本發(fā)明屬于生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種快速觀察擬南芥胚珠形態(tài)及統(tǒng)計(jì)外珠被細(xì)胞數(shù)目的方法。

背景技術(shù)：

胚珠是植物雌性生殖器官，是受精后發(fā)育為種子的結(jié)構(gòu)，因此胚珠發(fā)育是否正常，直接決定了植物能否形成種子繁衍后代。成熟胚珠由幾個(gè)特化的部分組成，包括孢子體組織（珠柄、珠被、珠心）和雌配子體組織（胚囊）。裸子植物一般只有一個(gè)珠被（integument）結(jié)構(gòu)覆蓋珠心形成封閉結(jié)構(gòu)，而被子植物的胚珠通常包括兩個(gè)珠被結(jié)構(gòu)，即由外珠被和內(nèi)珠被包裹珠心和胚囊(kelleyandgasser,2009)。胚珠受精后，珠被發(fā)育成種皮，對(duì)保護(hù)胚胎、種子傳播和種子發(fā)芽具有重要作用。而在胚珠發(fā)育過程中，珠被發(fā)育對(duì)胚珠軸向的建立和形態(tài)建成具有重要作用。胚珠發(fā)育過程中，孢子體和配子體之間存在信號(hào)交流，珠被發(fā)育缺陷往往導(dǎo)致胚囊裸露或胚囊發(fā)育異常，最終影響胚珠的受精而形成敗育(loraetal.,2011;yadegarianddrews,2004)。

擬南芥的胚珠很小，而且隱藏在雌蕊的中心，在觀察胚珠形態(tài)和統(tǒng)計(jì)外珠被細(xì)胞數(shù)目時(shí)要先將胚珠外面的組織器官去掉，只留下整個(gè)完整的胚珠進(jìn)行觀察?，F(xiàn)在國(guó)內(nèi)外常用的方法主要有一下的幾種方法：①電子顯微鏡掃描的方法：先將組織材料固定在4%（v/v）的戊二醛的磷酸緩沖液（25mm，ph=7.0）中過夜，然后再將樣品置于1%的四氧化鋨磷酸緩沖液（25mm，ph=7.0）中，在4℃冰箱中放置4-5天，然后再進(jìn)行電子顯微鏡掃描，成像后觀察胚珠珠被的形狀；②透明-干涉觀察方法：先將胚珠或者雌蕊固定在（福爾馬林:乙醇:乙酸:水=1:0.5:5:3.5）的固定液中過夜，然后用胚珠放置在含有透明液（水合氯醛:甘油:水=8:1:2）的載玻片上，蓋上蓋玻片，然后在olympus顯微鏡上觀察胚珠的形態(tài)；③石蠟切片的方法：先用faa固定液將胚珠或者雌蕊固定，然后用65%到100%系列濃度的乙醇溶液逐級(jí)脫水；無(wú)水乙醇到純二甲苯逐級(jí)透明；將低熔點(diǎn)的石蠟蠟屑放入盛有1/2二甲苯的小瓶中，直到二甲苯完全飽和；在40℃下浸蠟24h，然后用由混合石蠟在溫箱中60℃保溫浸蠟，每天換兩次混合蠟液，共72-120h；包埋，進(jìn)行厚度6-8μm切片，2%明膠粘片，在35℃水浴鍋上2h展片，之后再將載玻片放入38℃烘箱中烘干，用純二甲苯30℃保溫脫蠟40min，晾干切片；封片。最后在顯微鏡底下觀察胚珠的形態(tài)并且統(tǒng)計(jì)外珠被的細(xì)胞數(shù)目。

但是目前的這幾種方法在胚珠形態(tài)觀察和外珠被細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)方面，操作起來需要的時(shí)間比較長(zhǎng)，過程比較的繁瑣，同時(shí)相對(duì)而言效果一般，而且有的方法只能顧及一個(gè)方面的效果，如電子顯微鏡掃描的方法和dic顯微鏡觀察方法能夠看到胚珠和珠被的形態(tài)，但是在外珠被細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)上不占優(yōu)勢(shì)。因此，目前還沒有一種能夠快速有效的觀察擬南芥胚珠形態(tài)和統(tǒng)計(jì)外珠被細(xì)胞數(shù)目的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)目前還沒有一種能夠快速、有效地觀察擬南芥胚珠形態(tài)和統(tǒng)計(jì)外珠被細(xì)胞數(shù)目方法的問題，本發(fā)明提供的一種一種快速觀察擬南芥胚珠形態(tài)及統(tǒng)計(jì)外珠被細(xì)胞數(shù)目的方法，能夠快速有效觀察擬南芥胚珠形態(tài)和統(tǒng)計(jì)外珠被細(xì)胞數(shù)目的方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

（1）溶液的配制：配制1‰w/v熒光增白劑溶液和濃度為2m的氫氧化鉀的溶液；

（2）材料的獲得：取剛要露白的擬南芥花苞放置在貼有雙面膠的載玻片上，用注射器的針頭挑取擬南芥的胚珠；

（3）玻片制備：吸取1‰w/v熒光增白劑10μl置于載玻片上，將步驟（2）所得胚珠連同胎座置于熒光增白劑液滴上，再加入2m的氫氧化鉀溶液10μl，用移液槍輕輕混勻，蓋上蓋玻片；

（4）孵育：將步驟（3）制備好的玻片在室溫中放置10-15分鐘，讓熒光增白劑充分滲透進(jìn)入擬南芥的胚珠中；

（5）confocal顯微鏡拍照：將步驟（4）所得孵育好的玻片放置在confocal顯微鏡下，用波長(zhǎng)范圍在100～400nm之間的紫外線觀察，并拍照；

（6）外珠被細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)：統(tǒng)計(jì)步驟（5）所得照片中的外珠被細(xì)胞數(shù)目。

其中，步驟（1）所述熒光增白劑為calcoflourwhite,cat.no.c-clfr10。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明的方法是一種觀察擬南芥胚珠形態(tài)和統(tǒng)計(jì)外珠被細(xì)胞數(shù)目的方法，和之前的方法相比，能夠快速的有效的觀察擬南芥胚珠形態(tài)和統(tǒng)計(jì)外珠被細(xì)胞數(shù)目。

附圖說明

圖1本發(fā)明方法觀察到的擬南芥胚珠的形態(tài)

圖2透明-干涉方法觀察到擬南芥胚珠的形態(tài)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

一種快速觀察擬南芥胚珠形態(tài)及統(tǒng)計(jì)外珠被細(xì)胞數(shù)目的方法，其步驟如下：

（1）溶液的配制：準(zhǔn)備好高壓滅菌過的雙蒸水，然后用高壓過的無(wú)菌水配制1‰w/v的calcoflourwhite熒光增白劑溶液（cat.no.c-clfr10）和濃度為2m的氫氧化鉀的溶液；

（2）材料的獲得：取剛要露白的擬南芥的花苞放置在貼有雙面膠的載玻片上，用注射器的針頭撥開花瓣和雄蕊，然后切下柱頭，再用針頭把擬南芥雌蕊的心皮部分從中間剖開，最后用針頭將胎座上的胚珠取下來；

（3）玻片制備：用10μl的移液槍吸取1‰w/v熒光增白劑10μl放在載玻片上，然后用將上面所獲得的胚珠連同胎座放到熒光增白劑上面，再加入10μl的2m的氫氧化鉀的溶液，用移液槍輕輕的混勻一下，最后輕輕的蓋上蓋玻片；

（4）孵育：將步驟（3）制備好的玻片在室溫中放置10-15分鐘，讓熒光增白劑充分滲透進(jìn)入擬南芥的胚珠中；

（5）confocal顯微鏡拍照：將步驟（4）中孵育好的玻片放置在confocal顯微鏡下，用波長(zhǎng)范圍在100～400nm之間的紫外線觀察，然后拍照；

（6）外珠被細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)：統(tǒng)計(jì)步驟（5）所得照片中的外珠被細(xì)胞數(shù)目；

使用本方法所得擬南芥的胚珠形態(tài)如圖1所示，外珠被統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)見表1；圖2為透明-干涉方法觀察到擬南芥胚珠的形態(tài)。

表1本發(fā)明方法統(tǒng)計(jì)外株被實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)

比較圖1和圖2，可知本發(fā)明方法制片可使得擬南芥的胚珠形態(tài)和外珠被的細(xì)胞數(shù)目更加清晰清晰，說明本實(shí)施方式比透明-干涉方法獲得的結(jié)果更加優(yōu)異。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

技術(shù)特征：

技術(shù)總結(jié)
本發(fā)明提供一種快速觀察擬南芥胚珠形態(tài)及統(tǒng)計(jì)外株被細(xì)胞數(shù)目的方法，其利用熒光漂白劑處理擬南芥的胚珠，在共聚焦顯微鏡和普通光學(xué)顯微鏡下可以快速及時(shí)、快速地對(duì)擬南芥胚珠珠被細(xì)胞的數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。相比普通的切片及干涉差?透明的方法要簡(jiǎn)便，而且效果更好。

技術(shù)研發(fā)人員：秦源;蔡漢陽(yáng);張曼;趙麗華;王路路
受保護(hù)的技術(shù)使用者：福建農(nóng)林大學(xué)
技術(shù)研發(fā)日：2017.03.09
技術(shù)公布日：2017.07.14