水稻Rubisco大亞基抗原表位、其抗體及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水稻光合作用關(guān)鍵酶——核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)的大亞基抗原表位、抗水稻Rubisco大亞基的多克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用。水稻Rubisco大亞基特異性抗原表位的氨基酸序列如SEQ?ID?NO:1所示，經(jīng)過多肽合成，多肽與載體蛋白偶聯(lián)，免疫動(dòng)物制得抗血清，并經(jīng)過親和層析純化得到水稻Rubisco大亞基多克隆抗體。本發(fā)明制備的多克隆抗體效價(jià)高、親和力強(qiáng)、特異性好，可與水稻Rubisco大亞基發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，且制備成本低，得率高，為水稻Rubisco大亞基的基礎(chǔ)研究及其相關(guān)生理功能的研究提供了一個(gè)重要的工具。
【專利說明】水稻Rubisco大亞基抗原表位、其抗體及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種水稻光合作用關(guān)鍵酶一核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)的大亞基抗原表位,其抗體及應(yīng)用。
技術(shù)背景
[0002]核酮糖-1，5_二憐酸羧化酶 / 加氧酶(ribulose-l, 5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase, Rubisco ；EC4.1.1.39)是植物葉片中含量最豐富的蛋白，占葉片總蛋白的12-35%及可溶性蛋白的50%。Rubisco是具有雙重功能的光合碳同化的關(guān)鍵酶，一方面作為光合作用卡爾文循環(huán)中CO2固定的關(guān)鍵酶，參與催化CO2與核酮糖-1,5-二憐酸(ribulose-l, 5-bisphosphate, RuBP)反應(yīng)形成2分子3_憐酸甘油酸(3-phosphoglycerate, 3-PGA);同時(shí)又參與C3植物光呼吸過程,催化CO2與RuBP反應(yīng)生成I分子的3-PGA和I分子的2_憐酸乙醇酸(2-phosphoglycolate, 2-PG)。因此,Rubisco可以作為評(píng)價(jià)植物光合作用能力的生化指標(biāo)，研究Rubisco的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與降解機(jī)理對(duì)探索植物光合作用能力和調(diào)控作物生長(zhǎng)具有重要意義。
[0003]高等植物的Rubisco對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)、光照、溫度、病蟲害和葉片年齡變化較為敏感，表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)上的變化，在不利條件下發(fā)生解體，從而降低光合作用功能，影響產(chǎn)量與品質(zhì)的形成。經(jīng)研究，在水稻Rubisc0組成的大、小亞基中，大亞基對(duì)環(huán)境因素反應(yīng)更為敏感。同一種植物中，不同基因型的Rubisco大亞基的穩(wěn)定性存在差異，高產(chǎn)品種的Rubisco大亞基結(jié)構(gòu)通常具有較好的穩(wěn)定性。因此快速準(zhǔn)確檢測(cè)Rubisco大亞基蛋白穩(wěn)定性水平是了解和評(píng)價(jià)植物葉片功能穩(wěn)定性的關(guān)鍵技術(shù)。 [0004]高等植物Rubisco全酶由8個(gè)分子量約55kDa的大亞基(Rubisco large subunit,rbcL)和8個(gè)分子量約14kDa的小亞基(Rubisco small subunit,rbcS)聚合而成，分布于葉綠體基質(zhì)中。其中rbcL由葉綠體基因編碼的475個(gè)氨基酸殘基組成，rbcS由核基因編碼的123個(gè)氨基酸殘基組成；不同物種間rbcL序列同源性高達(dá)80%以上，而rbcS同源性不到70%。根據(jù)結(jié)構(gòu)-功能學(xué)分析，催化所必需的最重要的氨基酸殘基位于rbcL上。據(jù)此，種間雜交的Rubisco動(dòng)力學(xué)性質(zhì)應(yīng)遵循母體遺傳(Evans and Austion, 1986)。此外，Whitney等(2011)報(bào)道含有C4黃頂菊屬rbcL和煙草rbcS的雜交Rubisco表現(xiàn)C4黃頂菊屬高活性類型Rubisco的催化性能。這些結(jié)果說明Rubisco的催化性能很大程度上取決于rbcL的氨基酸序列。
[0005]rbcL包括N、B和C三個(gè)結(jié)構(gòu)域。N結(jié)構(gòu)域開始于N端的137個(gè)氨基酸殘基，含有5個(gè)β折疊。B和C結(jié)構(gòu)域由α螺旋構(gòu)成，C端結(jié)構(gòu)域由8個(gè)平行的β折疊和8個(gè)α螺旋組成的α β桶狀結(jié)構(gòu)。α β桶的核心除了兩末端的β折疊外，都是疏水殘基，Rubisco活性中心呈漏斗狀，由rbcL N結(jié)構(gòu)域的2個(gè)環(huán)和C端結(jié)構(gòu)域α β桶狀區(qū)域的8個(gè)Loop環(huán)所提供的大量電子和極性基團(tuán)所組成，并有Mg2+參與，它和帶有氨甲?；腖ysl91和側(cè)鏈Aspl93及Glul94三個(gè)氨基酸發(fā)生作用(Lundqvist et al., 1991)。位于rbcL活性中心附近的氨基酸如(Lys-191, Lys-166, Lys-329)則表現(xiàn)出序列的保守性。[0006]關(guān)于Rubisco相關(guān)研究聚焦在大亞基上,涉及基因表達(dá)、蛋白表達(dá)和生化活性等方面研究，還有待深入。蛋白質(zhì)印記技術(shù)(Western Blot)是一種用特異性抗體定性定量分析目的蛋白的的蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)，具有靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)便和結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)外已有制備rbcL抗體合成的報(bào)道，依據(jù)抗原來源分為三類:一是提取植物Rubisco粗酶液，經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀純化后作為抗原，此種最為常見；二是采用純化后的重組蛋白作為抗原免疫動(dòng)物；三是經(jīng)人工合成多肽途徑制備抗原，免疫動(dòng)物而獲得抗體，此種鮮有報(bào)道。雖然前兩種方法對(duì)抗原蛋白進(jìn)行純化，但由于存在多個(gè)潛在抗原決定簇，所制備的抗體特異性無法保證。而經(jīng)多肽合成單一抗原，具有易操作、準(zhǔn)確性高和成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明通過對(duì)水稻Rubisco大亞基(rbcL)進(jìn)行抗原表位預(yù)測(cè)并合成相應(yīng)多肽作為抗原，制備了 rbcL多克隆抗體，該抗體具有較高的靈敏性和特異性。具體地，本發(fā)明包括以下幾方面:
[0008]本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種水稻Rubisco大亞基的抗原表位。通過分析水稻Rubisco大亞基 蛋白的特性(親水性和疏水性)及二級(jí)結(jié)構(gòu)，得到多個(gè)抗原表位序列，綜合考慮多妝的長(zhǎng)度等因素，確定了一條最有效的抗原表位，其氣基酸序列為KLTYYTPEYETKDTD (如 SEQ ID NO:1 所示)。
[0009]本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供所述抗原表位的用途。該抗原表位用于制備人工合成多肽抗原以及水稻Rubisco大亞基多克隆抗體。
[0010]本發(fā)明的第三個(gè)目的提供是一種水稻Rubisco大亞基多克隆抗體的制備方法:首先對(duì)所述多肽的氨基酸序列進(jìn)行末端修飾，然后將修飾后的多肽經(jīng)過固相合成并與載體蛋白偶聯(lián)，得到抗原，用抗原免疫動(dòng)物后，取動(dòng)物的多抗血清并從中分離純化多克隆抗體。
[0011]所述末端修飾為在氨基酸序列的C端增加一個(gè)半胱氨酸殘基，修飾后的多肽的氨基酸序列為 KLTYYTPEYETKDTDC(如 SEQ ID NO:2 所示)。
[0012]為增強(qiáng)動(dòng)物的免疫反應(yīng)，將多肽與載體蛋白偶聯(lián)，所述載體蛋白為鑰孔戚血蘭蛋白(keyhole limpet hemacyanin, KLH),偶聯(lián)劑為琥拍酰亞胺_4_環(huán)已燒-1-碳酸酯(suecinimidyl4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate,SMCC)。
[0013]將多肽采用9-芴甲氧羰基(FMOC)保護(hù)α -氨基進(jìn)行固相合成。
[0014]本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種水稻Rubisco大亞基多克隆抗體。本發(fā)明所提供的水稻Rubisco大亞基抗體，是用上述抗原免疫動(dòng)物，再從所免疫的動(dòng)物中分離、純化血清得到特異性好、敏感性強(qiáng)的多克隆抗體。免疫動(dòng)物可以選擇兔、小鼠、大鼠、山羊等常用的免疫動(dòng)物，純化方法為親和層析純化。
[0015]本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供所述多克隆抗體在檢測(cè)水稻Rubisco大亞基中的應(yīng)用。所述的多克隆抗體能應(yīng)用于基于抗原抗體反應(yīng)原理來檢測(cè)目的蛋白的生物技術(shù)中，包括免疫印跡、免疫共沉淀和免疫組化等應(yīng)用技術(shù)。
[0016]本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供一種檢測(cè)水稻Rubisco大亞基的方法，該方法包括使用所述的多克隆抗體的步驟。
[0017]本發(fā)明的第七個(gè)目的是提供一種檢測(cè)水稻Rubisco大亞基的試劑，該試劑含有所述的多克隆抗體。
[0018]本發(fā)明制備的多克隆抗體效價(jià)高、親和力強(qiáng)、特異性好,可與水稻Rubisco大亞基發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng)，且制備成本低，得率高，具有工業(yè)化生產(chǎn)的可行性。該抗體可對(duì)水稻葉片在不同發(fā)育時(shí)期、不同生長(zhǎng)條件下的表達(dá)情況進(jìn)行分析研究，為篩選具有高穩(wěn)定性Rubisco的種質(zhì)資源提供了技術(shù)支持。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1.多克隆抗體ant1-rbcL純化前后的特異性檢驗(yàn)
[0020]圖2.本發(fā)明合成的水稻Rubisco大亞基多克隆抗體(ant1- rbcL)對(duì)水稻葉片不同發(fā)育時(shí)期的免疫印跡檢測(cè)結(jié)果。
[0021]圖3.本發(fā)明合成的水稻Rubisco大亞基多克隆抗體(ant1- rbcL)對(duì)Rubisco大亞基降解情況的檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下面將結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)描述。下面的實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。實(shí)施例中未注明的具體技術(shù)或者條件，均按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所記載或本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)手段進(jìn)行操作。
[0023]實(shí)施例1:預(yù)測(cè)候選抗原表位和人工合成抗原
[0024]所用水稻rbcL對(duì)應(yīng)的氨基酸序列在GenBank中的ID是P0C510，全長(zhǎng)序列如SEQID NO: 3所示，分析氨基酸序列的親水性、表露性和柔韌性等，在該蛋白的N端選出了一段氨基酸序列為KLTYYTPEYETKDTD (如SEQ ID NO:1所示，該序列位于序列表SEQ ID NO: 3的21-35位)。經(jīng)Blast比對(duì)水稻蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，確定該段多肽能唯一識(shí)別rbcL。
[0025]為將該序列與載體蛋白偶聯(lián)，在該序列的C端增加一個(gè)半胱氨酸殘基，因此合成的氨基酸序列為KLTYYTPEYETKDTDC(如SEQ ID N0:2所示)，由百意欣生物技術(shù)有限公司進(jìn)行固相合成，并經(jīng)由偶聯(lián)劑為琥珀酰亞胺-4-環(huán)已烷-1-碳酸酯與載體蛋白匙孔血藍(lán)蛋白偶聯(lián)，形成rbcL抗原。
[0026]實(shí)施例2:多克隆抗體ant1-rbcL的血清制備和純化
[0027]以上述合成抗原免疫動(dòng)物，免疫動(dòng)物選擇年齡在3個(gè)月、體重2kg的健康新西蘭大白兔，具體步驟如下:
[0028]首先對(duì)兔子進(jìn)行免疫前誘導(dǎo)，通過四肢、腋下及背部皮下注射0.5mL弗氏完全佐劑，刺激局部免疫反應(yīng)，I周后進(jìn)行免疫。首次免疫前，經(jīng)耳靜脈取血作為陰性對(duì)照。將抗原(以載體蛋白計(jì)算)用 PBS 緩沖液(137mM NaCl, 2.7mM KCl, IOmM Na2HPO4, 2mM KH2PO4,ρΗ7.4)稀釋至Img.mL'取500 μ L抗原稀釋液加入300 μ L PBS緩沖液和800 μ L弗氏完全佐劑(首次免疫)或弗氏不完全佐劑(第2-4次免疫)在渦旋儀上混勻和乳化，對(duì)兔子進(jìn)行四肢、腋下及背部皮下多點(diǎn)注射。免疫每間隔兩周進(jìn)行，共進(jìn)行4次免疫。第4次免疫11天時(shí)進(jìn)行頸動(dòng)脈放血，收集血樣。將血樣靜置于4°C過夜，在4°C條件下5000rpm離心IOmin,收集分裝血清于_80°C保存。 [0029]將血清進(jìn)行親和層析純化，具體步驟如下:
[0030](I)親和層析柱的制備:用適量ImM HCl充分溶脹和浸洗Ig CNBr -Sepharose4B (Pharmacia)凝膠干粉后，同時(shí)將5mg的rbcL抗原溶解于適量連接緩沖液(pH8.3,0.1M NaHCO3,0.5M NaCl)，兩者室溫下旋轉(zhuǎn)混合lh。凝膠用連接緩沖液沖洗去除未結(jié)合的rbcL抗原，浸沒0.1M Tris - HCl pH8.0緩沖液中裝柱并靜置2h以封閉凝膠上的活化基團(tuán)。用 5 倍凝膠體積的低 / 高 pH 溶液(pH4.0,0.1M CH3COONa, 0.5Μ NaCl ；ρΗ8.00.1MTris-HC1,0.5M NaCl)交替洗凝膠3次，用10倍凝膠體積的TBS緩沖液(pH7.5,50mMTris -HCl,150mM NaCl)平衡柱子。
[0031](2)親和層析純化抗多肽抗體:將20mL血清用TBS緩沖液稀釋至IOOmL,用孔徑為0.45 μ m的混合纖維素膜濾器(捷瑞F2502)過濾除去血細(xì)胞等雜質(zhì)。將血清溶液以0.5mL.mirT1的速度通過層析柱并連續(xù)上柱2次,保證抗血清與填料的結(jié)合。用TBS緩沖液清洗層析柱至洗脫液A28tlnm < 0.008后進(jìn)行洗脫。洗脫緩沖液(50mMGlyCine，pH2.7)以
0.5mL.mirT1的速度通過層析柱洗脫目的蛋白，用離心管收集并在洗脫液中加入中和緩沖液(ρΗ8.0, IM Tris - HCl, 1.5Μ NaCl, ImM EDTA)調(diào)至約ρΗ7.4防止蛋白變性。離心管中洗脫蛋白為純化后多克隆抗體，加入等體積的甘油，保存在_20°C。
[0032]實(shí)施例3:多克隆抗體ant1-rbcL的特異性檢驗(yàn)
[0033]取0.1g水稻葉片用液氮充分研磨,按照l:5(w/v)比例加入0.5mL預(yù)冷的蛋白提取緩沖液(50mM Tris-HCl，ρΗ7.5，ImM EDTA, 15πιΜβ -巰基乙醇，1% [w/v]PVP)靜置 30min。在4°C條件下15000g離心30min,上清即為Rubisco粗酶液。用Bradford法對(duì)Rubisco粗酶液中可溶蛋白進(jìn)行定量后_80°C保存。
[0034]將Rubisco粗酶液(2.5 μ g蛋白)和上樣緩沖液等體積混合進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離。將PAGE膠經(jīng)槽式轉(zhuǎn)印系統(tǒng)快速轉(zhuǎn)印(高電場(chǎng)強(qiáng)度)至硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)印結(jié)束后用封閉液(20mM Tris-HCl，ρΗ7.5，500mM NaCl，5%脫脂奶粉)在37°C封閉硝酸纖維素膜lh。使用實(shí)施例2中制備的多抗ant1-rbcL，用含有5%脫脂奶粉的封閉液以1:10000的比例稀釋后，與封閉好的膜在 37°C下孵育 lh，TTBS(20mM Tris-HCl，pH7.5，500mM NaCl,0.05%[v/v] Tween-20)洗膜3次，每次lOmin，用含有5%脫脂奶粉的封閉液以1:5000的比例稀釋AP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(北京康為世紀(jì)，CW0111)，與洗好的膜在37°C下孵育lh，TTBS洗膜3次，每次IOmin0將膜浸泡在堿性磷酸酶緩沖液(0.1M Tris-HCl，pH9.5,0.5mM MgCl2,
0.33 μ g.mL_1NBT, 0.165 μ g.mL^BCIP)中顯色,直至條帶清晰(約 5-lOmin)。
[0035]抗血清未純化前與水稻可溶性蛋白雜交后，條帶不單一，特異性較差，如圖1 (a)所示；而經(jīng)偶聯(lián)有抗原多肽的CNBR Activated Sepharose4B柱子親和純化后,其Westernblot雜交后條帶單一，特異性較高，如圖1(b)所示，分子量軟件預(yù)測(cè)分子量52.88kDa相近。本實(shí)驗(yàn)中所用純化后抗體濃度為0.23mg.ml/1,抗體按照l:10000(w/v)比例稀釋至終濃度為5X 10_5mg.mL—1，所用體積大概為0.22 μ 1，抗體效價(jià)較高。以上結(jié)果證明制備的ant1-rbcL抗體可用，為后來做Rubisco蛋白表達(dá)量檢測(cè)打下了基礎(chǔ)。
[0036]實(shí)施例4:本發(fā)明合成的水稻Rubisco大亞基多克隆抗體(ant1- rbcL)對(duì)水稻葉片不同發(fā)育時(shí)期的Rubisco免疫印跡檢測(cè)
[0037]在水稻R49灌漿期，從花后第五天開始取水稻劍葉，間隔5天取一次，取4次(花后第20天)，-80°C保存。按實(shí)施例3方法提取Rubisco粗酶液，其他實(shí)驗(yàn)操作同實(shí)施例3。
[0038]結(jié)果如圖1所示，抗體具有很高的特異性，即只有一條主帶，分子量約為50kDa，且隨著灌漿期的進(jìn)行，RubiSCO大亞基含量有變化，所以本發(fā)明合成抗體能用于檢測(cè)不同生長(zhǎng)時(shí)期水稻葉片的rbcL。
[0039]實(shí)施例5:本發(fā)明多克隆抗體ant1- rbcL對(duì)Rubisco大亞基降解情況的檢測(cè)
[0040]按實(shí)施例3方法提取Rubisco粗酶液，將粗酶液加入等體積pH5.5的緩沖液(200mM Tris-HCl)稀釋，33°C水浴4h，然后與等體積SDS-PAGE上樣緩沖液混合。煮沸5min后，用于SDS-PAGE，其他實(shí)驗(yàn)操作同實(shí)施例3。
[0041]盡管本 發(fā)明的【具體實(shí)施方式】已經(jīng)得到詳細(xì)的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導(dǎo)，可以對(duì)一些細(xì)節(jié)進(jìn)行替換和修改，這些改變均在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種水稻Rubisco大亞基的抗原表位，其多肽的氨基酸序列為SEQ IDNO:1所示。
2.權(quán)利要求1所述的抗原表位在制備水稻Rubisco大亞基多克隆抗體中的應(yīng)用。
3.—種水稻Rubisco大亞基多克隆抗體的制備方法,其特征在于:首先對(duì)權(quán)利要求1中所述的多肽的氨基酸序列進(jìn)行末端修飾，然后將修飾后的多肽經(jīng)過固相合成并與載體蛋白偶聯(lián)，得到抗原，用抗原免疫動(dòng)物后，取動(dòng)物的多抗血清并從中分離純化多克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多克隆抗體制備方法，其特征在于:所述末端修飾為在權(quán)利要求I中所述的氨基酸序列的C端增加一個(gè)半胱氨酸殘基，修飾后的多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO:2 所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多克隆抗體制備方法，其特征在于所述載體蛋白為鑰孔戚血蘭蛋白，偶聯(lián)劑為琥珀酰亞胺-4-環(huán)已烷-1-碳酸酯。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5任何一項(xiàng)所述的制備方法得到的多克隆抗體。
7.權(quán)利要求6所述的多克隆抗體在檢測(cè)水稻Rubisco大亞基中的應(yīng)用。
8.一種檢測(cè)水稻Rubisco大亞基的方法，其特征在于包括使用權(quán)利要求6所述的多克隆抗體的步驟。
9.一種檢測(cè)水稻Rubisco大亞基的試劑，該試劑含有權(quán)利要求6所述的多克隆抗體。
【文檔編號(hào)】G01N33/573GK103952389SQ201410178847
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月30日
【發(fā)明者】唐紅玲, 何瑩, 李海霞, 曾漢來 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)