用于檢測范可尼貧血的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型公開了一種用于檢測范可尼貧血的試劑盒，包括盒體(1)、盒蓋(3)和設(shè)置在盒體(1)內(nèi)的襯墊(2)，所述襯墊(2)上設(shè)有小孔，裝有紅細(xì)胞裂解液的試劑管(4)、裝有RIPA細(xì)胞裂解液的試劑管(5)、裝有加樣緩沖液的試劑管(6)、裝有g(shù)lycine tris/SDS緩沖液的試劑管(7)、裝有g(shù)lycine tris轉(zhuǎn)膜緩沖液的試劑管(8)、裝有抗體IgG1的試劑管(9)、裝有抗體IgG-HRP的試劑管(10)、裝有PBS-tween洗液的試劑管(11)、裝有化學(xué)發(fā)光液的試劑管(12)、裝有顯影定影液的試劑管(13)、裝有BSA封閉液的試劑管(14)、裝有PBS溶液的試劑管(15)被設(shè)置在所述小孔內(nèi)。該試劑盒可用于檢測范可尼貧血的情況，檢測方法快捷方便，檢測敏感度高。
【專利說明】用于檢測范可尼貧血的試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種用于檢測范可尼貧血的試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002]范可尼貧血(Fanconi anemia)是一種發(fā)生在常染色體或X染色體上的隱性遺傳疾病，由染色體的不穩(wěn)定性和畸形造成的。經(jīng)常伴隨發(fā)生進(jìn)行性骨髓衰竭，白血病以及腫瘤等疾病。目前有15個(gè)FA基因已被發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)A蛋白參與一般的DNA修復(fù)信號通路以及FA/BRCA信號通路。而在這些信號通路中最重要的一點(diǎn)是在DNA損傷中形成的FANCD2的單泛素化，此泛素化是經(jīng)由FA上游蛋白(A，B，C，E，F(xiàn)，G，I^PM)形成的FA核心蛋白復(fù)合體介導(dǎo)組成的大核E3泛素連接酶復(fù)合體引導(dǎo)的過程。單泛素化FANCD2和FANCI的異二聚體會與下游的 FA 蛋白(FANCD1/BRCA2, FANCN/PALB2, FNACJ/BRIP1, FANCP/SLX4, RAD51C, BRACI)進(jìn)行反應(yīng)，在FANl提供核酸酶活性的條件下參與DNA鏈交聯(lián)修復(fù)(ICLs)。FA病人經(jīng)常伴有各樣先天性畸形病，比如身材矮小癥，F(xiàn)anconi畸形面孔，小眼畸形，拇指與橈骨畸形，皮膚色素沉著過度以及心臟，腎臟，泌尿生殖等畸形。FA病人經(jīng)常在第一個(gè)或第二個(gè)10年發(fā)展成為骨髓衰竭，但是對于大多數(shù)患者來說，疑似FA的診斷往往在全血細(xì)胞減少癥狀出來后才得以重視，甚至在有些病人中，直到出現(xiàn)MDS/AML出現(xiàn)后才得以最終確診。胎兒血紅蛋白，血清阿爾法胎兒蛋白和巨紅細(xì)胞癥經(jīng)常在FA中發(fā)現(xiàn)，但是他們的缺失并不能確保沒有FA。另外有相當(dāng)數(shù)量的病人盡管不會發(fā)展到骨髓衰竭但是仍然有惡化的危險(xiǎn)。
[0003]測序是目前早期確定范可尼貧血的唯一技術(shù)，技術(shù)方案是檢測所有范可尼貧血蛋白的基因，提取待檢測者外周血，進(jìn)行DNA提取，然后上機(jī)做測序，測序結(jié)果進(jìn)行比對，找出相關(guān)突變與否，來判斷是否為陽性患者。本技術(shù)成本昂貴，由于測序儀器本身很貴，數(shù)據(jù)結(jié)果龐大，難于分析，所以造成檢測費(fèi)用也非常巨大，一般測全要8000以上，就是測定最常見的FANCA，F(xiàn)ANCC, FANCG基因突變，也要5，6千元人民幣。第二就是結(jié)果分析復(fù)雜，由于涉及蛋白數(shù)量很大，大量測序結(jié)果，耗費(fèi)工時(shí)，并且有些突變難以判斷為有義突變。第三結(jié)果的準(zhǔn)確性也存在質(zhì)疑，只能給出參考，除非對典型的突變可以準(zhǔn)確外，其他狀況只可作為參考。
[0004]所以一個(gè)明確簡潔的診斷方法迫在眉睫,而運(yùn)用western blot方法檢測FANCD2單泛素化可以確診FANCD2上游以及自身突變所造成的FA，而這已經(jīng)占了 FA總發(fā)病率的90%以上，特異性幾乎可達(dá)100%。
實(shí)用新型內(nèi)容
[0005]為了解決上述技術(shù)問題，本實(shí)用新型的目的在于提供一種用于檢測范可尼貧血的的試劑盒，可以快速、準(zhǔn)確地檢測范可尼貧血。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型采取的技術(shù)方案是:一種用于檢測范可尼貧血的試劑盒，包括盒體(I)、盒蓋(3)和設(shè)置在盒體(I)內(nèi)的襯墊(2)，所述襯墊(2)上設(shè)有小孔，裝有紅細(xì)胞裂解液的試劑管(4)、裝有RIPA細(xì)胞裂解液的試劑管(5)、裝有加樣緩沖液的試劑管(6)、裝有g(shù)lycine tris/SDS緩沖液的試劑管(7)、裝有g(shù)lycine tris轉(zhuǎn)膜緩沖液的試劑管(8)、裝有抗體IgGl的試劑管(9)、裝有抗體IgG-HRP的試劑管(10)、裝有PBS-tween洗液的試劑管(11)、裝有化學(xué)發(fā)光液的試劑管(12)、裝有顯影定影液的試劑管(13)、裝有BSA封閉液的試劑管(14)、裝有PBS溶液的試劑管(15)被設(shè)置在所述小孔內(nèi)。
[0007]根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述試劑盒還包括:裝有去離子水的試劑管(16)。
[0008]根據(jù)本實(shí)用新型的實(shí)施例，所述襯墊(2)上設(shè)有13個(gè)小孔，所述小孔在所述襯墊
(2)上分成3排平行排列。
[0009]通過以上技術(shù)方案，本實(shí)用新型的有益效果如下:
[0010]第一，F(xiàn)ANCD2單泛素化做為范可尼貧血指標(biāo)有極高的特異性，而westernblot技術(shù)可以清楚表明單泛素化的缺失與否以及FANCD2本體蛋白突變與否。結(jié)果直觀，判讀容易，特異性極聞。
[0011]第二，對儀器依賴程度不高，只需要跑垂直蛋白電泳的相關(guān)儀器，轉(zhuǎn)膜相關(guān)儀器，顯影相關(guān)儀器試劑等可替代簡易儀器，無需核心精密儀器，無需統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)分析軟件等。所需儀器成本低廉。
[0012]第三，western blot成本相比同類檢測范可尼貧血技術(shù)成本低廉，尤其隨著樣本量的增大，成本大幅度縮小。相比起測序，需要測定幾十個(gè)范可尼蛋白基因來說，成本會小很多。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為本實(shí)用新型的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0014]圖2為使用本實(shí)用新型的試劑盒檢測范可尼貧血的試驗(yàn)結(jié)果，其中(a)正常，(b)異常；
[0015]附圖標(biāo)記說明
[0016]1-盒體、3-盒蓋、2-襯墊、4-裝有紅細(xì)胞裂解液的試劑管、5-裝有RIPA細(xì)胞裂解液的試劑管、6-裝有加樣緩沖液的試劑管、7-裝有g(shù)lycine tris/SDS緩沖液的試劑管、8-裝有g(shù)lycine tris轉(zhuǎn)膜緩沖液的試劑管、9-裝有抗體IgGl試劑管、10-裝有抗體IgG-HRP的試劑管、11-裝有PBS-tween洗液的試劑管、12-裝有化學(xué)發(fā)光液的試劑管、13-裝有顯影定影液的試劑管、14-裝有BSA封閉液的試劑管、15-裝有PBS溶液的試劑管、16-裝有去離子水的試劑管。

【具體實(shí)施方式】
[0017]下面結(jié)合實(shí)施例對本實(shí)用新型的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步描述，本實(shí)用新型的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本實(shí)用新型的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本實(shí)用新型的精神和范圍下可以對本實(shí)用新型技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本實(shí)用新型的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0018]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0019]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0020]如圖1所示，本實(shí)用新型提供了一種用于檢測范可尼貧血的試劑盒，包括盒體(I)、盒蓋(3)和設(shè)置在盒體(I)內(nèi)的襯墊(2)，所述襯墊(2)上設(shè)有小孔，裝有紅細(xì)胞裂解液的試劑管(4)、裝有RIPA細(xì)胞裂解液的試劑管(5)、裝有加樣緩沖液的試劑管￠)、裝有g(shù)lycine tris/SDS緩沖液的試劑管(7)、裝有g(shù)lycine tris轉(zhuǎn)膜緩沖液的試劑管(8)、裝有抗體IgGl的試劑管(9)、裝有抗體IgG-HRP的試劑管(10)、裝有PBS-tween洗液的試劑管
(II)、裝有化學(xué)發(fā)光液的試劑管(12)、裝有顯影定影液的試劑管(13)、裝有BSA封閉液的試劑管(14)、裝有PBS溶液的試劑管(15)被設(shè)置在所述小孔內(nèi)。
[0021]其中，所述試劑盒還包括:裝有去離子水的試劑管(16)。
[0022]其中，所述襯墊(2)上設(shè)有13個(gè)小孔，所述小孔在所述襯墊(2)上分成3排平行排列。
[0023]材料與儀器
[0024]濕轉(zhuǎn)模具天能公司
[0025]紅細(xì)胞裂解液美國BD公司
[0026]RIPA細(xì)胞裂解液美國圣克魯斯公司
[0027]加樣緩沖液美國伯樂公司
[0028]glycine tris/SDS緩沖液美國伯樂公司
[0029]glycine tris轉(zhuǎn)膜緩沖液美國伯樂公司
[0030]硝酸纖維膜美國伯樂公司
[0031]FANCD2 FI17 mouse monoclonal IgGl 美國圣克魯斯公司
[0032]goat ant1-mouse IgG-HRP 美國圣克魯斯公司
[0033]0.2% PBS-tween洗液美國伯樂公司
[0034]化學(xué)發(fā)光液美國伯樂公司
[0035]顯影定影液柯達(dá)公司
[0036]BSA封閉液采用5%小牛血清在tween PBS洗液中稀釋美國西格瑪公司
[0037]PBS溶液將母液稀釋成I倍美國伯樂公司
[0038]檢測步驟如下:
[0039]1.提取患者的8-10ml外周血，以1700rpm轉(zhuǎn)速離心5min，提取白細(xì)胞層，然后置于10倍體積IX紅細(xì)胞裂解液中，渦旋混勻，在常溫下避光放置15min ;之后以1700rpm轉(zhuǎn)速離心5min，可見白色細(xì)胞沉淀，棄上清液，采用去離子水或PBS溶液洗滌沉淀；然后以200g (或1700rpm)轉(zhuǎn)速離心5min，去上清，根據(jù)沉淀量加入20-50 μ I RIPA溶液，充分混勻，冰上避光放置45min。在4°C的低溫高速離心機(jī)中以14800rpm轉(zhuǎn)速離心15min，吸取上清至新的EP管中，加入6X加樣緩沖液，在95°C孵育1min ;樣本制備完畢，以進(jìn)行下一步的跑膠步驟。
[0040]2.垂直電泳:制備7%聚丙烯胺凝膠、lXglycine/Tris/SDS緩沖液垂直電泳緩沖液，堆積膠內(nèi)電壓控制在60-80伏，分離膠內(nèi)電壓控制在100-120伏之間，跑膠持續(xù)90min-120mino
[0041]3.轉(zhuǎn)膜與封閉:采取濕轉(zhuǎn)法，具體為在濕轉(zhuǎn)模具中配置20%甲醇的IXglycine/Tris轉(zhuǎn)膜緩沖液，在4攝氏度下保存；采用0.45 μ m規(guī)格的硝酸纖維膜或者PVDF膜作為轉(zhuǎn)膜材料，開始時(shí)的恒壓為200伏特，10分鐘后轉(zhuǎn)化為恒流0.45安培，持續(xù)90min結(jié)束；配置2% BSA封閉液，用0.2% PBS-tween洗液稀釋，將轉(zhuǎn)好的膜放入封閉液中室溫勻速搖動I小時(shí)。
[0042]4.雜交洗膜:封閉得到的膜，用0.2 % PBS-tween洗液清洗3次，每次5分鐘；放入FANCD2—抗雜交液(1:1000稀釋)中，室溫雜交2小時(shí)，或者在4°C雜交12小時(shí)；之后采用0.2 % PBS-tween洗液洗膜4次，每次10分鐘；然后放入小鼠二抗雜交液(1: 5000稀釋)中，室溫雜交I小時(shí)，用0.2% PBS-tween洗液洗膜3次，每次10分鐘。
[0043]5.化學(xué)發(fā)光及顯影:在室溫下采用化學(xué)發(fā)光液處理雜交后的膜lmin，置入暗盒內(nèi)暗室曝光lOmin，在柯達(dá)顯影定影液中顯影定影，最后采用清水洗凈后，晾干、即可觀察膠片上的蛋白條帶。
[0044]結(jié)果判讀依據(jù):如圖2所示，圖2(a)為正常FANCD2蛋白，其是兩條帶，一條帶在162kd，一條帶在155kd，其中20%的患者也表現(xiàn)出兩條帶，需要再進(jìn)一步采用DEB遺傳學(xué)方法和分子測序確定；而圖2(b)為異?；颊叩腇ANCD2蛋白，其缺失上面一條單泛素化條帶，而呈現(xiàn)出只有一條條帶的狀況，這時(shí)可判斷其為范可尼貧血患者。
[0045]上面已經(jīng)舉例說明了本實(shí)用新型的實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本實(shí)用新型的精神和范圍下可以對本實(shí)用新型技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本實(shí)用新型的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測范可尼貧血的試劑盒，其特征在于包括盒體(I)、盒蓋(3)和設(shè)置在盒體⑴內(nèi)的襯墊(2)，所述襯墊⑵上設(shè)有小孔，裝有紅細(xì)胞裂解液的試劑管(4)、裝有RIPA細(xì)胞裂解液的試劑管(5)、裝有加樣緩沖液的試劑管￠)、裝有g(shù)lycine tris/SDS緩沖液的試劑管(7)、裝有g(shù)lycine tris轉(zhuǎn)膜緩沖液的試劑管(8)、裝有抗體IgGl的試劑管(9)、裝有抗體IgG-HRP的試劑管(10)、裝有PBS-tween洗液的試劑管(11)、裝有化學(xué)發(fā)光液的試劑管(12)、裝有顯影定影液的試劑管(13)、裝有BSA封閉液的試劑管(14)、裝有PBS溶液的試劑管(15)被設(shè)置在所述小孔內(nèi)。
2.按照權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括:裝有去離子水的試劑管(16) ο
3.按照權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:所述襯墊(2)上設(shè)有13個(gè)小孔，所述小孔在所述襯墊(2)上分成3排平行排列。
【文檔編號】G01N33/532GK204086280SQ201420430312
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年7月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月31日
【發(fā)明者】李悠南, 陳欣, 熊凱, 程宇, 梁超, 王緒華, 陳忠, 黃士昂, 方國偉 申請人:北京海思特臨床檢驗(yàn)所有限公司