利用銅離子特異性DNA和SYBR Green I熒光法檢測(cè)銅的方法
【專利摘要】一種水質(zhì)檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】的利用銅離子特異性DNA和SYBR?Green?I熒光法檢測(cè)銅的方法，通過含有銅離子特異性DNA的檢測(cè)液制備得到標(biāo)準(zhǔn)銅離子檢測(cè)體系，通過與空白對(duì)照液共同檢測(cè)熒光強(qiáng)度后制成濃度‐相對(duì)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線；最終在檢測(cè)時(shí)通過將待測(cè)水樣置于含有銅離子特異性DNA的檢測(cè)液中，經(jīng)檢測(cè)熒光強(qiáng)度并對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)銅離子濃度的檢測(cè)。本發(fā)明通過比較熒光信號(hào)的變化，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)銅離子的檢測(cè)。本方法提供的檢測(cè)方法靈敏度高選擇性好，最低檢測(cè)限為5.57ppb，操作簡(jiǎn)便快捷且不依賴大型儀器設(shè)備，可用于水體銅的實(shí)時(shí)原位檢測(cè)。
【專利說明】利用銅離子特異性DNA和SYBR Green I熒光法檢測(cè)銅的方
法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及的是一種水質(zhì)監(jiān)測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】的方法，具體是一種利用銅離子特異性DNA和SYBR Green I熒光法檢測(cè)銅的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]銅離子在環(huán)境監(jiān)測(cè)及生物學(xué)領(lǐng)域是一種重要的金屬離子。人體曝露于高濃度的銅離子會(huì)引發(fā)各種不利的健康效應(yīng)，如胃病、腸病、肝臟或者腎臟損傷、老年癡呆癥、個(gè)體Menkes、Wilson疾病以及朊病毒病等。鑒于此，美國環(huán)保署(EPA)將飲用水中銅離子的最高允許值定為1.25ppm(約20 μ M)。因此，建立高靈敏度、高選擇性的銅離子檢測(cè)方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0003]傳統(tǒng)的銅離子檢測(cè)方法有原子吸收光譜法、原子發(fā)射光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜法、原子熒光光譜法和氣相色譜法，這些方法雖早已成熟并準(zhǔn)確可靠，但在實(shí)際應(yīng)用中需要昂貴復(fù)雜的儀器設(shè)備以及訓(xùn)練有素的技術(shù)人員，費(fèi)力費(fèi)時(shí)，難以滿足大規(guī)模應(yīng)用及實(shí)時(shí)原位檢測(cè)的需要。新型的銅離子檢測(cè)技術(shù)有化學(xué)傳感器技術(shù)和生物傳感器技術(shù)，其中功能核酸類生物傳感器因具有選擇性好、信號(hào)轉(zhuǎn)換容易等特點(diǎn)而成為研究熱點(diǎn)。最常見的用于銅檢測(cè)的功能核酸是銅離子特異性核酸酶(DNAzyme)，此類核酸酶檢測(cè)銅的原理是其底物鏈中包含一個(gè)銅離子特異性酶切位點(diǎn)，銅離子可以特異性地從該位置將該底物鏈切斷，通過將底物鏈的斷裂過程轉(zhuǎn)化成比色、化學(xué)發(fā)光和熒光等信號(hào)而達(dá)到檢測(cè)目的。但核酸酶的一個(gè)缺點(diǎn)是其合成成本高，并且不穩(wěn)定，容易失去活性。而單鏈寡核苷酸類的功能核酸具有合成成本低、穩(wěn)定性好，易于轉(zhuǎn)化為信號(hào)表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，因此開發(fā)單鏈寡核苷酸類的銅離子特異性DNA來檢測(cè)銅離子具有重大的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。
[0004]熒光法是一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏的檢測(cè)方法，已結(jié)合功能核酸(尤其是單鏈寡核苷酸類的功能核酸)被用來檢測(cè)多種物質(zhì)，關(guān)于銅離子的檢測(cè)也有報(bào)道，但這些方法或需要用熒光基團(tuán)標(biāo)記功能核酸，或用到核酸酶，涉及復(fù)雜的催化反應(yīng)。而利用銅離子特異性DNA和SYBR Green I熒光法檢測(cè)銅的方法較少見報(bào)道。
[0005]經(jīng)過對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的檢索發(fā)現(xiàn)，中國專利文獻(xiàn)號(hào)CN103160504A，公開(公告)日2013.06.19，公開了一種食品安全【技術(shù)領(lǐng)域】的用于重金屬鉛的快速檢測(cè)的核酸熒光探針及其檢測(cè)方法，通過對(duì)比探針中加入其它五種金屬離子Zn2+、Cd2+、Cu2+、Mg2+、Mn2+在260nm處的熒光強(qiáng)度，得到所述探針對(duì)于鉛離子的特異性結(jié)果，并通過熒光強(qiáng)度變化實(shí)現(xiàn)Pb22的定性檢測(cè)；通過對(duì)探針中加入已知濃度的Pb2+，并且在260nm處掃描熒光強(qiáng)度，從而構(gòu)建出Pb2+濃度與熒光強(qiáng)度之間檢測(cè)體系及其線性關(guān)系曲線；隨后將待測(cè)樣品在260nm處掃描出的熒光強(qiáng)度值代入線性關(guān)系曲線，從而得到Pb2+的濃度并實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。但該技術(shù)所用的核酸需要標(biāo)記三個(gè)熒光基團(tuán),合成成本高；其核酸酶底物鏈中包含的腺嘌呤核糖核苷酸(rA)容易降解；特異性驗(yàn)證只涉及其他五種金屬離子，存在一定的局限等。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的諸如:需要對(duì)核酸進(jìn)行熒光標(biāo)記、DNAzyme的合成成本高并且不穩(wěn)定、涉及復(fù)雜的催化反應(yīng)等缺陷，提出一種利用銅離子特異性DNA和SYBRGreen I熒光法檢測(cè)銅的方法，通過比較熒光信號(hào)的變化，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)銅離子的檢測(cè)。本方法提供的檢測(cè)方法靈敏度高選擇性好，最低檢測(cè)限為5.57ppb，操作簡(jiǎn)便快捷且不依賴大型儀器設(shè)備，可用于水體銅的實(shí)時(shí)原位檢測(cè)。
[0007]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明通過含有銅離子特異性DNA的檢測(cè)液制備得到標(biāo)準(zhǔn)銅離子檢測(cè)體系，通過與空白對(duì)照液共同檢測(cè)熒光強(qiáng)度后制成濃度-相對(duì)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線；最終在檢測(cè)時(shí)通過將待測(cè)水樣置于含有銅離子特異性DNA的檢測(cè)液中，經(jīng)檢測(cè)熒光強(qiáng)度并對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)銅離子濃度的檢測(cè)。
[0008]所述的銅離子特異性DNA，即CulOO序列，如Seq ID N0.1所示，具體為:
[0009](5’ -AGATTGCACTTACTATCTCGATGAAGAAGTACCCGGAGCGACGTTGGTTGTTCTGTAAAATTGAATAAGC TGGTATCTCCCTATAGTGAGTCGTATTACC - 3’)。
[0010]所述的標(biāo)準(zhǔn)銅離子檢測(cè)體系是指:在若干支所述檢測(cè)液中加入已知且不同濃度銅標(biāo)準(zhǔn)液后，進(jìn)一步加入DNA嵌入劑SYBR Green I。
[0011]所述的空白對(duì)照液是指:在所述檢測(cè)液中僅加入DNA嵌入劑SYBR Green I。
[0012]所述的檢測(cè)熒光強(qiáng)度是指:采用石英熒光用比色皿，用熒光光度計(jì)進(jìn)行掃描測(cè)定信號(hào)，并記錄標(biāo)準(zhǔn)銅離子檢測(cè)體系中的濃度銅C01與其對(duì)應(yīng)的相對(duì)熒光強(qiáng)度Q = [F0 -F] /F0,其中:F和Ftl分別為標(biāo)準(zhǔn)銅離子檢測(cè)體系和空白對(duì)照液的熒光光譜信號(hào)。
[0013]所述的檢測(cè)的方式具體為:以激發(fā)光狹縫為10nm，發(fā)射光狹縫為10nm，激發(fā)光波長(zhǎng)為490nm條件下掃描，獲得其熒光信號(hào)光譜。
[0014]所述的不同濃度是指6?600ppb。
[0015]所述的標(biāo)準(zhǔn)銅離子檢測(cè)體系優(yōu)選為在25°C條件下避光孵育。
技術(shù)效果
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明不需要大型儀器設(shè)備，檢測(cè)靈敏度高，選擇性好，操作簡(jiǎn)單，可用于檢測(cè)飲用水中的銅含量是否超標(biāo)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為利用銅離子特異性DNA和SYBR Green I熒光法檢測(cè)銅示意圖。
[0018]圖2為不同濃度銅加入到CulOO與SG形成的檢測(cè)體系后的熒光信號(hào)示意圖。
[0019]圖3為相對(duì)熒光強(qiáng)度與不同濃度銅的關(guān)系示意圖。
[0020]圖4為不同金屬離子加入到CulOO與SG形成的檢測(cè)體系后的相對(duì)熒光強(qiáng)度示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1[0022]本實(shí)施例包括以下步驟:1)制備由銅離子特異性DNA(CulOO)形成的檢測(cè)體系:在2mL刻度離心管中，分別加入IOyL濃度為I μ M的CulOO (序列為5’ -AGATTGCACTTACTATCTCGATGAAGAAGTACCCGGAGCGACGTTGGTTGTTCTGTAAAATTGAATAAGC TGGTATCTCCCTATAGTGAGTCGTATTACC -3’)母液，補(bǔ)加去離子水至446.5 μ L，充分混勻后再將離心管置于25°C條件下備用。
[0023]2)制備已知銅濃度的檢測(cè)體系:取15支包含按步驟I)方法制備的由銅離子特異性DNA (CulOO)形成檢測(cè)體系混合液的離心管，分別加入50 μ L不同濃度銅標(biāo)準(zhǔn)液，使得整個(gè)檢測(cè)體系中的銅含量維持在6?600ppb，充分混勻后再將離心管置于25°C條件下孵育30min后,加入50 X SG母液3.5 μ L, 25°C條件下避光孵育IOmin后，留作以下測(cè)定用。
[0024]3)另取I支包含按步驟I)方法制備的由銅離子特異性DNA (CulOO)形成檢測(cè)體系混合液離心管，加入50 μ L超純水，按步驟2)方法處理后作為空白對(duì)照體系溶液。
[0025]4)分別取500 μ L步驟2)和步驟3)制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白對(duì)照液，置于石英熒光用比色皿(內(nèi)徑為0.5cmX0.5cm,外徑為1.0cmX 1.0cm)中，用突光光度計(jì)進(jìn)行掃描測(cè)定信號(hào)。具體的掃描條件為:激發(fā)光狹縫為10nm，發(fā)射光狹縫為10nm，激發(fā)光波長(zhǎng)為490nm條件下掃描，獲得其熒光信號(hào)光譜。銅和空白對(duì)照液的熒光光譜信號(hào)分別為F和H)，計(jì)算相對(duì)熒光強(qiáng)度 Q = [F0 -F]/F0。
[0026]5)以不同濃度銅(Cai)與對(duì)應(yīng)的相對(duì)熒光強(qiáng)度Q作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為 Q = 0.307CCu+5.595。
[0027]6)制備樣品檢測(cè)體系:取50 μ L待測(cè)水樣，加入到按步驟I)方法制備的由銅離子特異性DNA(CulOO)形成檢測(cè)體系混合液離心管中，充分混勻后再將離心管置于25°C條件下孵育30min后，加入50 X SG母液3.5 μ L，25°C條件下避光孵育IOmin后按步驟4)方法測(cè)
定其Q。
[0028]7)根據(jù)樣品測(cè)得的Q，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以求得樣品中銅含量。
[0029]8)驗(yàn)證:用本方法測(cè)定3份含銅濃度分別為50ppb、IOOppb和200ppb的多離子混合液各一份，得到的回收率為99.2% - 104.8%，證明了本方法的可靠性。
[0030]9)本方法測(cè)定水體銅的濃度范圍為5.57?600ppb,最低檢測(cè)限為5.57ppb。
【權(quán)利要求】
1.一種利用銅離子特異性DNA和SYBR Green I熒光法檢測(cè)銅的方法，其特征在于，通過含有銅離子特異性DNA的檢測(cè)液制備得到標(biāo)準(zhǔn)銅離子檢測(cè)體系，通過與空白對(duì)照液共同檢測(cè)熒光強(qiáng)度后制成濃度-相對(duì)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線；最終在檢測(cè)時(shí)通過將待測(cè)水樣置于含有銅離子特異性DNA的檢測(cè)液中，經(jīng)檢測(cè)熒光強(qiáng)度并對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)現(xiàn)銅離子濃度的檢測(cè)； 所述的銅離子特異性DNA，即 CulOO 序列為:(5’ -GATTGCACTTACTATCTCGATGAAGAAGTACCCGGAGCGACGTTGGTTGTTCTGTAAAATTGAATAAGCT GGTATCTCCCTATAGTGAGTCGTATTACC - 3’)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的標(biāo)準(zhǔn)銅離子檢測(cè)體系是指:在若干支所述檢測(cè)液中加入已知且不同濃度銅標(biāo)準(zhǔn)液后，進(jìn)一步加入DNA嵌入劑SYBR Green I。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的空白對(duì)照液是指:在所述檢測(cè)液中僅加入DNA嵌入劑SYBR Green I。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的檢測(cè)熒光強(qiáng)度是指:采用石英熒光用比色皿，用熒光光度計(jì)進(jìn)行掃描測(cè)定信號(hào)，并記錄標(biāo)準(zhǔn)銅離子檢測(cè)體系中的濃度銅Cai與其對(duì)應(yīng)的相對(duì)熒光強(qiáng)度Q= [Ftl-F]/Ftl，其中:F和Ftl分別為標(biāo)準(zhǔn)銅離子檢測(cè)體系和空白對(duì)照液的突光光譜信號(hào)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征是，所述的檢測(cè)熒光強(qiáng)度的方式具體為:以激發(fā)光狹縫為10nm，發(fā)射光狹縫為10nm，激發(fā)光波長(zhǎng)為490nm條件下掃描，獲得其熒光信號(hào)光譜。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征是，所述的不同濃度是指6?600ppb。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的標(biāo)準(zhǔn)銅離子檢測(cè)體系在25°C條件下避光孵育。
8.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其特征是，所述的濃度-相對(duì)熒光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Q = 0.307CCu+5.595。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK103940797SQ201410183078
【公開日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2014年5月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月2日
【發(fā)明者】周培, 詹深山, 徐涵楚, 詹學(xué)佳, 張暐霖, 呂晶 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)