狂犬疫苗接種效果快速評價試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實用新型屬于生物檢測領域，具體涉及一種狂犬疫苗接種效果快速評價試劑盒。所述試劑盒包括盒體、裝有樣品稀釋液的容器和檢測試紙，所述檢測試紙是由底板（1）和相互緊密搭接粘貼在底板上的樣品墊（6）、抗原墊（5）、標記物結合墊（4）、包被膜（3）和吸收墊（2）組成，根據(jù)WHO推薦的狂犬抗體最低保護滴度水平，將試劑盒的最低檢測線設定為0.5IU/ml，用于檢測血清/血漿/全血中的抗狂犬病毒IgG抗體。本實用新型所述的試劑盒成本低廉，制備工藝簡單，檢測血清抗體的結果與ELISA試劑盒的結果無顯著差異適，可以用于狂犬疫苗接種后免疫效果的快速評價。
【專利說明】狂犬疫苗接種效果快速評價試劑盒

【技術領域】
[0001]本實用新型屬于生物檢測領域，具體涉及一種狂犬疫苗接種效果快速評價試劑盒。

【背景技術】
[0002]狂犬病是病毒性人畜共患病，在100多個國家和地區(qū)均有發(fā)生。99%的人狂犬病都來自病犬，犬狂犬病對超過33億人構成潛在的威脅。人感染后一旦出現(xiàn)臨床癥狀，幾乎100%致命。每年大約有5.5萬人死于狂犬病，絕大多數(shù)死亡發(fā)生在亞洲和非洲的農(nóng)村地區(qū)。僅印度一個國家，估計每年死亡人數(shù)為2萬(即死亡率約為2/10萬)，而非洲地區(qū)每年死亡率更高，約為4/10萬。
[0003]狂犬病毒屬彈狀病毒科的狂犬病毒屬。人通常在被帶毒動物咬傷或抓傷皮膚后發(fā)生感染。該病也可通過感染性物質(通常為唾沫)直接接觸受害者的粘膜或新近皮膚破損處傳染，其他方式的感染較為罕見。該病的潛伏期通常為1-3個月，短則不到一周，長則一年以上。潛伏期長短取決于感染的病毒數(shù)量、病毒侵入處的神經(jīng)分布和咬傷部位與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的距離等因素。病毒經(jīng)周圍神經(jīng)可傳遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)，一旦到達大腦，就迅速復制并擴散，經(jīng)神經(jīng)系統(tǒng)擴散至許多不同的組織，出現(xiàn)臨床癥狀時，病毒已遍布全身。
[0004]自40多年前，經(jīng)濃縮純化的細胞培養(yǎng)和雞胚培養(yǎng)的狂犬病疫苗研制成功以來，已被證實可安全有效地預防狂犬病。這些疫苗既可用于暴露前預防，也可用于暴露后預防，并已為全球無數(shù)人接種。目前可獲得的狂犬病疫苗均可迅速誘導出針對狂犬病毒6蛋白的高水平的病毒中和抗體反應。但我們仍有必要對狂犬病疫苗的免疫效果進行評價。世衛(wèi)組織規(guī)定的血清病毒中和抗體最低保護滴度為0.51^1,已被廣泛用作參考值。當前市場上檢測狂犬抗體的商品化試劑盒多采用酶聯(lián)免疫法和化學發(fā)光法，這些方法雖然靈敏度高、結果準確、化學發(fā)光試劑還可以對抗體進行定量，但在實際操作上存在諸多不便，如步驟復雜、耗時較長，還需使用特定的儀器設備；試劑盒需41保存；對樣品要求靜脈采血等，不易在基層普及運用。
[0005]免疫膠體金快速診斷技術是建立在酶聯(lián)免疫吸附試驗、乳膠凝集試驗、單克隆抗體技術和免疫膠體金標記技術基礎上，以膠體金為標記物，利用特異的抗原抗體反應放大反應信號，通過直接觀察就可以判定結果的新技術。該技術具有簡單、快速、準確和無污染等優(yōu)點，在臨床醫(yī)學檢測、動物醫(yī)學檢測、激素檢測、食品安全檢測、藥物殘留和毒品快速檢測等諸多診斷領域迅速發(fā)展。目前，膠體金標記的快速檢測抗體的檢測試紙都是由樣品墊、標記物結合墊、包被膜(其上劃有檢測線、質控線)和吸收墊組成，根據(jù)檢測原理的不同大體分為兩種:一種是將抗原標金，在標記物結合墊上包被膠體金標記的抗原，在包被膜上用待測抗體的抗體劃膜得到檢測I線；另一種是將抗原劃膜，在標記物結合墊上包被膠體金標記的待測抗體的抗體，在包被膜上用抗原劃膜得到檢測I線?，F(xiàn)有研究表明:因為抗體蛋白性質較為穩(wěn)定，所以對抗體蛋白的膠體金標記較為穩(wěn)定，因此上述第一種方法所述的抗原的膠體金標記則存在頗多問題，因為抗原多為病毒類，性質多樣，有的大小甚至比膠體金顆粒還大，且穩(wěn)定性較差，因此很難直接將抗原標記在膠體金顆粒上；即使勉強能將抗原標記上，也需要抗原達到極高的純度，而對抗原病毒的純化是一項難度較大、成本較高的工程；也有人尋找抗原的重組抗原來代替這些天然抗原，但是很多抗原很難尋到能替代的重組抗原，而且即使有，成本也是極高的，由此說明，上述第一種方法的局限性比較高。上述的第二種方法使用待測抗體的抗體進行金標記，這種方法可以避免抗原金標記的問題，但在包被膜上使用抗原劃膜得到檢測I線，需要抗原具有較高的濃度和純度，這也增加了產(chǎn)品生產(chǎn)的成本和難度；另外將抗原劃到膜上，由于抗原穩(wěn)定性較差，抗原劃膜后很難長時間保存，因此試紙條的有效期極短。這些都是限制抗體快速檢測類試劑盒快速發(fā)展的原因。


【發(fā)明內容】

[0006]本實用新型針對現(xiàn)有技術的不足，目的在于提供一種狂犬疫苗接種效果快速評價試劑盒，
[0007]用該試劑盒對接種者體內血清中的狂犬病毒I姊抗體進行膠體金法快速檢測，可以實現(xiàn)對狂犬疫苗接種效果的快速評價。
[0008]本使用新型所采用的技術方案為:
[0009]狂犬疫苗接種效果快速評價試劑盒，包括盒體、裝有樣品稀釋液的容器和檢測試紙，所述裝有樣品稀釋液的容器和檢測試紙位于盒體內，其特征在于，所述檢測試紙是由底板和相互緊密搭接粘貼在底板上的樣品墊、抗原墊、標記物結合墊、包被膜和吸收墊組成，所述抗原墊上包被有狂犬病毒抗原，所述標記物結合墊上包被有膠體金標記的鼠抗狂犬單克隆抗體，所述包被膜上固定有檢測I線和質控線，所述檢測I線上包被有鼠抗人I姊抗體，所述質控線上包被有羊抗鼠I姊抗體；所述檢測試紙的最低檢測線為0.51^1.
[0010]按上述方案，所述樣品稀釋液為含磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉和疊氮鈉的混合水溶液。
[0011]按上述方案，所述抗原墊為玻璃纖維、無紡布或聚酯膜。
[0012]按上述方案，所述底板為底板，所述底板的一面為雙面膠。
[0013]按上述方案，所述包被膜為硝酸纖維素膜。
[0014]按上述方案，所述標記物結合墊和樣品墊為玻璃纖維，所述吸收墊為吸水紙。
[0015]按上述方案，所述抗原墊的制備方法為:使用抗原保護液將狂犬病毒抗原進行稀釋后均勻鋪在玻璃纖維、無紡布或聚酯膜上，置于371，相對濕度低于40%的環(huán)境中，干燥4小時，制成抗原墊；所述抗原保護液的配方為728，版收？0及62知，檸檬酸三鈉8.58，鹿糖10&疊氮鈉18，水定容至；所述狂犬病毒抗原為粗抗原，其中抗原的含量為
40被％?50被％。
[0016]本實用新型中，所述試劑盒中檢測試紙的檢測原理為:在樣品墊加入血清或血漿或全血樣品，再加入2?3滴樣品稀釋液，若樣品中含有狂犬病毒I姊抗體，其將和抗原墊中的狂犬病毒抗原形成狂犬病毒抗原-狂犬病毒I姊抗體復合物，該復合物向前移動，復合物中的狂犬病毒抗原再與標記物結合墊中的膠體金標記的鼠抗狂犬單克隆抗體結合，形成狂犬病毒I姊抗體-狂犬病毒抗原-膠體金標記的鼠抗狂犬單克隆抗體免疫復合物，該復合物由于層析作用沿紙條向前移動，至檢測I線，復合物中的狂犬病毒I姊抗體與檢測丁線上包被的鼠抗人186抗體反應形成鼠抗人186抗體-狂犬病毒186抗體-狂犬病毒抗原-膠體金標記的鼠抗狂犬單克隆抗體免疫復合物，該復合物可聚集在檢測區(qū)，當聚集的復合物達到一定的數(shù)量時，則形成一條肉眼可見的條帶(1線)，判斷結果為陽性；若樣品中不含有或含很少量的狂犬病毒I姊抗體，則不能形成免疫復合物，即不能形成肉眼可見的條帶，判斷結果為陰性 ? 線作為試劑的質控標準，陽性和陰性檢測樣品均會產(chǎn)生條帶。
[0017]同時，依據(jù)世界衛(wèi)生組織(1?))推薦的血清中狂犬病毒的最低保護抗體滴度水平為0.51 口加1，即當接種者體內狂犬病毒抗體的濃度? 0.51 口加1，說明狂犬疫苗接種成功，當接種者體內狂犬病毒抗體的濃度? 0.511/1111，說明狂犬疫苗接種不成功。本實用新型中，將試劑盒的靈敏度設置為0.51仏！111，狂犬病毒I姊抗體的檢測結果為陽性即表明狂犬疫苗接種成功，狂犬病毒I姊抗體的檢測結果為陰性即表明狂犬疫苗接種不成功。因此，本實用新型所述的試劑盒可以實現(xiàn)快速評價狂犬疫苗的接種效果。
[0018]本實用新型試劑盒的使用方法:將檢測試紙平放，在樣品墊加入59 1血樣，再加入2?3滴樣品稀釋液，用肉眼直接觀察在20分鐘內檢測I線和質控線的顯色情況:質控線不顯色，說明本試驗失??；質控線顯色，檢測I線不顯色說明狂犬疫苗接種不成功；質控線和檢測I線均顯色說明狂犬疫苗接種成功。
[0019]本實用新型的有益效果:
[0020](1)與現(xiàn)有技術相比，本實用新型所述的檢測試紙增加了抗原墊的結構，通過在抗原墊上加入抗原保護液并包被狂犬病毒抗原，在標記物結合墊上包被鼠抗狂犬單克隆抗體，解決了狂犬病毒抗原由于穩(wěn)定性差而不容易被標記的問題；另一方面，本實用新型采用鼠抗人I姊抗體劃膜得到檢測I線，因為抗體相比較為穩(wěn)定，因此試紙條的有效期較長。
[0021](2)本實用新型所述狂犬病毒抗原為粗抗原，不需對粗抗原進一步純化就能達到反應效果，這是因為在試紙條反應層析過程中，已經(jīng)通過雙抗體夾心法對粗抗原進行了篩選和純化，保證了試劑反應的特異性，因此檢測試紙的制備成本低，利于推廣應用；實驗結果表明，利用本實用新型所述的檢測試紙檢測狂犬病毒I姊抗體，檢測的結果與此檢測結果一致。
[0022](3)與現(xiàn)有技術相比，本實用新型所述的試劑盒具有快速、簡便、靈敏、特異的特點，擺脫了試劑對設備、儀器、人員及儲存盒運輸環(huán)境的特殊要求，將試劑盒的靈敏度設置為0.51 口加1，可以實現(xiàn)對狂犬疫苗接種效果的快速評估。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為本實用新型的試劑盒整體結構示意圖，其中八-盒體，8-裝有樣品稀釋液的容器，0檢測試紙，0-說明書。
[0024]圖2為本實用新型的試劑盒中檢測試紙的結構示意圖，其中，1-底板，2-吸收墊，3-包被膜，4-標記物結合墊，5-抗原墊，6-樣品墊，7-質控線，8-檢測丁線。

【具體實施方式】
[0025]為了更好地理解本實用新型，下面結合實施例進一步闡明本實用新型的內容，但本實用新型的內容不僅僅局限于下面的實例。
[0026]如圖1所示，狂犬疫苗接種效果快速評價試劑盒，其特征在于，包括盒體八、裝有樣品稀釋液的容器8和檢測試紙0，所述檢測試紙是由底板1和相互緊密搭接粘貼在底板上的樣品墊6、抗原墊5、標記物結合墊4、包被膜3和吸收墊2組成，所述抗原墊上包被有狂犬病毒抗原，所述標記物結合墊上包被有膠體金標記的鼠抗狂犬單克隆抗體，所述包被膜上固定有檢測I線8和質控線7，所述檢測I線上包被有鼠抗人I姊抗體，所述質控線上包被有羊抗鼠I姊抗體；所述檢測試紙的最低檢測線為0.51^1.
[0027]盒體4內放置有說明書0。
[0028]所述樣品稀釋液為含磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉和疊氮鈉的混合水溶液。以下實施例中，樣品稀釋液的組分為:磷酸氫二鈉5.728，磷酸二氫鈉0.62?，氯化鈉88，疊氮鈉0.58，超純水定容至11。
[0029]所述底板為底板，所述底板的一面為雙面膠。
[0030]所述包被膜為硝酸纖維素膜；所述抗原墊為玻璃纖維、無紡布或聚酯膜。
[0031]所述標記物結合墊和樣品墊為玻璃纖維，所述吸收墊為吸水紙。
[0032]所述抗原墊通過使用抗原保護液將狂犬病毒抗原進行稀釋后均勻鋪在玻璃纖維、無紡布或聚酯膜上獲得，所述抗原為粗抗原，其中抗原的含量為40被％?50被％。
[0033]實施例1狂犬病毒I姊抗體檢測試紙條
[0034]1、主要材料
[0035]抗原:狂犬抗原，購自疫苗生產(chǎn)單位，為粗純，但已滅活，不具有生物危害，用于制備抗原墊。
[0036]鼠抗人I姊抗體，購自廈門波生生物技術有限公司，用于硝酸纖維素膜I線的包被。
[0037]鼠抗狂犬單克隆抗體，購自武漢賽欣生物技術有限公司，用于標記膠體金。
[0038]羊抗鼠I姊抗體，購自杭州隆基生物技術有限公司，用于硝酸纖維素膜質控線的包被。
[0039]氯金酸:81職121公司產(chǎn)品。
[0040]硝酸纖維素膜公司產(chǎn)品。
[0041]牛血清白蛋白(83八；?、酪蛋白公司產(chǎn)品。
[0042]其余化學試劑均為分析純試劑。
[0043]臨床血清一部分由公司在武漢市血液中心獲得，另一部分從疾控中心已注射狂犬疫苗的人群獲得，其中狂犬病毒I姊抗體陽性樣本190份，陰性樣本110份。
[0044]狂犬病毒I姊抗體檢測試劑盒法):購自北鄭州安圖生物工程股份有限公司，國內已注冊的商用產(chǎn)品。
[0045]2、標記物結合墊的制備
[0046]氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑為40鹽的膠體金溶液，制備完成后，取10001膠體金溶液置于磁力攪拌器上緩慢攪拌，調節(jié)邱至8.0，然后按每10001膠體金溶液0.5呢抗體加入鼠抗狂犬病毒單克隆抗體0.51118，繼續(xù)攪拌30111111，再加入終濃度為1%的8“進行封閉，繼續(xù)攪拌30111111。標記結束后，以1000017111111對標記液進行離心，棄上清，然后將沉淀用復溶溶液進行復溶至原體積，所述復溶溶液的配方為:1481.965^2.58，檸檬酸三鈉2.58，吐溫-200.5001，蔗糖10.08，疊氮鈉1.0^用超純水定容至1匕將復溶好的金標記溶液按每“溶液鋪1801112的比例均勻鋪在玻璃纖維上，置于371，相對濕度低于20%的環(huán)境中，干燥12-18小時，制成標記物結合墊。
[0047]3、抗原墊的制備
[0048]將狂犬病毒抗原使用抗原保護液進行稀釋到8倍得到抗原液，將稀釋好的抗原液按每1111溶液鋪18(31112的比例均勻鋪在玻璃纖維上，置于371，相對濕度低于40 %的環(huán)境中，干燥4小時，制成抗原墊。所述抗原保護液的配方為728，版^2？0辦6248，檸檬酸三鈉8.5〖，鹿糖108，疊氮鈉18，純化水定容至1匕
[0049]4、包被膜的制備
[0050]使用0.021，邱為7.2的磷酸鹽緩沖液將鼠抗人I姊抗體分別稀釋成1.5呢加1 (1線溶液)，羊抗鼠I姊抗體稀釋至1.0！^加1 (0線溶液)。然后使用劃膜儀將I線與線溶液按1.5111/0111的出液量均勻地包被于從:膜上，^0膜已事先黏貼于塑料底板上，包被完成后，將％膜置于371，相對濕度低于40%的環(huán)境中，干燥3?4小時，制成包被膜。
[0051]5、狂犬病毒I姊抗體檢測試紙條的組裝
[0052]在干燥環(huán)境下(溫度20?251，相對濕度低于30% )，將包被膜置于潔凈環(huán)境中，在％膜的了線端，標記物結合墊(結合墊已事先切裁成6111111寬)緊密壓接％膜2111111，抗原墊(抗原墊已事先切裁成川臟寬)緊密壓接結合墊另一側樣品墊緊密壓接抗原墊另一側4?5111111，最后用切條機將貼好的底板切成4111111寬的試紙條。
[0053]6、狂犬病毒I姊抗體檢測試紙條的使用方法
[0054]將待檢血清或血漿或全血(待檢樣品)平衡至室溫，制備好的試紙條平放于試驗臺上，在樣品墊處加入5111待檢樣品，再加入2?3滴樣品稀釋液，若樣品中含有狂犬病毒I姊抗體，樣品加入后，人狂犬I姊抗體先與抗原墊中狂犬抗原形成狂犬抗原-狂犬病毒I姊抗體復合物，復合物向前移動，與標記物結合墊中的金標記的鼠抗狂犬單克隆抗體形成狂犬I姊抗體-狂犬抗原-金標記的鼠抗狂犬單克隆抗體免疫復合物，該復合物由于層析作用沿紙條向前移動，至檢測I線與鼠抗人I姊抗體反應形成鼠抗人I姊抗體-狂犬I姊抗體-狂犬抗原-金標記的鼠抗狂犬單克隆抗體免疫復合物，該復合物可聚集在檢測區(qū)，當聚集的復合物達到一定的數(shù)量時，則形成一條肉眼可見的條帶(1線)，判斷結果為陽性；若樣品中不含有或含很少量的狂犬I姊抗體，則不能形成免疫復合物，則不能形成肉眼可見的條帶，判斷結果為陰性。線作為試劑的質控標準，陽性和陰性檢測樣品均會產(chǎn)生條帶。用肉眼直接觀察試紙條在20分鐘內的出線情況，并判定檢測結果。
[0055]7、根據(jù)世界衛(wèi)生組織規(guī)定的狂犬病毒I姊抗體的最低保護滴度為0.51^1,當狂犬病毒I姊抗體濃度? 0.51^/1111說明人體對狂犬病毒具有抵抗性，當狂犬病毒I姊抗體濃度? 0.51^1說明人體對狂犬病毒還沒有產(chǎn)生抵抗性，因此本試紙條將檢測狂犬病毒I姊抗體的檢測臨界值設置為0.51^/1111, X線顯線表明狂犬病毒I姊抗體的濃度? 0.51 口加1，狂犬疫苗接種成功，I線不顯線表明狂犬病毒I姊抗體的濃度? 0.5幾加1，狂犬疫苗接種不成功。
[0056]8、臨床樣品檢測結果對照
[0057]對公司收集的臨床血清樣本使用本申請試紙條及商用檢測￡[13八試劑盒同時進行檢測，再對檢測結果進行對照。
[0058]以試劑盒為對照，對狂犬病毒I姊抗體進行檢測，檢測出190份狂犬病毒I姊陽性樣本，110份狂犬病毒I姊陰性樣本，而本試紙條檢測出190份狂犬病毒I姊陽性樣本，110份狂犬病毒I姊陰性樣本，總體符合率為100.0%。臨床檢測結果表明，本試劑盒的性能與￡11 “試劑盒相比無顯著差異，說明本實用新型適合用于臨床檢驗，具有實用價值。
[0059]顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的實例，而并非對實施方式的限制。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而因此所引申的顯而易見的變化或變動仍處于本實用新型創(chuàng)造的保護范圍之內。
【權利要求】
1.狂犬疫苗接種效果快速評價試劑盒，包括盒體、裝有樣品稀釋液的容器和檢測試紙，所述裝有樣品稀釋液的容器和檢測試紙位于盒體內，其特征在于，所述檢測試紙是由底板和相互緊密搭接粘貼在底板上的樣品墊、抗原墊、標記物結合墊、包被膜和吸收墊組成，所述抗原墊上包被有狂犬病毒抗原，所述標記物結合墊上包被有膠體金標記的鼠抗狂犬單克隆抗體，所述包被膜上固定有檢測T線和質控C線，所述檢測T線上包被有鼠抗人IgG抗體，所述質控C線上包被有羊抗鼠IgG抗體；所述檢測試紙的最低檢測線為0.5IU/ml。
2.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述抗原墊為玻璃纖維、無紡布或聚酯膜。
3.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述底板為PVC底板，所述PVC底板的一面為雙面膠。
4.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述包被膜為硝酸纖維素膜。
5.根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述標記物結合墊和樣品墊為玻璃纖維，所述吸收墊為吸水紙。
【文檔編號】G01N33/577GK204203234SQ201420636029
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年10月29日 優(yōu)先權日:2014年10月29日
【發(fā)明者】吳邊, 張薇, 倪龍泉, 王方杰, 金玉翠, 龔華岳 申請人:武漢生命科技股份有限公司