

技術(shù)研發(fā)人員：杜成強(qiáng)
受保護(hù)的技術(shù)使用者：清華德人西安幸福制藥有限公司
技術(shù)研發(fā)日：
技術(shù)公布日：2024/12/17