一種快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙的制作方法
【專利摘要】本實(shí)用新型公開了一種快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙，所述膠體金試紙包括支撐墊片5，位于所述支撐墊片上的硝酸纖維素膜1，所述硝酸纖維素膜的一端連接吸水墊4，另一端連接偶合物墊片2，所述偶合物墊片連接樣本墊片3，所述樣本墊片另一端部的下方設(shè)有第一固定部件7，上方設(shè)有第二固定部件6，其特征在于，所述硝酸纖維素膜1中間部位檢測線8包被有Gal-3抗體，檢測線兩邊分別設(shè)有控制線9，所述偶合物墊片2上涂布有金標(biāo)記的Gal-3單克隆抗體或多克隆抗體以及控制線偶合物。
【專利說明】一種快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型屬于臨床醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域，具體涉及一種用于定量檢測半乳糖凝集素-3 (Gal-3)的膠體金試紙。
【背景技術(shù)】
[0002]半乳糖凝集素-3(Galectin-3，Gal_3)也稱半乳糖結(jié)合蛋白_3，分子量為31kD，是半乳糖凝集素家族的重要成員之一。Galectin家族的成員需要滿足兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn):第一對-半乳糖的親和力；第二在糖識別域(the carbohydrate recognition domain, CRD)有顯著序列相似性。Galectin-3有兩個(gè)功能域:羧基端是糖識別域，包含了 135個(gè)氨基酸殘基；氨基端包含100?150個(gè)氨基酸殘基，由富含脯氨酸和甘氨酸的9個(gè)氨基酸殘基串聯(lián)重復(fù)組成。Galectin-3主要在巨噬細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及肥大細(xì)胞中表達(dá)。其功能依據(jù)其在細(xì)胞內(nèi)的定位。在靜止細(xì)胞內(nèi)主要存在于胞漿，而在增殖細(xì)胞中則主要存在于細(xì)胞核。Galectin-3參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，抗凋亡，介導(dǎo)細(xì)胞黏附，參與血管形成及炎癥反應(yīng)等生物學(xué)功能。研究表明半乳糖凝集素-3是心肌纖維化標(biāo)志物，與心力衰竭的發(fā)生和死亡風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。心室功能障礙患者的半乳糖凝集素-3含量會升高，而且含量于心衰的嚴(yán)重程度直接相關(guān)?？焖俣繖z測患者的半乳糖凝集素-3水平具有重大的臨床意義。
[0003]免疫膠體金技術(shù)(Immune colloidal gold technique)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸(HAuC14)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。
[0004]目前，檢測半乳糖凝集素-3(Gal-3)的方法目前主要是酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)，ELISA技術(shù)存在以下缺點(diǎn):檢測設(shè)備要求高，成本高；干擾因素較多，重復(fù)性不好；檢測時(shí)間長。因此酶聯(lián)免疫技術(shù)檢測半乳糖凝集素-3不適合臨床快速診斷。鑒于目前尚無快速的定量檢測方法，本實(shí)用新型的目的是提供一種可用于快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙以及一種可用于快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙盒，所述膠體金試紙和膠體金試紙盒具有方便快捷、操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
實(shí)用新型內(nèi)容
[0005]本實(shí)用新型的一個(gè)目的是提供一種快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙，本實(shí)用新型所述的半乳糖凝集素-3的膠體金試紙具有方便快捷、操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，適于臨床快速診斷。
[0006]本實(shí)用新型的技術(shù)方案是:[0007]—種快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙，包括支撐墊片5，位于所述支撐墊片上的硝酸纖維素膜1，所述硝酸纖維素膜的一端連接吸水墊4，另一端連接偶合物墊片2，所述偶合物墊片連接樣本墊片3，所述樣本墊片另一端部的下方設(shè)有第一固定部件7，上方設(shè)有第二固定部件6，其特征在于，所述硝酸纖維素膜I中間部位檢測線8包被有Gal-3抗體，檢測線兩邊分別設(shè)有控制線9，所述偶合物墊片2上涂布有金標(biāo)記的Gal_3單克隆抗體或多克隆抗體以及控制線偶合物。
[0008]優(yōu)選地,所述控制線9包被有抗DNP抗體,所述控制線偶合物為DNP-BSA標(biāo)記的膠體金。BSA是牛血清白蛋白。
[0009]優(yōu)選地，所述第一固定部件7為雙面膠，第二固定部件6為單面膠。
[0010]優(yōu)選地，所述兩條控制線9與檢測線8為平行設(shè)置。
[0011]本實(shí)用新型的另一個(gè)目的是提供了一種快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙盒，在本實(shí)用新型所述的定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙的基礎(chǔ)上還包括一外殼10。
[0012]所述外殼優(yōu)選塑料外殼。
[0013]所述外殼包裹所述試紙，露出樣本墊片3、硝酸纖維素膜I上的檢測線8和兩條控制線9、以及吸水墊4。
[0014]本實(shí)用新型所述的試紙盒具有方便攜帶和貯存的優(yōu)點(diǎn)。
[0015]本實(shí)用新型所述的快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙或試紙盒的工作原理是:采用雙向側(cè)流免疫反應(yīng)原理，通過雙抗體夾心法制備而成。檢驗(yàn)時(shí)樣本中的Gal-3抗原首先與偶合墊上的抗Gal-3抗體偶合物發(fā)生免疫反應(yīng)，形成免疫復(fù)合物。其后免疫復(fù)合物隨著樣本在硝基纖維素膜上層析流動，當(dāng)免疫復(fù)合物層析至硝基纖維素膜上的檢測區(qū)(Gal-3檢測線)時(shí)，與預(yù)先包被在硝基纖維素膜上的抗GAL-3抗體發(fā)生反應(yīng)從而被固定在硝基纖維素膜的檢測線上。血液中的GAL-3越多，檢測線上的復(fù)合物越多，條帶上的光密度值就越高。同時(shí)，在檢測過程中，控制線偶合物(即DNP-BSA標(biāo)記的膠體金)，也會隨樣本在硝基纖維素膜上層析，當(dāng)層析至硝基纖維素膜的控制線時(shí)，DNP-BSA膠體金會與預(yù)先包被在硝基纖維素膜上的抗DNP抗體發(fā)生反應(yīng)從而被固定在對照區(qū)(控制線)上。由于膠體金為紅色，因而固定在硝基纖維素膜控制線上的抗DNP中的DNP-BSA膠體金免疫復(fù)合物將顯示紅色。當(dāng)樣本中不含GAL-3時(shí)，則只顯示兩條控制線。當(dāng)樣本含GAL-3時(shí)，檢測線就會清晰的顯示出來。
[0016]當(dāng)反應(yīng)結(jié)束后，利用多功能免疫檢測儀(瑞萊生物工程(深圳)有限公司)將控制線和檢測線的光密度進(jìn)行分析，并將所分析得到的結(jié)果進(jìn)行運(yùn)算，從而得到相對光密度值(RI)0然后檢測儀根據(jù)已預(yù)先設(shè)置在檢測儀內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線對GAL-3的濃度進(jìn)行計(jì)算并顯示結(jié)果，以ng/mL為單位表示。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是本實(shí)用新型所述快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙的一種優(yōu)選實(shí)施方式的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0018]其中，1:硝酸纖維素膜，2:偶合物墊片，3:樣本墊片，4:吸水墊，5:支撐墊片，6:單面膠，7:雙面膠，8:檢測線，9:控制線。[0019]圖2是本實(shí)用新型所述快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙盒的一種優(yōu)選實(shí)施方式的示圖。
[0020]其中，3:樣本墊片，8:檢測線，9:控制線，4:吸水墊，10:外殼。
[0021]實(shí)施方式
[0022]以下結(jié)合附圖對本實(shí)用新型所述快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙或試紙盒進(jìn)行詳細(xì)說明，不能理解為是對本實(shí)用新型的限制。以下實(shí)施例中所使用的材料和試劑除特別說明外，均為普通市售。
[0023]【實(shí)施例1】制備快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙
[0024]如圖1所示的膠體金試紙結(jié)構(gòu)，包括支撐墊片5，位于所述支撐墊片上的硝酸纖維素膜1，所述硝酸纖維素膜的一端上方層疊連接吸水墊4，另一端上方層疊連接偶合物墊片2，所述偶合物墊片遠(yuǎn)離硝酸纖維素膜I的一端上方層疊連接樣本墊片3，所述樣本墊片另一端部的下方粘接雙面膠7，上方粘接單面膠6，其特征在于，所述硝酸纖維素膜I中間部位檢測線8包被有Gal-3抗體，檢測線兩邊分別設(shè)有控制線9，所述偶合物墊片2上涂布有金標(biāo)記的Gal-3單克隆抗體或多克隆抗體以及控制線偶合物。[0025]所述控制線9包被有抗DNP抗體,所述控制線偶合物為DNP-BSA標(biāo)記的膠體金。
[0026]其中，硝酸纖維素膜I在膠體金試紙中用于固定包被抗體，同時(shí)也是免疫反應(yīng)的發(fā)生處；檢測線8是將Gal-3抗體使用1*PBS、甲醇等緩沖液稀釋到0.5mg/ml的濃度，取lul/cm劃線于所述硝酸纖維素膜I上，37°C過夜干燥及60°C烘烤3天，即得；控制線9是將抗DNP抗體使用1*PBS、甲醇等緩沖液稀釋到0.5mg/ml的濃度,取lul/cm劃線于所述硝酸纖維素膜I上，37°C過夜干燥及60°C烘烤3天，即得。
[0027]其中，所述偶合物墊片2的原材料為玻璃纖維濾膜，將用于制備偶合物墊片的玻璃纖維濾膜放入預(yù)封閉緩沖液(包含0.1-1%的酪蛋白，0.5-5%的牛血清白蛋白、
0.005-0.5%的硼酸、0.01-0.2%的PEG)中浸泡5分鐘后取出，37°C干燥后，用Biodot包膜儀器將金標(biāo)記的Gal-3單克隆抗體或多克隆抗體以及控制線偶合物涂布在偶合物墊片2上，涂布量是lul/mm，干燥，即得。優(yōu)選地，所述偶合物墊片2的預(yù)封閉緩沖液包含0.8%的酪蛋白，4%的牛血清白蛋白，0.007%的硼酸，0.1%的PEG。
[0028]其中，所述樣本墊片3可對液態(tài)樣品起到初步過濾作用。將樣本墊片用141封閉液(包含:0.1-1%的Tris,0.1-1%的Tween20,0.1-1%的酪蛋白，0.05-0.5%的鼠抗人紅細(xì)胞)浸泡5分鐘后，過夜37°C干燥，即得。優(yōu)選地，所述141封閉液包含:0.3%的Tris，0.8%的酪蛋白，0.3%的鼠抗人紅細(xì)胞。
[0029]將上述各組成部件按圖1所示結(jié)構(gòu)粘貼在支撐墊片5上，獲得快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙。
[0030]【實(shí)施例2】用本實(shí)用新型所述膠體金試紙快速定量檢測半乳糖凝集素-3。
[0031]取本實(shí)用新型優(yōu)選的一種快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙，如圖1所示，所述膠體金試紙包括支撐墊片5，位于所述支撐墊片上的硝酸纖維素膜1，所述硝酸纖維素膜的一端上方層疊連接吸水墊4，另一端上方層疊連接偶合物墊片2，所述偶合物墊片遠(yuǎn)離硝酸纖維素膜I的一端上方層疊連接樣本墊片3，所述樣本墊片另一端部的下方粘接雙面膠7，上方粘接單面膠6，其特征在于，所述硝酸纖維素膜I中間部位檢測線8包被有Gal-3抗體，檢測線兩邊分別設(shè)有控制線9，所述偶合物墊片2上涂布有金標(biāo)記的Gal_3單克隆抗體或多克隆抗體以及控制線偶合物。優(yōu)選地，所述控制線9包被有抗DNP抗體，所述控制線偶合物為DNP-BSA標(biāo)記的膠體金。按以下步驟進(jìn)行檢測:1)抽取的病人血清、血漿或全血等待檢樣本，如低溫保存樣本需恢復(fù)至室溫。2)將待測樣品加入樣本墊片3上，反應(yīng)。3)判讀，將所述膠體金試紙置于多功能免疫檢測儀，SSJ-2或MINI (瑞萊生物工程(深圳)有限公司)中判定結(jié)果。
[0032]【實(shí)施例3】用本實(shí)用新型所述膠體金試紙盒快速定量檢測半乳糖凝集素-3。
[0033]取本實(shí)用新型優(yōu)選的一種快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙盒，如圖1和圖2所示，所述膠體金試紙包括支撐墊片5，位于所述支撐墊片上的硝酸纖維素膜1，所述硝酸纖維素膜的一端連接吸水墊4，另一端連接偶合物墊片2，所述偶合物墊片連接樣本墊片3，所述樣本墊片另一端部的下方粘接雙面膠7，上方粘接單面膠6，其特征在于，所述硝酸纖維素膜1中間部位檢測線8包被有Gal-3抗體，檢測線兩邊分別設(shè)有控制線9，所述偶合物墊片2上涂布有金標(biāo)記的Gal-3單克隆抗體或多克隆抗體以及控制線偶合物。優(yōu)選地，所述控制線9包被有抗DNP抗體,所述控制線偶合物為DNP-BSA標(biāo)記的膠體金。所述膠體金試紙還包括一外殼10，所述外殼包裹所述試紙，露出樣本墊片3、硝酸纖維素膜I上的檢測線8和兩條控制線9、以及吸水墊4。按以下步驟進(jìn)行檢測:1)抽取的病人血清、血漿或全血等待檢樣本，如低溫保存樣本需恢復(fù)至室溫。2)將待測樣品加入樣本墊片3上，反應(yīng)。3)判讀，將所述膠體金試紙置于多功能免疫檢測儀，SSJ-2或MINI (瑞萊生物工程(深圳)有限公司)中判定結(jié)果。
【權(quán)利要求】
1.一種快速定量檢測半乳糖凝集素-3的膠體金試紙，包括支撐墊片(5)，位于所述支撐墊片上的硝酸纖維素膜(1)，所述硝酸纖維素膜的一端連接吸水墊(4)，另一端連接偶合物墊片(2)，所述偶合物墊片連接樣本墊片(3)，所述樣本墊片另一端部的下方設(shè)有第一固定部件(7)，上方設(shè)有第二固定部件(6)，其特征在于，所述硝酸纖維素膜(I)中間部位檢測線(8)包被有Gal-3抗體，檢測線兩邊分別設(shè)有控制線(9)，所述偶合物墊片(2)上涂布有金標(biāo)記的Gal-3單克隆抗體或多克隆抗體以及控制線偶合物。
2.如權(quán)利要求1所述的膠體金試紙，其特征在于，所述控制線(9)包被有抗DNP抗體，所述控制線偶合物為DNP-BSA標(biāo)記的膠體金。
3.如權(quán)利要求1所述的膠體金試紙，其特征在于，所述第一固定部件(7)為雙面膠，第二固定部件(6)為單面膠。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的膠體金試紙，其特征在于，所述膠體金試紙外還包括一外殼(10),所述外殼包裹所述膠體金試紙外,露出樣本墊片(3)、硝酸纖維素膜(I)上的檢測線(8)和兩條控制線(9)、以及吸水墊(4)。
5.如權(quán)利要求4所述的膠體金試紙，其特征在于，所述兩條控制線(9)與檢測線(8)為平行設(shè)置。
【文檔編號】G01N33/68GK203732547SQ201420100767
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月6日
【發(fā)明者】劉紅劍, 趙俊平, 吳偉云, 夏宣喜 申請人:瑞萊生物工程（深圳）有限公司