一種鑒別鹿茸血片的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了鹿神經因子作為鑒別鹿茸血片指標的應用。本發(fā)明還公開了一種鑒別鹿茸血片的試劑盒：首先制備了鹿神經因子的兔源多抗作為捕獲抗體，并包被好酶標板；進一步制備鹿神經因子的單抗作為檢測抗體；配好相應的酶標記二抗和底物，制作成試劑盒備用，本發(fā)明所述的鑒別鹿茸血片的試劑盒，是ELISA試劑盒，包括包被了鹿神經因子多抗的酶標板、檢測用抗體、標記二抗、顯色底物、終止劑、樣品溶解液、洗滌液、標準品；其中，酶標板材料、標記二抗、顯色底物、終止劑、洗滌液均為商業(yè)化標準產品，鹿神經因子多抗、檢測抗體(鼠抗鹿神經因子單抗)、標準品(鹿神經因子)為本發(fā)明所專門制備。
【專利說明】一種鑒別鹿茸血片的試劑盒

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術領域】，具體涉及一種鑒別鹿茸血片的試劑盒。

【背景技術】
[0002]當前，由于鹿茸制品價格較高，尤其以血茸片質量最好價格最高，鹿茸制品市場上出現(xiàn)了大量的假冒偽劣產品，各類假冒偽劣產品甚至占據(jù)90%以上的鹿茸飲片市場。當前主要采用眼觀、顯微鏡檢查以及基于PCR技術的遺傳鑒定方法來檢測各類假冒偽劣產品，對于非鹿源的產品、含假鹿血的鹿茸飲片較容易鑒別出來，但對于假茸基質真鹿血的仿品較難區(qū)別。另外，仿品中也有一些是采用真實的無血鹿茸基質涂布鹿血制成，雖然與血茸片無法區(qū)別，但其活性成分與真實的血茸存在較大差別。當前的鑒別手段無法區(qū)分此類血茸片偽片。
[0003]每年鹿茸的再生，除骨組織外，一些支持組織如神經也會再生。神經的生長速度約I cm/d O目前控制鹿茸神經迅速生長的機制尚不清楚。但Garcia等用半定量的RT-PCR檢測了在鹿鸞頂部不同組織中NT-3 (neurotrophin-3)mRNA的相對表達，發(fā)現(xiàn)在鹿鸞頂部的表皮層的表達最高，而在軟骨層最低，這一結果正好與這些組織的神經分布情況一致?；粲駮葟膬龈苫谷字刑崛?、分離得到分子量在10000以上的蛋白質多肽類組分，經應用細胞調控因子活性測定方法，發(fā)現(xiàn)該組分具有神經生長因子樣作用。當前科學研宄基本證實了神經生長因子分布的時空特性，表明了鹿茸中專有較高水平的鹿神經生長因子，并且具有與鹿茸品質呈正比的趨勢。當前尚無任何利用這一指標來進行鹿茸產品質量鑒定的報道。


【發(fā)明內容】

[0004]在已有的檢測手段中，基本上依據(jù)形態(tài)、色質、氣味以及遺傳特性來進行鑒別，可以檢測出大部分類型的假冒偽劣產品，但對于鹿源的組合型制假方式卻無法鑒別，尤其是以真實的無血鹿茸基質涂布鹿血制成的血茸片，從外觀到遺傳特性均為真實的，但與真正的血茸片相比，其活性成分含量很低，達不到顧客期望的使用效果。目前還未有有效的檢測手段來鑒別此類假冒產品。本發(fā)明選擇血茸片的一個核心活性因子一一鹿神經因子作為檢測指標，并以此制作了鑒定試劑盒作為對真假血茸片的一個有效的檢測手段，初步的試檢實驗中，假冒產品檢出率達100%。
[0005]為解決血茸片的鑒別問題，本發(fā)明選擇了血茸片的一個核心活性因子:鹿神經因子作為檢測指標，并以此制作試劑盒作為對真假血茸片的一個有效的檢測手段。
[0006]本發(fā)明公開了鹿神經因子作為鑒別鹿茸血片指標的應用。
[0007]本發(fā)明還公開了一種鑒別鹿茸血片的試劑盒:首先制備了鹿神經因子的兔源多抗作為捕獲抗體，并包被好酶標板；進一步制備鹿神經因子的單抗作為檢測抗體；配好相應的酶標記二抗和底物，制作成試劑盒備用。
[0008]本發(fā)明所述的鑒別鹿茸血片的試劑盒，是ELISA試劑盒，包括包被了鹿神經因子多抗的酶標板、檢測用抗體、標記二抗、顯色底物、終止劑、樣品溶解液、洗滌液、標準品；其中，酶標板材料、標記二抗、顯色底物、終止劑、洗滌液均為商業(yè)化標準產品，鹿神經因子多抗、檢測抗體(鼠抗鹿神經因子單抗)、標準品(鹿神經因子)為本發(fā)明所專門制備。
[0009]本發(fā)明的試劑盒從技術上解決了【背景技術】無法解決遺傳背景相似的假冒品的鑒定問題，通過選取針對血茸特異性很強的鹿神經因子作為檢測指標項，并采用當前主流的高靈敏度的免疫診斷試劑盒方式進行檢測，檢測效率也大大提高，同一批次可同時檢測80多個樣品，且耗時較少，完成每批次檢測只需4-5個小時。
[0010]初步的試檢實驗中，假冒產品檢出率達100%。

【具體實施方式】
[0011]本發(fā)明選擇了一個血茸片特異的核心活性因子:鹿神經因子作為檢測指標，通過制作常規(guī)ELISA試劑盒，包含包被了鹿神經因子多抗的酶標板、檢測用抗體、標記二抗、顯色底物、終止劑、洗滌液、標準品等，取得了鑒別血茸片真?zhèn)蔚挠行z測手段。
[0012]本發(fā)明首先分離純化得到鹿神經因子抗原:用1% HAc溶液1:5稀釋新鮮鹿茸血—2，000rpm/min低溫離心一上清液用Sephadex G-50柱粗分離一活性峰收集液以pH6.0磷酸鹽緩沖液透析一CM-Sepharose FF柱再純化一Sephacryl S-200柱層析分離純化獲得抗原。一部分純化后的鹿神經因子經稀釋制成標準品。接著，進一步制備了鹿神經因子的兔源多抗:動物免疫(新西蘭大白兔)一Elisa效價檢測(或WB檢測抗原)一抗血清一重組蛋白A柱分離純化；同期制備鹿神經因子的鼠源單抗:鹿神經因子抗原致敏B淋巴細胞(免疫動物)一雜交細胞瘤制備、篩選一雜交瘤細胞分泌抗體的確認一分泌抗體的雜交瘤細胞克隆一單克隆抗體的批量生產。最后，按常規(guī)ELISA試劑盒的搭配組配本發(fā)明的試劑盒。
[0013]具體實施本發(fā)明的試劑盒的實施例:
[0014]1.自制5個血鸞片樣品、5個分別以鹿血、牛血、豬血、羊血、雞血涂布次等鹿鸞片(無血鹿茸片)樣品以及收集20個市售樣品，經低溫研磨，分別加樣品溶解液(PBST)5mL/g, 37°C孵育2小時，離心取上清；
[0015]2.加待檢樣品的浸提液0.1ml于包被酶標板的反應孔中，置37°C孵育I小時。然后洗滌，同時設置空白孔、陰性對照孔及陽性對照孔。
[0016]3.于各反應孔中，加入檢測抗體后37°C孵育0.5?I小時，洗滌，再加入酶標二抗
0.1mlo 37°C孵育0.5?I小時，洗滌。接著加入顯色底物溶液0.1ml, 37°C 10?30分鐘；最后于各反應孔中加入終止液0.05ml。
[0017]6.結果判定:于白色背景上，直接用肉眼觀察結果:比照空白和陰性對照孔的顏色，顏色越深的反應孔，陽性程度越強，顏色比空白和陰性對照孔淺的則判定為陰性，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“ + 號表示。進一步采用酶標儀測定，以空白或陰性對照孔調零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即判為陽性。本次檢測的30個樣品中，自制的10個樣品檢測結果完全符合樣品的真實情況，5個自制的假冒樣品全被檢測為陰性；所收集20個市售樣品中，6個為陽性，其余為陰性，陽性率為30%。
【權利要求】
1.鹿神經因子作為鑒別鹿茸血片指標的應用。
2.一種鑒別鹿茸血片的試劑盒，其特征在于:是ELISA試劑盒，包括包被了鹿神經因子多抗的酶標板、檢測用抗體、標記二抗、顯色底物、終止劑、樣品溶解液、洗滌液、鹿神經因子標準品。
【文檔編號】G01N33/577GK104483486SQ201410804555
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月22日 優(yōu)先權日:2014年12月22日
【發(fā)明者】冀德君, 樊永亮, 楊章平, 王小龍, 魏定國, 黃必忠 申請人:揚州大學