一種基于金納米簇模擬酶試劑盒及其制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于金納米簇模擬酶試劑盒及其制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明基于金納米簇模擬酶試劑盒包括如下物質(zhì)：96孔聚苯乙烯微孔板、T3甲狀腺激素抗體或者乳腺癌抗體、金納米簇標(biāo)記的T3甲狀腺激素抗體或者金納米簇標(biāo)記的乳腺癌抗體、樣品稀釋液、PBS緩沖溶液、終止緩沖溶液、顯色底物。通過本發(fā)明方法，能得到不同顏色的金納米顆粒溶液，這種納米顆粒的顏色變化可根據(jù)雙氧水的濃度進(jìn)行調(diào)控，通過顏色以及吸光度值的變化達(dá)到了對(duì)T3甲狀腺激素以及乳腺癌抗原的超痕量檢測(cè)，并且具有非常高的靈敏度，本發(fā)明方法簡單，成本較低，靈敏度高，能夠?qū)崿F(xiàn)快速準(zhǔn)確的檢測(cè)。
【專利說明】一種基于金納米簇模擬酶試劑盒及其制備方法及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米生物傳感以及生物檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種基于金納米簇模擬酶試劑盒的制備以及應(yīng)用于T3甲狀腺激素及乳腺癌抗原的快速檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002]目前，乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7-10%，已成為威脅婦女健康的主要病因。由于癌癥早期癥狀不明顯，很難被及早發(fā)現(xiàn)，并且嚴(yán)重危害婦女健康，因而癌癥的早期診斷和治療仍是亟待解決的最重要的醫(yī)學(xué)問題之一。T3甲狀腺激素是維持機(jī)體正常代謝，促進(jìn)生長發(fā)育所必需的重要激素。甲狀腺激素主要是促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，特別是使骨、骨骼肌、肝等蛋白質(zhì)合成明顯增加，這對(duì)幼年時(shí)的生長、發(fā)育具有重要意義。而甲狀腺激素的過多或過少都會(huì)直接危害人體健康，促使疾病的產(chǎn)生。
[0003]金納米簇由于具有熒光強(qiáng)度高、強(qiáng)抗光漂白的能力、良好生物兼容性、低毒性和好的熒光穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)而得到廣泛關(guān)注。研宄表明金納米簇具有一定的催化能力，在金納米簇的存在下，H2O2能快速氧化3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB)使其變藍(lán)，基于此，我們建立一種雙模檢測(cè)的新方法，既可利用顏色變化對(duì)雙氧水進(jìn)行可視化半定量檢測(cè)，又可以通過吸光度的大小對(duì)雙氧水的準(zhǔn)確含量進(jìn)行定量檢測(cè)。同樣，金納米顆粒由于制備簡單方便、性質(zhì)較穩(wěn)定、生物相容性好等優(yōu)點(diǎn)被廣泛用于生命分析化學(xué)中。由氯金酸通過還原法可以方便地制備出各種不同粒徑的納米金顆粒，其顏色依直徑大小而呈紅色至藍(lán)色。同時(shí)，金納米顆粒隨直徑的變化呈現(xiàn)出不同的顏色，其紫外吸收峰也會(huì)相應(yīng)發(fā)生變化。在金納米顆粒的制備中，雙氧水溶液是重要的反應(yīng)物之一，而金納米簇能催化金納米顆粒制備條件中的雙氧水使其分解，之后雙氧水的濃度發(fā)生改變，金納米顆粒就會(huì)呈現(xiàn)出不同的顏色，從紅色、紫紅色至藍(lán)色。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一在于提供一種基于金納米簇模擬酶試劑盒，它快速準(zhǔn)確的檢測(cè)T3甲狀腺激素以及乳腺癌抗原，使金納米簇成功取代傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)中的生物酶，顯著提高檢測(cè)的靈敏度以及穩(wěn)定性。
[0005]本發(fā)明基于金納米簇模擬酶試劑盒，它包括如下物質(zhì):96孔聚苯乙烯微孔板、T3甲狀腺激素抗體或者乳腺癌抗體、金納米簇標(biāo)記的T3甲狀腺激素抗體或者金納米簇標(biāo)記的乳腺癌抗體、樣品稀釋液、PBS緩沖溶液、終止緩沖溶液、顯色底物。
[0006]具體的，所述金納米簇標(biāo)記的T3甲狀腺激素抗體是:使用活化劑EDC和NHS對(duì)金納米簇進(jìn)行活化之后，將T3甲狀腺激素抗體加入到活化后的金納米簇溶液中，反應(yīng)2小時(shí)，透析處理24小時(shí)所得；所述金納米簇標(biāo)記的乳腺癌抗體是:使用活化劑EDC和NHS對(duì)金納米簇進(jìn)行活化之后，將乳腺癌抗體加入到活化后的金納米簇溶液中，反應(yīng)2小時(shí)，透析處理24小時(shí)所得。
[0007]具體的，所述樣品稀釋液是:將T3甲狀腺激素溶液首先用NaOH溶液進(jìn)行稀釋之后，再用pH = 7.2—7.4、濃度為0.0lmol/L的PBS緩沖溶液稀釋成濃度為2X10_12至2X 10_16mg/mL的溶液；或者是:將乳腺癌抗原用pH = 7.2—7.4、濃度為0.01mol/L的PBS緩沖溶液稀釋成濃度為7.52X 10_9至7.52X10 _14U/mL的溶液。
[0008]具體的，所述顯色底物是以濃度為4mmol/L的檸檬酸三鈉溶液、濃度為320 ymol/L的雙氧水溶液和濃度為2mmol/L的氯金酸溶液所制備的金納米顆粒溶液，三種溶液的體積比為1:1:1。
[0009]具體的，所述終止緩沖溶液為濃度為lmg/mL的BSA溶液。
[0010]本發(fā)明的目的之二在于提供上述基于金納米簇模擬酶試劑盒的制備方法，它包括如下步驟:
[0011](I)將T3甲狀腺激素抗體或者乳腺癌抗體接到96孔聚苯乙烯微孔板上，4°C下反應(yīng)過夜，三次PBS緩沖溶液沖洗后，加入終止緩沖溶液即濃度為lmg/mL的BSA溶液反應(yīng)I小時(shí)；
[0012](2)三次PBS緩沖溶液沖洗后，再在不同微孔板中加入各種濃度的樣品稀釋液，即稀釋成濃度為2 X 10_12至2 X 1-1WmL的T3甲狀腺激素溶液或者稀釋成濃度為7.52 X 10_9至7.52X 10_14U/mL的乳腺癌抗原溶液，反應(yīng)3小時(shí)；
[0013](3)三次PBS緩沖溶液沖洗后，再對(duì)應(yīng)加入金納米簇標(biāo)記的T3甲狀腺激素抗體或者金納米簇標(biāo)記的乳腺癌抗體，反應(yīng)3小時(shí)；
[0014](4)再用PBS緩沖溶液沖洗三次，然后加入檸檬酸三鈉溶液以及雙氧水溶液，反應(yīng)40分鐘后，加入氯金酸溶液；30分鐘后，觀察不同微孔板中溶液顏色的變化，與對(duì)比實(shí)驗(yàn)中生成的顯色底物金納米顆粒溶液即檸檬酸三鈉溶液、雙氧水溶液和氯金酸溶液所制備的金納米顆粒溶液的顏色進(jìn)行對(duì)比；并用紫外分光光度計(jì)在波長450nm-700nm的范圍內(nèi)測(cè)其譜圖的變化，并記錄不同濃度的樣品稀釋液在波長550nm處的吸光度值，與對(duì)照試驗(yàn)中生成的顯色底物金納米顆粒溶液的吸光度值進(jìn)行對(duì)比，即能得到檢測(cè)結(jié)果，實(shí)現(xiàn)T3甲狀腺激素以及乳腺癌抗原的快速檢測(cè)。
[0015]具體的，步驟(3)所述金納米簇標(biāo)記的T3甲狀腺激素抗體是:使用活化劑EDC和NHS對(duì)金納米簇進(jìn)行活化之后，將T3甲狀腺激素抗體加入到活化后的金納米簇溶液中，反應(yīng)2小時(shí)，透析處理24小時(shí)所得；步驟(3)所述金納米簇標(biāo)記的乳腺癌抗體是:使用活化劑EDC和NHS對(duì)金納米簇進(jìn)行活化之后，將乳腺癌抗體加入到活化后的金納米簇溶液中，反應(yīng)2小時(shí)，透析處理24小時(shí)所得。
[0016]具體的，步驟中(4)所述加入檸檬酸三鈉溶液、雙氧水溶液以及氯金酸溶液中，檸檬酸三鈉溶液濃度為4mmol/L，雙氧水溶液濃度為320 μ mol/L，氯金酸溶液濃度為2mmol/L，三種溶液的體積比為1:1:1 ;步驟(4)中所述對(duì)比實(shí)驗(yàn)中生成的顯色底物金納米顆粒溶液是:以濃度為4mmol/L的梓檬酸三鈉溶液、濃度為320 ymol/L的雙氧水溶液和濃度為2mmol/L的氯金酸溶液所制備的金納米顆粒溶液，三種溶液的體積比為1:1:1。
[0017]本發(fā)明的目的之三在于提供上述基于金納米簇模擬酶試劑盒的制備方法的應(yīng)用，即應(yīng)用于人體血清中的T3甲狀腺激素含量檢測(cè)或者人體血清中的乳腺癌抗原含量檢測(cè)。
[0018]具體的，對(duì)T3甲狀腺激素含量的檢測(cè)限值為2X 10_15mg/mL ;對(duì)乳腺癌抗原的檢測(cè)限值為 7.52Xl(T13U/mL。
[0019]本發(fā)明利用金納米簇催化并分解雙氧水的特性，把金納米簇與金納米顆粒這兩種納米材料有機(jī)的結(jié)合起來，利用金納米簇取代酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)中的生物酶，再加上抗體與抗原的特異性結(jié)合，形成了“三明治”的夾層結(jié)構(gòu)，成功制備出檢測(cè)T3甲狀腺激素以及乳腺癌抗原的模擬酶試劑盒，且現(xiàn)象明顯，操作簡便，靈敏度高，能有效準(zhǔn)確的測(cè)定出人血清中T3甲狀腺激素的含量以及乳腺癌抗原的濃度。
[0020]通過本發(fā)明的方法處理，能得到不同顏色的金納米顆粒溶液，這種納米顆粒的顏色變化可根據(jù)雙氧水的濃度進(jìn)行調(diào)控，通過顏色以及吸光度值的變化達(dá)到了對(duì)T3甲狀腺激素以及乳腺癌抗原的超痕量檢測(cè)，并且具有非常高的靈敏度，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法簡單，成本較低，靈敏度高，能夠?qū)崿F(xiàn)快速準(zhǔn)確的檢測(cè)，并且對(duì)于其它生物大分子以及疾病的檢測(cè)都具有十分重要的參考價(jià)值，具有很廣闊的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1制備的在不同濃度的雙氧水條件下的金納米顆粒的紫外光譜圖。其中，隨著雙氧水濃度的增大，金納米顆粒的吸光度值逐漸變大。
[0022]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1制備的在不同濃度的雙氧水條件下的金納米顆粒在550nm處的吸光度值變化曲線圖。在雙氧水的濃度小于320 ymol/L時(shí)，吸光度值隨著雙氧水濃度的增大而逐漸升高，但當(dāng)雙氧水的濃度大于320 ymol/L時(shí)，其吸光度值不再發(fā)生明顯的變化。因此我們選取雙氧水的濃度為320 μ mol/L時(shí)作為制備試劑盒時(shí)的最佳檢測(cè)濃度。
[0023]圖3為本發(fā)明實(shí)施例1制備的在不同濃度的雙氧水條件下的金納米顆粒的顏色變化對(duì)照?qǐng)D片。在雙氧水的濃度小于320 ymol/L時(shí)，制備的金納米顆粒為藍(lán)色，此時(shí)金納米簇顆粒已經(jīng)發(fā)生了團(tuán)聚，但當(dāng)雙氧水的濃度大于320 μ mol/L時(shí)，制備的金納米顆粒為紅色，此時(shí)所得為分散均勻的金納米顆粒溶液；圖3中，從左至右，左邊4個(gè)溶液的顏色從無色逐漸變?yōu)樗{(lán)色，從第5個(gè)之后變?yōu)榧t色，并且顏色逐漸加深。
[0024]圖4為本發(fā)明實(shí)施例1制備的在雙氧水的濃度大于320 ymol/L時(shí)制備的紅色溶液的金納米顆粒的透射電鏡圖。從圖4中可以看出，制備的金納米顆粒分散均勻。
[0025]圖5為本發(fā)明實(shí)施例1制備的在雙氧水的濃度小于320 ymol/L時(shí)制備的藍(lán)色溶液的金納米顆粒的透射電鏡圖。從圖5中可以看出，制備的金納米顆粒已發(fā)生了明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象。
[0026]圖6為本發(fā)明實(shí)施例4中對(duì)T3甲狀腺激素標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)時(shí)的顯色底物以及對(duì)比實(shí)驗(yàn)的顯色底物在550nm處的吸光度值柱狀圖。圖6中，每組柱狀中左邊黑色柱狀圖表示對(duì)比實(shí)驗(yàn)的顯色底物在550nm處的吸光度值大小。
[0027]圖7為本發(fā)明實(shí)施例4中對(duì)T3甲狀腺激素標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)時(shí)的顯色底物以及對(duì)比實(shí)驗(yàn)顯色底物的顏色變化對(duì)照?qǐng)D片。圖7中，上一排的溶液為對(duì)比實(shí)驗(yàn)顯色底物。
[0028]圖8為本發(fā)明實(shí)施例4中對(duì)T3甲狀腺激素標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)時(shí)的顯色底物以及對(duì)比實(shí)驗(yàn)的顯色底物在550nm處吸光度值變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0029]圖9為本發(fā)明實(shí)施例5中將基于金納米簇模擬酶試劑盒應(yīng)用于10個(gè)不同人血清中T3甲狀腺激素含量檢測(cè)時(shí)顯色底物以及對(duì)比實(shí)驗(yàn)顯色底物的顏色變化對(duì)照?qǐng)D片。圖9中，上一排的溶液為對(duì)比實(shí)驗(yàn)顯色底物。
[0030]圖10為本發(fā)明實(shí)施例6中對(duì)乳腺癌抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)時(shí)的顯色底物以及對(duì)比實(shí)驗(yàn)的顯色底物在550nm處的吸光度值柱狀圖。圖10中，每組柱狀中左邊黑色柱狀圖表示對(duì)比實(shí)驗(yàn)的顯色底物在550nm處的吸光度值大小。
[0031]圖11為本發(fā)明實(shí)施例6中對(duì)乳腺癌抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)時(shí)的顯色底物以及對(duì)比實(shí)驗(yàn)顯色底物的顏色變化對(duì)照?qǐng)D片。圖11中，上一排的溶液為對(duì)比實(shí)驗(yàn)顯色底物。
[0032]圖12為本發(fā)明實(shí)施例6中對(duì)乳腺癌抗原標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)時(shí)的顯色底物以及對(duì)比實(shí)驗(yàn)的顯色底物在550nm處吸光度值變化的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
[0033]圖13為本發(fā)明實(shí)施例7中將基于金納米簇模擬酶試劑盒應(yīng)用于5個(gè)不同人血清中乳腺癌抗原含量檢測(cè)時(shí)顯色底物以及對(duì)比實(shí)驗(yàn)顯色底物的顏色變化對(duì)照?qǐng)D片。上一排的溶液為對(duì)比實(shí)驗(yàn)顯色底物。

【具體實(shí)施方式】
[0034]下面結(jié)合具體實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
[0035]實(shí)施例1:
[0036]取9支離心管，分別向其中加入100 μ L檸檬酸三鈉溶液作為穩(wěn)定劑，之后分別加入 100 μ L 不同濃度的雙氧水溶液(濃度為 120、160、200、240、280、320、360、400、440 μ mo I/L)、100 μ L氯金酸溶液(濃度為2mmol/L)。加入的梓檬酸三鈉溶液、氯金酸溶液、雙氧水溶液的體積比為1:1:1。置于室溫下反應(yīng)，15分鐘后，觀察溶液顏色變化，此時(shí)所制得溶液即為金納米顆粒溶液，所制得的金納米顆粒在波長550nm左右有明顯的吸收峰。用紫外分光光度計(jì)在波長450nm-700nm的范圍內(nèi)檢測(cè)其紫外光譜圖的變化，并記錄在不同濃度的雙氧水的條件下550nm波長處的吸光度值。圖1、圖2、圖3、圖4、圖5為本實(shí)施例制備的在不同濃度下的金納米顆粒的實(shí)驗(yàn)特性圖。
[0037]從圖中可得出，當(dāng)雙氧水的濃度小于320 ymol/L，隨著雙氧水濃度的增大，生成的金納米顆粒的吸光度值逐漸增大，此時(shí)溶液為藍(lán)色，已經(jīng)發(fā)生了明顯的團(tuán)聚，當(dāng)其濃度到320 μ mol/L時(shí)隨著雙氧水濃度的增大，其吸光度值不再發(fā)生明顯的變化，此時(shí)溶液為紅色，所得溶液為分散均勻的金納米顆粒。
[0038]實(shí)施例2:
[0039]取5只離心管，分別向其中加入濃度為10mmol/L、8mmol/L、4mmol/L、2mmol/L、lmmol/L的梓檬酸三鈉溶液，之后再加入濃度為320 μ mol/L的雙氧水溶液和濃度為2mmol/L的氯金酸溶液。加入的檸檬酸三鈉溶液、氯金酸溶液、雙氧水溶液的體積比為1:1 do 15分鐘后，觀察溶液顏色變化。隨著檸檬酸三鈉溶液濃度的變化，制備的金納米顆粒顏色也不相同。當(dāng)檸檬酸三鈉溶液的濃度為2mmol/L時(shí)，溶液為無色，為4mmol/L時(shí)，溶液為紅色，因此可以說，當(dāng)朽1檬酸三鈉的濃度為4mmol/L時(shí)，為最佳濃度。
[0040]實(shí)施例3:
[0041]取5只離心管，分別向其中加入濃度為0.004mol/L的梓檬酸三鈉溶液和濃度為320 μ mol/L的雙氧水溶液，之后再分別向其中加入濃度為lmmol/L、l.5mmol/L、2mmol/L、
2.5mmol/L、3.0mmoI/L的氯金酸溶液。加入的檸檬酸三鈉溶液、氯金酸溶液、雙氧水溶液的體積比為1:1:1。15分鐘后，觀察溶液顏色變化。當(dāng)氯金酸溶液的濃度小于2mmol/L時(shí)，溶液的顏色為紫紅色，當(dāng)氯金酸溶液的濃度大于2mmol/L時(shí)，溶液變?yōu)樗{(lán)色，因此，當(dāng)氯金酸溶液的濃度為2mmol/L時(shí)，為最佳濃度。
[0042]實(shí)施例4:
[0043]參見圖6、圖7、圖8，用于T3甲狀腺激素的檢測(cè)。首先在96孔聚苯乙烯微孔板中加入T3甲狀腺激素抗體，40C反應(yīng)過夜后，用PBS緩沖溶液沖洗三次，加入BSA溶液反應(yīng)I小時(shí)后，用PBS緩沖溶液沖洗三次，再加入不同濃度的T3甲狀腺激素(2 X 10_12?2 X 10 _16mg/mL)反應(yīng)3小時(shí)，再次PBS緩沖溶液沖洗三次之后，加入已經(jīng)連接上金納米簇的T3甲狀腺激素抗體反應(yīng)3小時(shí)，同樣用PBS緩沖溶液沖洗三次，加入100 μ L濃度為4mM的檸檬酸三鈉溶液和100 μ L濃度為320 μ mol/L的雙氧水溶液反應(yīng)40分鐘，再加入100 μ L濃度為2mmol/L的氯金酸溶液。30分鐘后，其紫外吸收譜圖以及顏色變化對(duì)照?qǐng)D如圖6、圖7所示。當(dāng)T3甲狀腺激素的濃度為O時(shí)，微孔板中金納米顆粒的顏色為紅色，此時(shí)在微孔板中并沒有形成三明治的夾心結(jié)構(gòu)，即沒有連接上有催化作用的金納米簇對(duì)雙氧水進(jìn)行分解，生成了紅色溶液，而在不同濃度的T3甲狀腺激素的條件下，由于T3甲狀腺激素抗體與抗原的特異性結(jié)合作用，在微孔板中形成了夾心結(jié)構(gòu)，在生成金納米顆粒時(shí)，金納米簇對(duì)雙氧水溶液起到了分解的作用，因此形成了藍(lán)色溶液。當(dāng)T3甲狀腺激素的濃度為2X10_16mg/mL時(shí)，此時(shí)T3甲狀腺激素的濃度已經(jīng)很小，所連接上的金納米簇的量已經(jīng)很少，無法分解雙氧水，達(dá)到了對(duì)T3甲狀腺激素的檢測(cè)限，其檢測(cè)限為2 X 10_15mg/mL。
[0044]實(shí)施例5:
[0045]用于人血清中T3甲狀腺激素含量的檢測(cè)。首先在96孔聚苯乙烯微孔板中加入T3甲狀腺激素抗體，4°C反應(yīng)過夜后，用PBS緩沖溶液沖洗三次，加入BSA溶液反應(yīng)I小時(shí)后，用PBS緩沖溶液沖洗三次再加入稀釋16倍的人血清。反應(yīng)3小時(shí)，再次PBS緩沖溶液沖洗三次之后，加入已經(jīng)連接上金納米簇的T3甲狀腺激素抗體反應(yīng)3小時(shí)，同樣用PBS緩沖溶液沖洗三次，加入100 μ L濃度為4mM的檸檬酸三鈉溶液和100 μ L濃度為320 μ mol/L的雙氧水溶液反應(yīng)40分鐘，再加入100 μ L濃度為2mmol/L的氯金酸溶液。30分鐘后，其顏色變化如圖9所示，當(dāng)T3甲狀腺激素的濃度為O時(shí)，微孔板中金納米顆粒的顏色為紅色，而在加入不同人血清之后的微孔板中，溶液顏色變化不同，即不同人血清中的T3甲狀腺激素含量不同。通過實(shí)驗(yàn)檢測(cè)得到的10個(gè)不同人血清中甲狀腺激素的含量為3.06X10_7mg/mL、7.47 X 10 6mg/mL、1.8X10 7mg/mL、1.47 X 10 6mg/mL、2.32 X 10 6mg/mL、1.59 X 10 6mg/mL、5.12 X 10 7mg/mL、4.87 X 10 7mg/mL、2.55 X 10 7mg/mL、7.44 X 10 7mg/mL。
[0046]實(shí)施例6:
[0047]參見圖10、圖11、圖12，用于乳腺癌抗原的檢測(cè)。首先在96孔聚苯乙烯微孔板中加入乳腺癌抗體，4°C反應(yīng)過夜后，用PBS緩沖溶液沖洗三次，加入BSA溶液反應(yīng)I小時(shí)后，用PBS緩沖溶液沖洗三次再加入不同濃度的乳腺癌抗原(7.52X 10_9—7.52 X 10_14U/mL)反應(yīng)3小時(shí)，再次PBS緩沖溶液沖洗三次之后，加入已經(jīng)連接上金納米簇的乳腺癌抗體反應(yīng)3小時(shí)，同樣用PBS緩沖溶液沖洗三次，加入100 μ L濃度為4mM的檸檬酸三鈉溶液和100 μ L濃度為320 μ mol/L的雙氧水溶液反應(yīng)40分鐘，再加入100 μ L濃度為2mmol/L的氯金酸溶液。30分鐘后，其紫外吸收光譜圖以及顏色變化對(duì)照如圖10、圖11所示，當(dāng)乳腺癌抗原的濃度為O時(shí)，微孔板中金納米顆粒的顏色為紅色，此時(shí)在微孔板中并沒有形成三明治的夾心結(jié)構(gòu)，即沒有連接上有催化作用的金納米簇對(duì)雙氧水進(jìn)行分解，生成了紅色溶液，而在不同濃度的乳腺癌抗原的條件下，由于乳腺癌抗體與抗原的特異性結(jié)合作用，在微孔板中形成了夾心結(jié)構(gòu)，在生成金納米顆粒時(shí)，金納米簇對(duì)雙氧水溶液起到了分解的作用，因此形成了藍(lán)色溶液。當(dāng)乳腺癌抗原的濃度為7.52X 10_14U/mL時(shí)，此時(shí)乳腺癌抗原的濃度已經(jīng)很小，所連接上的金納米簇的量已經(jīng)很少，無法分解雙氧水，達(dá)到了對(duì)乳腺癌抗原的檢測(cè)限，其檢測(cè)限為 7.52Xl(T13U/mL。
[0048]實(shí)施例7:
[0049]用于人血清乳腺癌抗原含量的檢測(cè)。首先在5個(gè)96孔聚苯乙烯微孔板孔中分別加入乳腺癌抗體，4°C反應(yīng)過夜后，用PBS緩沖溶液沖洗三次，加入BSA溶液反應(yīng)I小時(shí)后，用PBS緩沖溶液沖洗三次再加入稀釋1ltl倍的人血清。反應(yīng)3小時(shí)，再次PBS緩沖溶液沖洗三次之后，加入已經(jīng)連接上金納米簇的乳腺癌抗體反應(yīng)3小時(shí)，同樣用PBS緩沖溶液沖洗三次，加入100 μ L濃度為4mM的檸檬酸三鈉溶液和100 μ L濃度為320 μ mol/L的雙氧水溶液反應(yīng)40分鐘，再加入100 μ L濃度為2mmol/L的氯金酸溶液。30分鐘后，其顏色變化如圖13所示，當(dāng)乳腺癌抗原的濃度為O時(shí)，微孔板中金納米顆粒的顏色為紅色，而在加入不同人血清之后的微孔板中，溶液顏色變化不同，即不同人血清中的乳腺癌抗原含量不同。通過實(shí)驗(yàn)檢測(cè)得到的5個(gè)不同人血清中乳腺癌抗原的含量為2.7X 10_1QU/M1、1.08X 10_1QU/mL、
3.79X 10_lclU/mL、3.24X 10_lclU/mL、5.19 X 10_lclU/mL。
【權(quán)利要求】
1.一種基于金納米簇模擬酶試劑盒，其特征在于包括如下物質(zhì):96孔聚苯乙烯微孔板、T3甲狀腺激素抗體或者乳腺癌抗體、金納米簇標(biāo)記的T3甲狀腺激素抗體或者金納米簇標(biāo)記的乳腺癌抗體、樣品稀釋液、PBS緩沖溶液、終止緩沖溶液、顯色底物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于金納米簇模擬酶試劑盒，其特征在于:所述金納米簇標(biāo)記的T3甲狀腺激素抗體是:使用活化劑EDC和NHS對(duì)金納米簇進(jìn)行活化之后，將T3甲狀腺激素抗體加入到活化后的金納米簇溶液中，反應(yīng)2小時(shí)，透析處理24小時(shí)所得；所述金納米簇標(biāo)記的乳腺癌抗體是:使用活化劑EDC和NHS對(duì)金納米簇進(jìn)行活化之后，將乳腺癌抗體加入到活化后的金納米簇溶液中，反應(yīng)2小時(shí)，透析處理24小時(shí)所得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于金納米簇模擬酶試劑盒，其特征在于:所述樣品稀釋液是:將T3甲狀腺激素溶液首先用NaOH溶液進(jìn)行稀釋之后，再用pH = 7.2—7.4、濃度為.0.01mol/L的PBS緩沖溶液稀釋成濃度為2 X 10_12至2 X 10 _16mg/mL的溶液；或者是:將乳腺癌抗原用PH = 7.2—7.4、濃度為0.01mol/L的PBS緩沖溶液稀釋成濃度為7.52X 10_9至.7.52Xl(T14U/mL 的溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于金納米簇模擬酶試劑盒，其特征在于:所述顯色底物是以濃度為4mmol/L的檸檬酸三鈉溶液、濃度為320 μ mo I/L的雙氧水溶液和濃度為2mmol/L的氯金酸溶液所制備的金納米顆粒溶液，三種溶液的體積比為1:1:1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于金納米簇模擬酶試劑盒，其特征在于:所述終止緩沖溶液為濃度為lmg/mL的BSA溶液。
6.一種如權(quán)利要求1所述基于金納米簇模擬酶試劑盒的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (1)將T3甲狀腺激素抗體或者乳腺癌抗體接到96孔聚苯乙烯微孔板上，4°C下反應(yīng)過夜，三次PBS緩沖溶液沖洗后，加入終止緩沖溶液即濃度為lmg/mL的BSA溶液反應(yīng)I小時(shí)； (2)三次PBS緩沖溶液沖洗后，再在不同微孔板中加入各種濃度的樣品稀釋液，即稀釋成濃度為2 X 10_12至2 X 10 _16mg/mL的T3甲狀腺激素溶液或者稀釋成濃度為7.52X 10_9至.7.52X 10_14U/mL的乳腺癌抗原溶液，反應(yīng)3小時(shí)； (3)三次PBS緩沖溶液沖洗后，再對(duì)應(yīng)加入金納米簇標(biāo)記的T3甲狀腺激素抗體或者金納米簇標(biāo)記的乳腺癌抗體，反應(yīng)3小時(shí)； (4)再用PBS緩沖溶液沖洗三次，然后加入檸檬酸三鈉溶液以及雙氧水溶液，反應(yīng)40分鐘后，加入氯金酸溶液；30分鐘后，觀察不同微孔板中溶液顏色的變化，與對(duì)比實(shí)驗(yàn)中生成的顯色底物金納米顆粒溶液即檸檬酸三鈉溶液、雙氧水溶液和氯金酸溶液所制備的金納米顆粒溶液的顏色進(jìn)行對(duì)比；并用紫外分光光度計(jì)在波長450nm-700nm的范圍內(nèi)測(cè)其譜圖的變化，并記錄不同濃度的樣品稀釋液在波長550nm處的吸光度值，與對(duì)比實(shí)驗(yàn)中生成的顯色底物金納米顆粒溶液的吸光度值進(jìn)行對(duì)比，即能得到檢測(cè)結(jié)果，實(shí)現(xiàn)T3甲狀腺激素以及乳腺癌抗原的快速檢測(cè)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述基于金納米簇模擬酶試劑盒的制備方法，其特征在于:步驟(3)所述金納米簇標(biāo)記的T3甲狀腺激素抗體是:使用活化劑EDC和NHS對(duì)金納米簇進(jìn)行活化之后，將T3甲狀腺激素抗體加入到活化后的金納米簇溶液中，反應(yīng)2小時(shí)，透析處理24小時(shí)所得；步驟(3)所述金納米簇標(biāo)記的乳腺癌抗體是:使用活化劑EDC和NHS對(duì)金納米簇進(jìn)行活化之后，將乳腺癌抗體加入到活化后的金納米簇溶液中，反應(yīng)2小時(shí)，透析處理24小時(shí)所 得。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述基于金納米簇模擬酶試劑盒的制備方法，其特征在于:步驟(4)所述加入檸檬酸三鈉溶液、雙氧水溶液以及氯金酸溶液中，檸檬酸三鈉溶液濃度為4mmol/L，雙氧水溶液濃度為320 ymol/L，氯金酸溶液濃度為2mmol/L，三種溶液的體積比為1:1:1 ;步驟(4)中所述對(duì)比實(shí)驗(yàn)中生成的顯色底物金納米顆粒溶液是:以濃度為4mmol/L的檸檬酸三鈉溶液、濃度為320 μ mo I/L的雙氧水溶液和濃度為2mmol/L的氯金酸溶液所制備的金納米顆粒溶液，三種溶液的體積比為1:1:1。
9.一種如權(quán)利要求6所述基于金納米簇模擬酶試劑盒的制備方法的應(yīng)用，其特征在于:應(yīng)用于人體血清中的T3甲狀腺激素含量檢測(cè)或者人體血清中的乳腺癌抗原含量檢測(cè)。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述基于金納米簇模擬酶試劑盒的制備方法的應(yīng)用，其特征在于:對(duì)T3甲狀腺激素含量的檢測(cè)限值為2X10-15mg/mL;對(duì)乳腺癌抗原的檢測(cè)限值為.7.52Xl(T13U/mL0
【文檔編號(hào)】G01N33/78GK104502614SQ201510037912
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2015年1月26日 優(yōu)先權(quán)日:2015年1月26日
【發(fā)明者】黃昊文, 趙倩, 陳甚娜, 張凌陽, 周媛, 劉蘭芳 申請(qǐng)人:湖南科技大學(xué)