2,4,6-三羥基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷在三叉苦藥材質量檢測中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及2,4,6-三羥基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷(C20H28O14)的應用，屬于藥物分析【技術領域】。本發(fā)明涉及2,4,6-三羥基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷在三叉苦藥材質量檢測中的應用，是以三叉苦藥材中含有的專屬性成分2,4,6-三羥基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷作為指標成分，采用常規(guī)的薄層色譜法和常規(guī)的高效液相色譜法對三叉苦藥材進行鑒別和含量測定。建立三叉苦藥材中2,4,6-三羥基苯乙酮-3,5-二-C-beta-D-葡萄糖苷的薄層色譜鑒別方法和含量測定方法，應用于藥材質量檢測，能準確控制藥材的真?zhèn)魏蛢?yōu)劣，確保藥材的有效性和安全性，具有非常重要的意義。
【專利說明】2,4, 6-三羥基苯乙酮-3, 5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷在三
叉苦藥材質量檢測中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及2，4，6-三羥基苯乙酮_3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷(C2tlH28O14)的應用，屬于藥物分析【技術領域】。
【背景技術】
[0002]三叉苦為蕓香科吳茱萸屬植物三極苦Evodia lepta(Spreng.)Merr.的干燥枝葉(《中國藥典》1977年版一部，人民衛(wèi)生出版社，1978)或干燥全株(《廣西中藥材標準》1990版，廣西科學技術出版社，1992)或干燥莖及帶葉嫩枝(《湖南省中藥材標準》【2009年版】，湖南科學技術出版社，2010)。三叉苦又名三丫苦、小黃散、雞骨樹、三叉虎等，傣藥稱為“郎晚”。2008年英文版《中國植物志》第11卷(((Flora of China))Vol.11)則把三椏苦歸置于蜜茱萸屬，拉丁名為 Melicope pteleifolia (Champion ex Bentham) T.G.Hartley。三叉苦產(chǎn)于云南、廣東、廣西、海南、福建、臺灣、江西、浙江以及柬埔寨、老撾、越南、緬甸、泰國等地。
[0003]三叉苦為常綠灌木或小喬木或喬木，高(I~)2~6(~8)米，莖枝無刺，樹皮灰白或灰綠或青灰色,嫩枝及葉柄均無毛,嫩枝的節(jié)部常呈壓扁狀。葉對生,3小葉,偶有2小葉或單小葉同時存在，葉柄基部稍增粗，小葉長橢圓形，兩端尖，長5~20厘米，寬2~8厘米，無毛，全緣，油點多，有類似柑橘葉的香氣；小葉柄I~4毫米。傘房圓錐花序，腋生，花小，甚多，單性，雌雄異株；萼片及花瓣均4片；萼片細小，長約0.5毫米；花瓣淡黃色或白色，長I~2毫米，常有透明油點，干后油點變暗褐至褐黑色；雄花的退化雌蕊細墊狀凸起，密被白色短毛，雄蕊4~5，與花瓣互生；雌花的退化不育雄蕊4，有花藥而無花粉，花柱與子房等長或略短，柱頭頭狀。開裂的瞢莢果，分果瓣淡黃色或茶褐色，干時內卷與內果分離，散生肉也可見的透明油點，每分果瓣有I粒種子；種子卵珠形，長2~4(~5)毫米，厚2~3毫米，藍黑色，有光澤?；ㄆ?~6月，果期6~10月。
[0004]三叉苦始載于《嶺南采藥錄》，在《福建中草藥》、廣州部隊《常用中草藥手冊》、《廣西中草藥》中，以及《云南中草藥》、《云南思茅中藥選集》、《德宏民族藥志》、《西雙版納傣藥志》、《基諾族醫(yī)藥》等云南民族藥專著中均有記載。三叉苦是藥食兩用植物，已經(jīng)在三九胃泰、三九感冒靈、消結安膠囊等30多種中藥民族藥成方制劑中得到廣泛應用。三叉苦具有清熱解毒、消炎止痛、行氣止痛、燥濕止癢、祛風除濕等功效，主要用于感冒、咽喉腫痛、胃脘痛、風濕痹痛、皮膚瘙癢等疾病的治療。
[0005] 目前，已經(jīng)從三叉苦中分離鑒定了130種以上的化合物，其中，主要有生物堿、苯并吡喃、苯并二氫吡喃、黃酮、香豆素、苯乙酮等，三叉苦中的這些化合物雖然都具有鮮明的結構特征，如普遍存在異戊烯基結構等，但是，這些化合物基本都不是三叉苦的特征性成分，都不具有專屬性。三叉苦藥材質量標準，包括《中國藥典》1977版一部和廣東、廣西、湖南等地方藥材標準，除《廣西中藥材標準》(1996年第二冊)收載有與對照藥材比較的TLC鑒別外，其余均只有性狀鑒別或性狀和顯微鑒別，無專屬性強、能有效控制藥材真?zhèn)?、?yōu)劣的質量控制指標和方法。目前也未見三叉苦特征性、專屬性成分的研究報道。而藥材質量 檢測對確保成方制劑產(chǎn)品安全、有效、質量穩(wěn)定如一，具有重要的實際意義。

【發(fā)明內容】

[0006]本發(fā)明的目的是為了準確檢測三叉苦藥材的質量，提供一種2，4，6-三羥基苯乙酮-3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷在三叉苦藥材質量檢測中的新應用。
[0007]本發(fā)明涉及2，4，6-三羥基苯乙酮-3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷在三叉苦藥材質量檢測中的應用，是以三叉苦藥材中含有的專屬性成分2，4，6-三羥基苯乙酮-3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷作為指標成分，采用常規(guī)的薄層色譜法和常規(guī)的高效液相色譜法對三叉苦藥材進行鑒別和含量測定。
[0008]本發(fā)明應用2，4，6-三羥基苯乙酮_3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷進行三叉苦藥材的鑒別和含量測定的步驟如下:
[0009]—、用常規(guī)方法制備得到2，4, 6- 二輕基苯乙麗-3，5- 二 -C-beta-D-匍萄糖昔；
[0010]二、2，4，6-三羥基苯乙酮_3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷對照品溶液的制備
[0011]稱取2，4, 6- 二輕基苯乙麗-3，5- 二 -C_beta_D-匍萄糖昔對照品，精密稱定，加溶劑溶解并稀釋制成每Iml含0.001?Img的溶液，濾過，取續(xù)濾液作為對照品溶液，溶劑是甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、水或這些溶劑任意比例的混合溶液；
[0012]三、供試品溶液的制備
[0013]取三叉苦莖或葉，粉碎，混勻，取粉末供試品精密稱定，供試品含2，4，6-三羥基苯乙酮_3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷0.01?IOmg ;在上述供試品中加入5?IOOml溶劑，所述的溶劑是甲醇、乙醇、正丁醇、乙腈、丙酮、水或這些溶劑任意比例的混合溶液，超聲處理5?60分鐘,或加熱回流5?60分鐘,放冷,濾過,濾液按照以下方法中的一種處理,制成供試品溶液:
[0014](I)取濾液，加相應溶劑稀釋制成每Iml含2，4，6-三羥基苯乙酮-3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷0.001?Img的溶液，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液；
[0015](2)取濾液，蒸干，殘渣加水2?30ml使溶解，用乙酸乙酯萃取2?5次，每次2?30ml，分取水層液，蒸干，殘渣加溶劑I?IOml使溶解，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，溶劑是甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、水或這些溶劑任意比例的混合溶液；
[0016](3)取濾液，蒸干，殘渣加水2?30ml使溶解，加在DlOl大孔吸附樹脂柱上，樹脂柱內徑I?2.5cm，樹脂床高2?15cm，用水10?IOOml洗脫，棄去洗脫液，再用體積百分比為5?50%的甲醇或5?50%的乙醇20?200ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加溶劑I?IOml使溶解，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，溶劑是甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、水或這些溶劑任意比例的混合溶液；
[0017](4)取濾液，蒸干，殘渣加水2?5ml使溶解，加入等體積的2?4mol/LHCl溶液，90°C水浴中保溫15?150分鐘，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，或加入I倍體積以上的相應溶劑稀釋后濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，溶劑是甲醇、乙醇、乙腈或丙酮；
[0018]四、薄層色譜鑒別
[0019]照薄層色譜法(《中國藥典》一部附錄VI B)試驗，吸取上述供試品溶液I?10μ I和對照品溶液I?10 μ I,分別點于同一娃膠G薄層板上,用氯仿-甲醇-甲酸-水5?9:1?5:0.2?1:0.2?1、或甲醇-水10:0.2?2、或正丁醇-乙酸-甲酸-水10:0?5:0?5:0.1?0.5的上清液作為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5?20%硫酸乙醇溶液、或I?10%三氯化鐵乙醇溶液、或2?10%香草醛5?20%硫酸乙醇溶液、或0.5?2%三氯化鋁乙醇溶液作為顯色劑，室溫或加熱顯色，365nm紫外光燈下或日光下檢視；
[0020]五、高效液相色譜含量測定
[0021]色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-酸水溶液或乙腈-水溶液5?15:95?85、甲醇-酸水溶液或甲醇-水溶液5?30:95?70為流動相，酸水是體積百分比為0.05?5%的甲酸溶液、乙酸溶液、磷酸溶液、三氟乙酸溶液中的任意一種，檢測波長為230±3nm或285±3nm ;理論塔板數(shù)按2，4, 6-三輕基苯乙酮-3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷峰計算不低于3000 ；
[0022]測定方法照高效液相色譜法(《中國藥典》一部附錄VID)測定，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各I?20 μ 1，分別注入液相色譜儀，測定，即得。
[0023]所述的常規(guī)方法制備2，4，6-三羥基苯乙酮-3，5_ 二 -C-beta-D-葡萄糖苷(C20H28O14)，可以是以下方法:
[0024]取三叉苦的干燥葉，粉碎成粗粉，用體積百分比為O?100%的甲醇或乙醇或正丁醇回流提取，提取液減壓濃縮得浸膏，浸膏加水溶解，用正己烷萃取，水層除去溶劑后通過DlOl大孔吸附樹脂柱，水洗滌，5?60%乙醇洗脫，洗脫液減壓干燥，干燥物加甲醇溶解，拌膏，上硅膠柱分離，乙酸乙酯-甲醇混合溶液洗脫，收集目標流分，減壓干燥，干燥物加水溶解，反復通過ODS柱純化，5?30%甲醇洗脫，收集目標流分，冷凍干燥，即得2，4，6-三羥基苯乙酮_3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷純品，經(jīng)MS、13C-NMR等確定結構，HPLC檢查面積歸一法計算純度為98.59%。2，4，6-三羥基苯乙酮_3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷溶于水、甲醇、乙醇等溶劑。
[0025]2, 4, 6- 二輕基苯乙酮-3，5_ 二 -C-beta-D-匍萄糖苷(C2tlH28O14)是二叉苦藥材的主要專屬性成分，在我們檢測的來自云南、廣東、廣西等不同產(chǎn)地、不同季節(jié)的26份三叉苦藥材樣品中，均含有一定量的2，4，6-三羥基苯乙酮_3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷，而在我們同時檢測的同為蕓香科吳茱萸屬的吳茱萸Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.的葉、果實，以及同為蕓香科的飛龍掌血屬的飛龍掌血Toddalia asiatica(L.)Lam.、柑橘屬的佛手Citrus medica L.(栽培種)和香橡C.medica L.(栽培種)和甜澄C.sinensis (L.)Osb.(栽培種)、花椒屬的云南花椒Zanthoxylum khasianum Hook.(栽培種)、金橘屬的金柑Fortunella japonica(Thunb.) Swingle (栽培種)等植物的葉，均不含有2, 4, 6-三輕基苯乙酮_3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷。因此，建立三叉苦藥材中2，4，6-三羥基苯乙酮-3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷的薄層色譜鑒別方法和含量測定方法，應用于藥材質量檢測，能準確控制藥材的真?zhèn)魏蛢?yōu)劣，確保藥材的有效性和安全性，具有非常重要的意義。
[0026]本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)2，4，6-三羥基苯乙酮_3，5_ 二 -C-beta-D-葡萄糖苷為三叉苦的專屬性成分，將2，4，6-三羥基苯乙酮_3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷(C2tlH28O14)作為指示性成分，采用常規(guī)的薄層色譜法和常規(guī)的高效液相色譜法對三叉苦藥材進行鑒別和含量測定，專屬性好，操作簡便，可準確檢測藥材的真?zhèn)魏唾|量，具有實際意義。
[0027]三叉苦中2，4，6-三羥基苯乙酮_3，5_ 二 -C-beta-D-葡萄糖苷(C2tlH28O14)的薄層色譜鑒別和高效液相色譜含量測定的方法學研究:
[0028]1、儀器與材料[0029]研究用藥材樣品共26個，其中18個于不同季節(jié)采自云南、廣東、廣西的不同地區(qū)，均經(jīng)鑒定為蕓香科植物三叉苦Evodia Iepta(Spreng) Merr., 8個購買自安徽亳州中藥材市場等中藥材市場，經(jīng)鑒定均為三叉苦Evodia lepta (Spreng)Merr.。
[0030]薄層板:海洋牌100 X IOOmm或50 X IOOmm預制娃膠薄層板,厚度0.20?0.25mm,
青島海洋化工廠分廠。
[0031]薄層色譜:手動點樣用注射器，雙槽展開缸(L220XW60XH60，L110XW60XH60)，WFH-201B暗箱試紫外透射反射儀(上海精科實業(yè)有限公司)，Canon SX120IS數(shù)碼相機拍攝
成像記錄。
[0032]高效液相色譜:Agilentll00和 Waters H-CLASS UPLC 高效液相色譜儀，AgilentZorbax SB-C18 (4.6 X 250mm，5 μ m)色譜柱，或冊H C18 (2.I X 50mm，1.7 μ m)色譜柱。
[0033]其他:SI_114丹佛電子天平，MS105梅特勒電子天平，SK3300HP型超聲波清洗器(上海科導超聲儀器有限公司)；2，4，6-三羥基苯乙酮_3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷對照品(自制，批號130819、純度98.74% ) ;HPLC用乙腈和甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。
[0034]2、樣品取樣量的確定
[0035]三叉苦不同產(chǎn)地、不同季節(jié)、不同部位樣品中2，4，6-三羥基苯乙酮-3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷含量存在差異，根據(jù)供試品溶液的制備和對照品TLC點樣量和HPLC進樣量試驗結果，擬訂供試品含2，4，6-三羥基苯乙酮_3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷0.01?10mg。
[0036]3、提取方法的選擇
[0037]以甲醇作為提取溶劑，考察了回流提取和超聲提取2種提取方法，分別處理5?60分鐘，結果表明，2種提取方法均可行，色譜效果一致，提取時間較短時提取率稍低，能滿足TLC鑒別的要求，但不能滿足HPLC含量測定的要求，提取時間超過30分鐘即可提取完全。
[0038]4、提取溶劑的選擇
[0039]稱取三叉苦(批號101104)莖粗粉(通過三號篩)、葉粗粉(通過四號篩)各8份，每份含2，4，6-三羥基苯乙酮_3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷約lmg，精密稱定，分別精密加入水、50%甲醇、甲醇、50%乙醇、乙醇、50%正丁醇、50%乙腈、50%丙酮各50ml，稱定重量，加熱回流提取60分鐘，放冷，再稱定重量，分別用相應的溶劑補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，或取濾液照上述方法(3)經(jīng)DlOl大孔吸附樹脂柱處理制得供試品溶液，照上述色譜條件，以甲醇-0.1%磷酸溶液(20:80)為流動相，檢測波長285nm，依法進行TLC檢測和HPLC檢測。結果表明，幾種提取溶劑的提取率和色譜效果基本一致。
[0040]5、提取溶劑加量的選擇
[0041]不同樣品中2，4，6-三羥基苯乙酮_3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷含量不同，取樣量也就不同，TLC鑒別和HPLC含量測定對提取率的要求也不同，經(jīng)試驗，溶劑加量在5?IOOml之間，能夠滿足不同樣品、不同檢測目的的要求。
[0042]6、提取溶液的處理
[0043](I)提取溶液加相應溶劑稀釋制成每Iml含2，4，6-三羥基苯乙酮-3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷0.001?Img的溶液，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，色譜效果基本符合要求。[0044](2)提取溶液蒸干，按常規(guī)方法，殘渣加水使溶解，用乙酸乙酯進行萃取，分取水層液，蒸干，殘渣加甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、水或這些溶劑任意比例的混合溶液I?IOml使溶解，所得溶液作為供試品溶液，色譜效果符合要求，部分樣品色譜效果更好。
[0045](3)提取溶液蒸干，按常規(guī)方法，殘渣加水2?30ml使溶解，用DlOl大孔吸附樹脂柱(內徑I?2.5cm，樹脂床高2?15cm)進行純化處理，用水10?IOOml洗脫可以去除不吸附的雜質，棄去洗脫液，再用體積百分比為5?50%的甲醇或5?50%的乙醇25?200ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、水或這些溶劑任意比例的混合溶液I?IOml使溶解，所得溶液作為供試品溶液，色譜效果符合要求，部分樣品色譜效果更好。
[0046](4)三叉苦中含有一定量的不同的2，4，6-三輕基苯乙酮-3，5-二-C-beta-D-葡萄糖苷的酯類衍生物，按常規(guī)方法進行酸水解，即可將這些衍生物轉化為2，4，6-三羥基苯乙酮-3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷，增加供試品溶液中2，4，6_三羥基苯乙酮-3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷的量。經(jīng)試驗，提取溶液蒸干，殘渣加水2?5ml使溶解，加入等體積的2?4mol/LHCl溶液，使2，4，6-三羥基苯乙酮_3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷在I?2mol/LHCl溶液中90°C條件下水解15?150分鐘，2，4，6-三羥基苯乙酮-3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷的量即可達到最大值，所得溶液直接作為供試品溶液，或加入I倍體積以上的甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、水或這些溶劑任意比例的混合溶液稀釋后作為供試品溶液，色譜效果符合要求，部分樣品色譜效果更好。
[0047]7、對照品溶液和供試品溶液溶劑選擇
[0048]根據(jù)2，4，6-三羥基苯乙酮_3，5_ 二 -C-beta-D-葡萄糖苷的溶解性，經(jīng)試驗，甲醇、乙醇、正丁醇、乙腈、丙酮、水或這些溶劑任意比例的混合溶液均可作為對照品溶液和供試品溶液的溶劑。
[0049]8、薄層色譜鑒別展開劑和顯色劑的選擇
[0050]取上述供試品溶液，分別以不同比例的氯仿-甲醇-甲酸-水、或甲醇-水、正丁醇-乙酸-甲酸-水的上清液、或其他相似極性的展開劑作為展開劑，以不同濃度的硫酸乙醇溶液、或三氯化鐵乙醇溶液、或香草醛硫酸乙醇溶液、或三氯化鋁乙醇溶液作為顯色劑，依法試驗，結果表明，這些展開劑、顯色劑均可行，色譜效果有一定差異，但均能達到要求。
[0051]9、高效液相色譜含量測定方法研究:
[0052](I)檢測波長的選擇2，4，6-三羥基苯乙酮_3，5_ 二 -C-beta-D-葡萄糖苷甲醇溶液(50yg/ml)在200至800nm范圍內掃描，結果在230nm和285nm波長處有最大吸收，經(jīng)試驗，在230nm±2nm和285 ±2nm波長處檢測，結果除了峰面積不一樣之外，其他基本一致，它們均可作為檢測波長。
[0053](2)流動相的選擇考察了乙睛-0.1 %磷酸、乙睛-水、乙睛-1 %冰醋酸溶液(PH2.5)、乙睛-0.5 %三乙胺0.1 %磷酸溶液、乙睛-(0.1 %磷酸0.2 %四氫呋喃)、乙腈-0.1 %三氟乙酸、甲醇-0.1 %磷酸、甲醇-水、甲醇-1 %冰醋酸、乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液10個系統(tǒng)。結果表明，都符合中國藥典一部附錄VID規(guī)定的要求，色譜效果基本一致。
[0054]10、高效液相色譜含量測定線性關系試驗
[0055]取2，4, 6-三輕基苯乙酮-3，5_ 二-C-beta-D-葡萄糖苷對照品，精密稱定,置IOml量瓶中，加50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，用50%甲醇稀釋制成不同濃度的對照品溶液，分別精密吸取10 μ 1，照擬定的色譜條件，以甲醇-ο.1%磷酸溶液(20:80)為流動相，檢測波長285nm，依法測定，結果見表1。
[0056]表1 2，4，6-三羥基苯乙酮_3，5_ 二 -C-beta-D-葡萄糖苷含量測定線性關系試驗結果
[0057]
【權利要求】
1.2，4，6-三羥基苯乙酮-3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷在三叉苦藥材質量檢測中的應用，其特征在于是以三叉苦藥材中含有的專屬性成分2，4，6-三羥基苯乙酮-3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷作為指標成分，采用常規(guī)的薄層色譜法和常規(guī)的高效液相色譜法對三叉苦藥材進行鑒別和含量測定。
2.如權利要求1所述的2，4，6-三羥基苯乙酮_3，5-二 -C-beta-D-葡萄糖苷在三叉苦藥材質量檢測中的應用，其特征在于其鑒別和含量測定的步驟如下: 一、用常規(guī)方法制備得到2，4,6- 二羥基苯乙麗-3，5- 二 -C-beta-D-匍萄糖昔； 二、2，4，6-三羥基苯乙酮_3，5-二 -C-beta-D-葡萄糖苷對照品溶液的制備 稱取2，4，6-三羥基苯乙酮_3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷對照品，精密稱定，加溶劑溶解并稀釋制成每1ml含0.0Ol~Img的溶液，濾過，取續(xù)濾液作為對照品溶液，溶劑是甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、水或這些溶劑任意比例的混合溶液； 三、供試品溶液的制備 取三叉苦莖或葉，粉碎，混勻，取粉末供試品精密稱定，供試品含2，4，6-三羥基苯乙酮-3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷0.01~IOmg ;在上述供試品中加入5~100mL溶劑,所述的溶劑是甲醇、乙醇、正丁醇、乙腈、丙酮、水或這些溶劑任意比例的混合溶液，超聲處理.5~60分鐘,或加熱回流5~60分鐘,放冷,濾過,濾液按照以下方法中的一種處理，制成供試品溶液: (1)取濾液，加相應溶劑稀釋制成每1ml含2，4，6-三羥基苯乙酮-3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷0.001~Img的溶液，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液； (2)取濾液，蒸干，殘渣加水2~30ml使溶解，用乙酸乙酯萃取2~5次，每次2~30ml，分取水層液，蒸干，殘渣加溶劑I~IOml使溶解，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，溶劑是甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、水或這些溶劑任意比例的混合溶液； (3)取濾液，蒸干，殘渣加水2~30ml使溶解，加在DlOl大孔吸附樹脂柱上，樹脂柱內徑I~2.5cm,樹脂床高2~15cm,用水10~100mL洗脫,棄去洗脫液,再用體積百分比為5~50%的甲醇或5~50%的乙醇20~200ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加溶劑I~IOml使溶解，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，溶劑是甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、水或這些溶劑任意比例的混合溶液； (4)取濾液，蒸干，殘渣加水2~5ml使溶解，加入等體積的2~4mol/LHCl溶液，90°C水浴中保溫15~150分鐘，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，或加入I倍體積以上的相應溶劑稀釋后濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，溶劑是甲醇、乙醇、乙腈或丙酮； 四、薄層色譜鑒別 照薄層色譜法試驗，吸取上述供試品溶液I~10 μ I和對照品溶液I~10 μ 1，分別點于同一硅膠G薄層板上,用氯仿-甲醇-甲酸-水.5~9:1~5:0.2~1:0.2~1、或甲醇-水10:0.2~2、或正丁醇-乙酸-甲酸-水10:0~5:0~5:0.1~0.5的上清液作為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5~20%硫酸乙醇溶液、或I~10%三氯化鐵乙醇溶液、或.2~10%香草醛5~20%硫酸乙醇溶液、或0.5~2%三氯化鋁乙醇溶液作為顯色劑，室溫或加熱顯色，365nm紫外光燈下或日光下檢視； 五、高效液相色譜含量測定 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-酸水溶液或乙腈-水溶液5~15:95~85、甲醇-酸水溶液或甲醇-水溶液5~30:95~70為流動相，酸水是體積百分比為0.05~5%的甲酸溶液、乙酸溶液、磷酸溶液、三氟乙酸溶液中的任意一種，檢測波長為230±3nm或285±3nm ;理論塔板數(shù)按2，4, 6-三羥基苯乙酮-3，5- 二 -C-beta-D-葡萄糖苷峰計算不低于3000 ； 測定方法照高效液相 色譜法測定，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各I~.20 μ 1，分別注入液相色譜儀，測定，即得。
【文檔編號】G01N30/90GK103995081SQ201410232165
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月29日 優(yōu)先權日:2014年5月29日
【發(fā)明者】楊增明 申請人:楊增明