一種基于單顆粒AuAg核殼結構的檢測刀豆蛋白的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基于單顆粒AuAg核殼結構的檢測刀豆蛋白的方法，將Au、Ag、Cu等金屬納米顆粒和蛋白質檢測結合，利用Au、Ag、Cu等金屬納米顆粒的良好的生物相容性、大比表面積和高靈敏性，經(jīng)過可以和刀豆蛋白特異性識別的甘露糖衍生物對納米顆粒的生物相容性修飾，經(jīng)過修飾的Au、Ag、Cd等金屬及半導體納米Au、Ag、Cu等金屬納米顆粒就成為了一個可以檢測微量刀豆蛋白（ConA）的特異性生物探針，表面裸露甘露糖基就可以對溶液中存在的微量刀豆蛋白（ConA）進行特異性檢測；甘露糖和刀豆蛋白的特異性識別、結合的整個過程可以通過暗場顯微鏡（DFM）下單顆粒Au、Ag、Cu等金屬及半導體納米顆粒的SPR光譜的變化表征出來。此方法具有速度快，靈敏度高，檢測范圍大，可實時檢測等優(yōu)點。
【專利說明】—種基于單顆粒Au@Ag核殼結構的檢測刀豆蛋白的方法
[0001]

【技術領域】
[0002]本發(fā)明具體涉及一種溶液中微量刀豆蛋白的檢測方法，屬于納米材料生物應用領域。
[0003]

【背景技術】
金和銀等貴金屬納米晶在入射光照射下，界面的導帶電子和光子發(fā)生共振形成等離子體共振激元，大量等離子體激元的共振形成共振電磁場的現(xiàn)象被稱為LSPR現(xiàn)象；當Au或Ag納米顆粒表面的環(huán)境介質發(fā)生變化，會引起界面的折射率的變化，這種變化會改變Au或Ag納米顆粒對入射光共振頻率選擇；基于本身的這種特殊的LSPR光譜性質,Au、Ag納米顆粒受到了相當多的關注，國內(nèi)外多個研究課題組已經(jīng)可以用多種方法制備出納米球，納米棒，納米圈，納米立方體等擁有不同SPR性質的Au、Ag納米粒子，并將它們廣泛的應用于和光電子、催化、信息存儲、化學生物傳感和表面增強拉曼散射等相關的化學、生物、物理、醫(yī)藥和治療學等多個領域內(nèi)。由于AiuAg納米粒子自身良好的大比表面積、光譜性質、良好的生物相容性和受介質影響易發(fā)生改變的高靈敏性，已經(jīng)被用來作為發(fā)展超靈敏度傳感器和成像等方面的主要基礎材料。Au或Ag納米顆粒和生物分子的連接用于進行生物檢測更是近十年來研究的熱點；用願八包覆的Au Nanorods吸附了 streptavidin生物素之后LSPR吸收峰的位置發(fā)生變化實現(xiàn)了對這種特異性吸附的識別；用表面包裹抗體的Au納米棒特異性連接抗原使Au納米棒表面的折射率改變而引起LSPR吸收峰的移動，實現(xiàn)了對抗體-抗原體系的選擇性吸附的觀測；用S-mRNA包裹的Au納米顆粒特異性連接DNA可以在DFM(暗場顯微鏡)下觀測到Au納米顆粒的LSPR的移動，實現(xiàn)對細胞內(nèi)遺傳信息表達的監(jiān)測；等等。Au, Ag納米顆粒應用于SPR傳感器的優(yōu)勢已經(jīng)得到了廣泛的認可。
[0004]糖蛋白(glycoprotein)是由寡糖和多肽鏈共價修飾連接而形成的一類重要生理活性物質，它廣泛存在于細胞I旲、細胞間質、血衆(zhòng)以及粘液中。糖蛋白中的糖鏈在維持蛋白質穩(wěn)定、抵抗蛋白酶水解、防止抗體識別及參與肽鏈在內(nèi)質網(wǎng)的折疊啟動等方面發(fā)揮著重要作用，具有開關和調諧功能、激素功能、胞內(nèi)轉運功能、保護和促進物質吸收、參與血液凝固與細胞識別等，對于增殖的調控、受精、發(fā)生、分化以及免疫等生命現(xiàn)象，起著十分重要的作用。將Au、Ag納米顆粒應用于生物體內(nèi)糖蛋白的檢測，對于研究人體的多種新陳代謝和生理機能的過程都有著十分積極的意義。
[0005]由于具有免標記性質和定量測定能力，基于貴金屬納米顆粒的表面等離子體共振傳感方法對于檢測蛋白質樣品是很有效果的。大部分檢測方法都面臨著干擾精確度和測定過程中收集到的光學信號確定的定量結果這樣的挑戰(zhàn)。作為對比，表面等離子體共振傳感方法可以實現(xiàn)定量和更加經(jīng)得起檢驗來直接得到可以解釋的數(shù)據(jù)結果。表面等離子體共振傳感方法的測定過程的實現(xiàn)不需要依靠任何的標記，并且可以直接從貴金屬納米顆粒的表面等離子體共振光譜表征出來。再結合他們在小型化，可芯片化操作等優(yōu)勢，表面等離子體共振傳感方法方法可以成為熒光標記，放射性標記等觀測方法的更合適的替代品。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]將AuOAg核殼納米立方體修飾在ITO基底上，在其表面修飾上2，2 ^ - 二硫二乙醇甘露糖衍生物，此時AuOAg NC表面裸露的甘露糖端基可以用來和刀豆蛋白結合；Au@Ag-mannose就可以作為檢測溶液中微量刀豆蛋白的生物探針。
[0007]本發(fā)明技術方案如下:
1、用種子生長法合成30nm的Au納米顆粒，采用如下方法制備得到:
步驟1.種子合成
在反應瓶中加入100 mM CTAB (aq)和10 mM HAuC14 (aq)，在磁力攪拌器上中速攪拌使其混合均勻，將冰浴過的現(xiàn)配10 mM的NaBH4 (aq)—次性迅速加入到CTAB和HAuC14的混合溶液中，溶液瞬間由黃色變成棕色；將得到的種子溶液在28°C水浴中保溫3 h。
[0008]步驟2.大粒徑金球的合成
在反應瓶中加入200 mM CTAC (aq)和0.01 M的HAuC14 (aq)混合之后用磁力攪拌使溶液均勻；100 mM的新配制的抗壞血酸溶液迅速加入到混合溶液，之后黃綠色的溶液瞬間變成無色透明溶液；攪拌均勻后一次性快速加入步驟I的棕色金種子溶液，整個溶液慢慢變?yōu)榱良t色透明膠體；在36 °C水浴中保溫I h后大粒徑的金納米顆粒。
[0009]2.合成生物相容性好、形貌可控的AuOAg核殼納米立方體，其采用如下方法制備得到:
在反應瓶中加入步驟2得到的金納米顆粒的溶液和0.2 M CTAC溶液，混合均勻后加入抗壞血酸溶液，然后將反應瓶中在60°C恒溫水浴中保溫，10 mM的硝酸銀溶液以0.5 mL/20min速度在加液泵輔助下滴加到恒溫60 1:反應瓶中，在水浴中恒溫靜置4 h之后離心處理。得到生物相容性好,形貌、粒徑可控的AuOAg核殼納米立方體。
[0010]3.實現(xiàn)對AuOAg核殼納米立方體的修飾和改性，采用如下方法實現(xiàn):
AuiAg核殼納米立方體溶液浸泡ITO玻璃將AuOAg核殼納米立方體固定在ITO基底上；然后將ITO玻璃浸沒于表面修飾劑溶液中進行對AuOAg核殼納米立方體的修飾；一定時間后用超純水沖洗掉表面多余的表面修飾劑。此次使用的表面修飾劑是2，2' - 二硫二乙醇甘露糖衍生物。
[0011]4.對刀豆蛋白的檢測；其特征在于采用如下方法實現(xiàn):
經(jīng)過修飾的AuOAg核殼納米立方體的ITO基底固定在暗場顯微鏡下，在基底上滴加刀豆蛋白的溶液，調整顯微鏡，觀察甘露糖和刀豆蛋白的結合過程弓I發(fā)AuOAg核殼納米立方體的LSPR性質發(fā)生改變，共振峰發(fā)生移動，這種變化可以在DFM (暗場顯微鏡)和光譜儀下表征出來。
[0012]5.以上步驟3、4中使用的AuOAg核殼納米立方體粒徑從30-80 nm不等,都是通過2合成得到的。
[0013]6.以上步驟3中的甘露糖衍生物溶液的濃度從ΙΟ,-ΚΓ2 M。
[0014]7.以上步驟4中的2，2' -二硫二乙醇甘露糖衍生物和刀豆蛋白的結合過程是通過暗場顯微鏡(DFM)幫助下采集AuOAg NC的是SPR光譜實時變化表征出來的；觀測的時間長度從I min到4 h不等；光譜移動量從I nm到100 nm。
[0015]有益效果本發(fā)明將AuOAg核殼結構的納米顆粒和蛋白質檢測結合，AuOAg納米顆粒具有良好的生物相容性、大比表面積和高靈敏性，經(jīng)過修飾的AuOAg納米顆粒就成為了一個可以檢測微量刀豆蛋白(ConA)的特異性生物探針；此探針對刀豆蛋白的特異性識別、結合的整個過程可以通過暗場顯微鏡(DFM)下單顆粒AuOAg核殼結構的SPR光譜的變化表征出來。此探針具有速度快，靈敏度高，檢測范圍大，可實時檢測等優(yōu)點。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是本發(fā)明在固定在ITO表面的單顆粒55 nm AuiAg NC表面修飾2,2' -二硫二乙醇甘露糖衍生物時，AuiAg NC的SPR光譜變化圖。
[0017]圖2是本發(fā)明中55 nm AuiAg NC -2, -二硫二乙醇甘露糖衍生物和1(T8 M刀豆蛋白的結合過程是通過暗場顯微鏡(DFM)幫助下采集AuOAg NC的是SPR光譜實時變化圖。

【具體實施方式】
[0018]以下結合具體實施例進一步詳細說明本發(fā)明。
[0019]實施例1
獲得性能優(yōu)異的SPR生物光學探針，實現(xiàn)對微量Con A的高靈敏檢測，并應用于實際樣品的分析測定；
步驟1:實現(xiàn)對AuOAg核殼納米立方體的修飾和改性；
AuiAg核殼納米立方體溶液浸泡ITO玻璃將AuOAg核殼納米立方體固定在ITO基底上；然后將ITO玻璃浸沒于表面修飾劑溶液中進行對AuOAg核殼納米立方體的修飾；一定時間后用超純水沖洗掉表面多余的表面修飾劑。此次使用的表面修飾劑是2，2' - 二硫二乙醇甘露糖衍生物。
[0020]對刀豆蛋白的檢測；經(jīng)過修飾的AuOAg核殼納米立方體的ITO基底固定在暗場顯微鏡下，在基底上滴加刀豆蛋白的溶液，調整顯微鏡，觀察甘露糖和刀豆蛋白的結合過程引發(fā)AuOAg核殼納米立方體的LSPR性質發(fā)生改變，共振峰發(fā)生移動，這種變化可以在DFM(暗場顯微鏡)和光譜儀下表征出來。
[0021]步驟2:步驟I中使用的AuOAg核殼納米立方體粒徑從55 nm左右。
[0022]步驟3:步驟I中甘露糖衍生物溶液的濃度從10_2 M，修飾時間是0.5 h。如附圖2中方形點線。
[0023]步驟4:步驟I中2，2' - 二硫二乙醇甘露糖衍生物和刀豆蛋白的結合過程是通過暗場顯微鏡(DFM)幫助下采集AuOAg NC的是SPR光譜實時變化表征出來的。觀測的時間長度為I h。
[0024]實施例2
獲得性能優(yōu)異的SPR生物光學探針，實現(xiàn)對微量Con A的高靈敏檢測，并應用于實際樣品的分析測定；
步驟1:實現(xiàn)對AuOAg核殼納米立方體的修飾和改性；
AuiAg核殼納米立方體溶液浸泡ITO玻璃將AuOAg核殼納米立方體固定在ITO基底上；然后將ITO玻璃浸沒于表面修飾劑溶液中進行對AuOAg核殼納米立方體的修飾；一定時間后用超純水沖洗掉表面多余的表面修飾劑。此次使用的表面修飾劑是2，2' - 二硫二乙醇甘露糖衍生物。
[0025]對刀豆蛋白的檢測；經(jīng)過修飾的AuOAg核殼納米立方體的ITO基底固定在暗場顯微鏡下，在基底上滴加刀豆蛋白的溶液，調整顯微鏡，觀察甘露糖和刀豆蛋白的結合過程引發(fā)AuOAg核殼納米立方體的LSPR性質發(fā)生改變，共振峰發(fā)生移動，這種變化可以在DFM(暗場顯微鏡)和光譜儀下表征出來。
[0026]步驟2:步驟I中使用的AuOAg核殼納米立方體粒徑從55 nm左右。
[0027]步驟3:步驟I中甘露糖衍生物溶液的濃度從1(Γ2 Μ，修飾時間是I h。如附圖2中圓點線。
[0028]步驟4:步驟I中2，2' - 二硫二乙醇甘露糖衍生物和刀豆蛋白的結合過程是通過暗場顯微鏡(DFM)幫助下采集AuOAg NC的是SPR光譜實時變化表征出來的。觀測的時間長度為I h。
[0029]實施例3
獲得性能優(yōu)異的SPR生物光學探針，實現(xiàn)對微量Con A的高靈敏檢測，并應用于實際樣品的分析測定；
步驟1:實現(xiàn)對AuOAg核殼納米立方體的修飾和改性；
AuiAg核殼納米立方體溶液浸泡ITO玻璃將AuOAg核殼納米立方體固定在ITO基底上；然后將ITO玻璃浸沒于表面修飾劑溶液中進行對AuOAg核殼納米立方體的修飾；一定時間后用超純水沖洗掉表面多余的表面修飾劑。此次使用的表面修飾劑是2，2' - 二硫二乙醇甘露糖衍生物。
[0030]對刀豆蛋白的檢測；經(jīng)過修飾的AuOAg核殼納米立方體的ITO基底固定在暗場顯微鏡下，在基底上滴加刀豆蛋白的溶液，調整顯微鏡，觀察甘露糖和刀豆蛋白的結合過程引發(fā)AuOAg核殼納米立方體的LSPR性質發(fā)生改變，共振峰發(fā)生移動，這種變化可以在DFM(暗場顯微鏡)和光譜儀下表征出來。
[0031]步驟2:步驟I中使用的AuOAg核殼納米立方體粒徑從55 nm左右；
步驟3:步驟I中甘露糖衍生物溶液的濃度從10_2 M，修飾時間是1.5 h。如附圖2中正三角線；
步驟4:步驟I中2，2' - 二硫二乙醇甘露糖衍生物和刀豆蛋白的結合過程是通過暗場顯微鏡(DFM)幫助下采集AuOAg NC的是SPR光譜實時變化表征出來的。觀測的時間長度為I h。
[0032]實施例4
獲得性能優(yōu)異的SPR生物光學探針，實現(xiàn)對微量Con A的高靈敏檢測，并應用于實際樣品的分析測定；
步驟1:實現(xiàn)對AuOAg核殼納米立方體的修飾和改性；
AuiAg核殼納米立方體溶液浸泡ITO玻璃將AuOAg核殼納米立方體固定在ITO基底上；然后將ITO玻璃浸沒于表面修飾劑溶液中進行對AuOAg核殼納米立方體的修飾；一定時間后用超純水沖洗掉表面多余的表面修飾劑。此次使用的表面修飾劑是2，2' - 二硫二乙醇甘露糖衍生物。
[0033]對刀豆蛋白的檢測；經(jīng)過修飾的AuOAg核殼納米立方體的ITO基底固定在暗場顯微鏡下，在基底上滴加刀豆蛋白的溶液，調整顯微鏡，觀察甘露糖和刀豆蛋白的結合過程引發(fā)AuOAg核殼納米立方體的LSPR性質發(fā)生改變，共振峰發(fā)生移動，這種變化可以在DFM(暗場顯微鏡)和光譜儀下表征出來。
[0034]步驟2:步驟I中使用的AuOAg核殼納米立方體粒徑從55 nm左右。
[0035]步驟3:步驟I中甘露糖衍生物溶液的濃度從10_2 M，修飾時間是2 h。如附圖2中倒三角線。
[0036]步驟4:步驟I中2，2' - 二硫二乙醇甘露糖衍生物和刀豆蛋白的結合過程是通過暗場顯微鏡(DFM)幫助下采集AuOAg NC的是SPR光譜實時變化表征出來的。觀測的時間長度為I h。
【權利要求】
1.一種基于單顆粒AufgAg核殼結構檢測刀豆蛋白的方法，其特征在于有以下步驟: 步驟1:合成一種用種子生長法合成30nm的Au納米顆粒； 先合成3nm的金種子溶液，然后開始不斷加入生長液直至粒徑達到目標要求，在TEM下表征得到Au納米顆粒的形貌信息,粒徑大小從5 nm-50 nm ； 步驟2:合成生物相容性好、形貌可控的AuOAg核殼納米立方體: 在Au膠溶液里不斷加入硝酸銀和抗壞血酸溶液為主的銀生長液，得到Ag單質不斷吸附在Au球表面，在表面活性劑的作用下形成粒徑可控的AuOAg核殼納米立方體，用Uv-vis、TEM等儀器進行表征測試；得到Au表面厚度從I nm到30 nm Ag不等的粒徑分布均勻的AuOAg核殼納米立方體； 步驟3 ^fAuOAg核殼納米立方體固定在ITO玻璃基基底上，通過浸泡實現(xiàn)對AuOAg核殼納米立方體的修飾和改性；使用的表面修飾劑是2,2' - 二硫二乙醇甘露糖衍生物；步驟4:用步驟3處理過的AuOAg核殼納米立方體，對在顯微鏡下對刀豆蛋白溶液進行檢測。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種基于單顆粒AuOAg核殼結構的檢測刀豆蛋白的方法，其特征在于，AuOAg核殼納米立方體粒徑從30-80 nm,通過步驟1、2、合成得到。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種基于單顆粒AuOAg核殼結構的檢測刀豆蛋白的方法，其特征在于，甘露糖衍生物溶液的濃度為:10_1(1-10_2 M0
4.根據(jù)權利要求1所述的一種基于單顆粒AuOAg核殼結構的檢測刀豆蛋白的方法，其特征在于，刀豆蛋白溶液的溶液的濃度為:10_1(ι-10_4 M。
5.根據(jù)權利要求1所述的一種基于單顆粒AuOAg核殼結構的檢測刀豆蛋白的方法，其特征在于，2，2' -二硫二乙醇甘露糖衍生物和刀豆蛋白的結合過程是通過暗場顯微鏡(DFM)幫助下采集AuOAg NC的是SPR光譜實時變化表征出來；觀測的時間長度從I min到.4 h ;光譜移動量從I nm到100 nm。
【文檔編號】G01N21/63GK104237174SQ201410349017
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年7月21日 優(yōu)先權日:2014年7月21日
【發(fā)明者】張磊, 范曲立, 王斌, 盧曉梅, 黃維 申請人:南京郵電大學