一種對(duì)巰基苯酚修飾納米金檢測(cè)雙酚a的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種對(duì)巰基苯酚修飾納米金檢測(cè)雙酚A的方法，該方法中雙酚A在過氧化物酶或過氧化物模擬酶，與H2O2作用下發(fā)生聚集，形成雙酚A聚合物，對(duì)巰基苯酚修飾納米金表面的酚羥基與雙酚A聚合物中的酚羥基鄰位形成共價(jià)鍵而使對(duì)巰基苯酚修飾納米金發(fā)生聚集，聚集后對(duì)巰基苯酚修飾納米金的表面狀態(tài)改變，表面狀態(tài)的改變其等離子共振吸收，表現(xiàn)為520nm處吸收變小，720nm處吸收迅速變大，以已知濃度的雙酚A溶液為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠為檢測(cè)物，建立雙酚A的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過雙酚A的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以準(zhǔn)確測(cè)量實(shí)際雙酚A樣品的濃度。該方法能對(duì)雙酚A進(jìn)行半定量和定量分析，成本低，且具有檢出通量高、檢測(cè)范圍廣、準(zhǔn)確和速度快的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】一種對(duì)巰基苯酚修飾納米金檢測(cè)雙酚A的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種對(duì)巰基苯酚修飾納米金檢測(cè)雙酚A的方法，屬于食品和日常用品安全檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]雙酚A(Bisphenol A，縮寫為BPA)，一種有機(jī)化合物，具有兩個(gè)酚官能團(tuán)。在工業(yè)上雙酚A被用來(lái)合成聚碳酸酯(PC)和環(huán)氧樹脂等材料，60年代以來(lái)就被用于制造塑料(奶)瓶、幼兒用的吸口杯、食品和飲料(奶粉)罐內(nèi)側(cè)涂層。后來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)BPA能導(dǎo)致內(nèi)分泌失調(diào)，威脅著胎兒和兒童的健康。癌癥和新陳代謝紊亂導(dǎo)致的肥胖也被認(rèn)為與此有關(guān)。2012年9月24日，美國(guó)華盛頓州立大學(xué)等機(jī)構(gòu)刊登其研究，公布其在獼猴進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，證實(shí)雙酚A會(huì)影響獼猴雌性后代的生殖系統(tǒng)，導(dǎo)致卵子染色體異常(Hunt，Patricia A.et.al.PNAS.2012，109(43) 17525-17530)。雖然目前各國(guó)已先后禁止了雙酚A在嬰兒奶瓶中的應(yīng)用，但是在日常成人飲水杯，熱敏紙，食品包裝材料等領(lǐng)域仍有著廣泛的應(yīng)用。由于雙酚A的大量使用，環(huán)境中雙酚A也普遍存在，如自然水體，雨水等都能檢出不同濃度的雙酚A。
[0003]目前國(guó)內(nèi)僅出臺(tái)了聚合物材料中雙酚A檢出的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，國(guó)標(biāo)采用高效液相色譜來(lái)實(shí)現(xiàn)雙酚A的檢出，檢出靈敏可靠，然而檢出前處理步驟麻煩，依賴大型儀器，檢測(cè)通量不高。對(duì)于雙酚A這樣普遍存在的環(huán)境污染物而言，快速高通量篩查技術(shù)可與高效液相色譜技術(shù)形成互補(bǔ)，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模檢測(cè)和樣品篩查?？焖贆z測(cè)技術(shù)是檢測(cè)領(lǐng)域的一塊很有競(jìng)爭(zhēng)力的方向，快速檢測(cè)技術(shù)具有檢測(cè)方法簡(jiǎn)單易行，檢測(cè)時(shí)間短，不需要大型儀器，甚至無(wú)需依賴儀器。盡管快速檢測(cè)由于靈敏度和特異性方面的限制，不能作為判定樣品安全性的最終依據(jù)；但作為發(fā)現(xiàn)問題的第一步，它具有不可替代的作用。事實(shí)上，一些突發(fā)食源性事件的現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查也往往以快速檢測(cè)作為篩查的第一步。目前雙酚A快速檢測(cè)技術(shù)還處于初步發(fā)展階段，比較常用的有抗體標(biāo)記納米金試紙條法，利用納米金標(biāo)記抗體識(shí)別雙酚A，抗體雙酚A復(fù)合物被捕獲后形成紅色條帶實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。該方法只能提供有或無(wú)的結(jié)果，而且檢測(cè)使用抗體成本較高，無(wú)法真正用于大規(guī)模篩查。因此，開發(fā)一種具有定量能力、成本低廉且檢測(cè)通量高的雙酚A檢測(cè)方法十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了一種對(duì)巰基苯酚修飾納米金檢測(cè)雙酚A的方法，該方法能對(duì)雙酚A進(jìn)行半定量和定量分析，成本低，且具有檢出通量高、檢測(cè)范圍廣、準(zhǔn)確和速度快的優(yōu)點(diǎn)。
[0005]實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所采用的技術(shù)方案為:
[0006]一種對(duì)巰基苯酚修飾納米金檢測(cè)雙酚A的方法，將對(duì)巰基苯酚溶液加入到納米金溶液中，避光孵育至得到對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠，以已知濃度的雙酚A溶液為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠為檢測(cè)物，在過氧化物酶或過氧化物模擬酶，與H2O2共同存在的條件下，對(duì)巰基苯酚修飾納米金發(fā)生聚集，檢測(cè)含不同已知濃度的雙酚A溶液的對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠在720nm和520nm處的光密度，以720nm和520nm處光密度的比值為縱坐標(biāo)，以2為底雙酚A濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，根據(jù)檢測(cè)的數(shù)據(jù)繪圖，擬合后得到雙酚A的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)關(guān)系式y(tǒng)=kx+b，以實(shí)際雙酚A樣品為被檢測(cè)物，對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠為檢測(cè)物，在過氧化物酶或過氧化物模擬酶，與H2O2共同存在的條件下，對(duì)巰基苯酚修飾納米金發(fā)生聚集，檢測(cè)含實(shí)際雙酚A樣品的對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠在720nm和520nm處的光密度，將720nm和520nm處光密度的比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)關(guān)系式的I值中，計(jì)算出X值，再根據(jù)X值計(jì)算出實(shí)際雙酚A樣品的濃度。
[0007]所述的對(duì)巰基苯酚修飾納米金檢測(cè)雙酚A的方法，包括如下步驟:
[0008]I)對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠的制備:
[0009]①按摩爾比對(duì)巰基苯酚:納米金=0.1:1?100:1，將濃度為I?20nM的納米金溶液加入對(duì)巰基苯酚溶液中至對(duì)巰基苯酚溶液的終濃度為0.1nM?2 μ Μ，混合均勻后，避光孵育至得到對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠；
[0010]2)建立雙酚A的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線:
[0011]①在酶標(biāo)儀微孔板的7個(gè)以上的孔中分別加入7組以上的相同體積、不同已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)雙酚A溶液，再分別加入催化量的過氧化物酶溶液或過氧化物模擬酶溶液，過量的H2O2溶液和過量的對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠，作為7個(gè)以上的實(shí)驗(yàn)組，其中7個(gè)以上的實(shí)驗(yàn)組中加入的過氧化物酶溶液或過氧化物模擬酶溶液，H2O2溶液和對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠完全相同，在另一個(gè)微孔板的一個(gè)孔中，加入與各實(shí)驗(yàn)組中雙酚A溶液等體積的水，再加入與各實(shí)驗(yàn)組相同的過氧化物酶溶液或過氧化物模擬酶溶液，H2O2溶液和對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠，作為陰性對(duì)照組，10?42°C孵育至實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比有色差后，檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中含已知濃度的雙酚A的對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠在波長(zhǎng)為520nm和720nm處的光密度；
[0012]②以720nm和520nm處光密度的比值為縱坐標(biāo)，以2為底雙酚A濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，根據(jù)各實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)的數(shù)據(jù)繪圖，擬合后得到雙酚A的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)關(guān)系式y(tǒng)=kx+b ；
[0013]3)實(shí)際雙酚A樣品濃度的測(cè)定:
[0014]①在酶標(biāo)儀微孔板的一個(gè)孔中先加入與步驟2)中各實(shí)驗(yàn)組中雙酚A溶液等體積的實(shí)際雙酚A樣品，再加入與步驟2)中各實(shí)驗(yàn)組相同的過氧化物酶溶液或過氧化物模擬酶溶液，H2O2溶液和對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠，10?42°C孵育至出現(xiàn)色差后，檢測(cè)含實(shí)際雙酚A樣品的對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠在720nm和520nm處的光密度，將720nm和520nm處光密度的比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)關(guān)系式的y值中，計(jì)算出X值，再根據(jù)X值計(jì)算出實(shí)際雙酚A樣品的濃度。
[0015]所述納米金溶液中納米金的粒徑為5_50nm。
[0016]所述過氧化物酶為辣根過氧化物酶，過氧化物模擬酶為氯化血紅素。
[0017]所述辣根過氧化物酶或過氧化物模擬酶的終濃度為0.2ηΜ-2 μ Μ。
[0018]所述H2O2溶液的終濃度為0.00006%-0.6%，該濃度為體積百分比濃度。
[0019]在上述技術(shù)方案中，過氧化物酶或過氧化物模擬酶是催化劑，用來(lái)催化雙酚A聚合，只需要使用催化量的即能達(dá)到目的，H2O2是氧化劑，用來(lái)氧化雙酚A聚合，H2O2 一定要確保過量，確保加入的標(biāo)準(zhǔn)雙酚A能完全被氧化聚合，對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠是檢測(cè)物，與雙酚A聚合物發(fā)生共聚合作用，為了使加入的標(biāo)準(zhǔn)雙酚A被完全檢測(cè)出來(lái)，對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠的量與雙酚A聚合物的量相比要確保過量。在實(shí)際操作過程中，繪制雙酚A的標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，由于雙酚A的量是已知的，H2O2的量是可以根據(jù)雙酚A的量來(lái)確定的，對(duì)巰基苯酹修飾納米金溶膠的量與雙酹A聚合物的量相比應(yīng)確保是過量的，同時(shí)還應(yīng)確保對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠對(duì)雙酚A的響應(yīng)靈敏度在數(shù)量級(jí)上保持穩(wěn)定并且在520nm和720nm處光密度之比值的變化幅度不超過10%。
[0020]由上述技術(shù)方案可知，該方法中雙酚A在過氧化物酶或過氧化物模擬酶，與H2O2作用下發(fā)生聚集，形成雙酚A聚合物，對(duì)巰基苯酚修飾納米金表面的酚羥基與雙酚A聚合物中的酚羥基鄰位形成共價(jià)鍵而使對(duì)巰基苯酚修飾納米金發(fā)生聚集，聚集后對(duì)巰基苯酚修飾納米金的表面狀態(tài)改變，表面狀態(tài)的改變其等離子共振吸收，表現(xiàn)為520nm處吸收變小，720nm處吸收迅速變大。以已知濃度的雙酚A溶液為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠為檢測(cè)物，建立雙酚A的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過雙酚A的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以準(zhǔn)確測(cè)量實(shí)際雙酚A樣品的濃度，即對(duì)雙酚A樣品進(jìn)行定量分析，不僅僅是簡(jiǎn)單的定性分析。
[0021]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果和優(yōu)點(diǎn)在于:
[0022]I)該方法中用對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠作為檢測(cè)物，而制備對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠的方法簡(jiǎn)單，所使用的試劑均為常用試劑，價(jià)格低廉，因而用對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠作為檢測(cè)物使該方法檢測(cè)的成本低。
[0023]2)該方法通過建立標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)雙酚A進(jìn)行定量分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍為
0.5?32mg/L，當(dāng)雙酚A的濃度在此線性范圍內(nèi)時(shí)，采用該方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果十分準(zhǔn)確、可靠，當(dāng)不在此范圍內(nèi)，稍有偏差，可進(jìn)行半定量分析，而且操作簡(jiǎn)單，快速，靈敏度高，檢出限低，。
[0024]3)該方法檢測(cè)時(shí)所使用的試劑均為普通試劑，所使用的測(cè)量?jī)x器為酶標(biāo)儀，酶標(biāo)儀為常用儀器，因此，該方法的檢測(cè)成本低。
[0025]4)該方法可同時(shí)進(jìn)行大量的雙酚A樣品分析，檢出通量高。
[0026]5)該方法制備對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠的方法簡(jiǎn)單，可在檢測(cè)檢測(cè)現(xiàn)場(chǎng)隨時(shí)制備，不需要事先制備存放，而且對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠對(duì)含有金屬離子的雙酚A樣品，特別是含有鉄系離子的雙酚A樣品可以進(jìn)行準(zhǔn)確地測(cè)量，不會(huì)因?yàn)榻饘匐x子的存在對(duì)檢測(cè)造成干擾，檢測(cè)范圍廣。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0027]圖1為對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠的透射電鏡(TEM)圖。
[0028]圖2為對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠與雙酚A反應(yīng)的透射電鏡(TEM)圖。
[0029]圖3為實(shí)施例2制備的對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠檢測(cè)雙酚A的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0030]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。
[0031]實(shí)施例1
[0032]I)對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠的制備:
[0033]將lmL20 μ M對(duì)巰基苯酚溶液加入到IOOmLlOnM納米金粒徑為13nm的納米金溶液中，混合均勻后，錫箔包被慢搖2小時(shí)，即得對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠，用透射電鏡圖觀察對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠，對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠的透射電鏡圖如圖1所示，由圖1可知納米金修飾后沒有發(fā)生聚集，可以作為檢測(cè)物使用；
[0034]2)對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠對(duì)雙酚A時(shí)的響應(yīng):
[0035]在40 μ L30mg/L雙酚A溶液中加入5 μ L3 μ M辣根過氧化物酶溶液，5 μ L體積百分濃度為0.3%的H2O2溶液，200 μ L對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠，用透射電鏡圖觀察雙酚A與對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠的反應(yīng)，雙酚A與對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠反應(yīng)的透射電鏡圖如圖2所示，由圖2可知，雙酚A在辣根過氧化物酶和H2O2共同存在的作用下，與對(duì)巰基苯酚修飾納米金發(fā)生了相互作用，使得對(duì)巰基苯酚修飾納米發(fā)生了聚集，對(duì)巰基苯酚修飾納米對(duì)雙酚A具有信號(hào)響應(yīng)。
[0036]實(shí)施例2
[0037]I)對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠的制備:
[0038]將lmL20 μ M對(duì)巰基苯酚溶液加入到IOOmLlOnM納米金粒徑為13nm的納米金溶液中，混合均勻后，錫箔包被慢搖2小時(shí)，即得對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠；
[0039]2)建立雙酚A的標(biāo)準(zhǔn)曲線:
[0040]①在酶標(biāo)儀微孔板的7個(gè)孔中分別加入40μ L3.125mg/L、6.25mg/L、12.5mg/L、25mg/L、50mg/L、lOOmg/L和200mg/L雙酚A溶液，再分別加入5 μ L3 μ M辣根過氧化物酶溶液，5 μ L體積百分比濃度為0.3%Η202溶液和200 μ L對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠，作為7個(gè)實(shí)驗(yàn)組，在另一個(gè)微孔板的一個(gè)孔中，加入40 μ L水,5 μ L3 μ M辣根過氧化物酶溶液,5 μ L體積百分比濃度為0.3%Η202溶液和200 μ L對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠，作為陰性對(duì)照組，37°C孵育至各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比有明顯色差后，檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中含已知濃度的雙酚A的對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠在波長(zhǎng)為520nm和720nm處的光密度；
[0041]②不同已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)雙酚A溶液的檢測(cè)結(jié)果如圖2所示，以720nm和520nm處光密度的比值為縱坐標(biāo)，以2為底雙酚A濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，根據(jù)各實(shí)驗(yàn)組測(cè)得的數(shù)據(jù)繪圖，擬合后得到雙酚A`的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)關(guān)系為:y=0.0784x+0.22，R2=0.9921，其中，y為對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠在波長(zhǎng)為520nm和720nm處的光密度的比值，x為以2為底雙酚A濃度的對(duì)數(shù)，0.0784為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，0.22為標(biāo)準(zhǔn)曲線與y軸的截距，雙酚A濃度的線性范圍為0.5~32mg/L，線性良好，可用于雙酚A的定量分析，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。
[0042]3)實(shí)際樣品的測(cè)試
[0043]I〇在酶標(biāo)儀微孔板的一個(gè)孔中先加入40 μ L實(shí)際雙酹A樣品,5 μ L3 μ M辣根過氧化物酶溶液，5 μ L體積百分比濃度為0.3%Η202溶液和200 μ L對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠，檢測(cè)含實(shí)際雙酚A樣品的對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠在720nm和520nm處的光密度，將720nm和520nm處光密度的比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)關(guān)系式的y值中，計(jì)算出x值，x值即為實(shí)際雙酚A樣品的濃度。
[0044]實(shí)施例3
[0045]I)對(duì)巰基苯酹修飾納米金溶膠的制備:
[0046]將4組ImL0.05 μ MU μ MUO μ Μ、100 μ M對(duì)巰基苯酚溶液分別加入到4組100mLlnM、5nM、10nM和20nM納米金粒徑為13nm的納米金溶液中，攪拌均勻后，錫箔包被慢搖2小時(shí)，即得4組對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠；[0047]2)按對(duì)巰基苯酚與納米金的不同摩爾比制備的對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠對(duì)雙酚A的響應(yīng):
[0048]在酶標(biāo)儀微孔板的4個(gè)孔中分別加入40 μ L200mg/L雙酚A溶液，5 μ L3 μ M辣根過氧化物酶溶液，5 μ L體積百分濃度為0.3%的H2O2溶液，再分別加入200 μ L步驟I)中制備的4組對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠，作為4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，在另一個(gè)微孔板的一個(gè)孔中，加入40 μ L200mg/L雙酚A溶液，5 μ L3 μ M辣根過氧化物酶溶液，5 μ L體積百分比濃度為0.3%的Η202溶液，再加入200 μ L /K，作為空白對(duì)照組，370C孵育5?30分鐘，檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠在波長(zhǎng)為520nm和720nm處的光密度；
[0049]檢測(cè)的結(jié)果顯示，按對(duì)巰基苯酚與納米金的不同摩爾比制備的對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠對(duì)雙酚A均有良好響應(yīng)，且720nm與520nm處光密度的比值遠(yuǎn)大于空白對(duì)照組。實(shí)施例4
[0050]I)對(duì)巰基苯酹修飾納米金溶膠的制備:
[0051]將lmL20 μ M對(duì)巰基苯酚溶液加入到IOOmLlOnM納米金粒徑為13nm的納米金溶液中，混合均勻后，錫箔包被慢搖2小時(shí)，即得對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠；
[0052]2)不同濃度的辣根過氧化物酶溶液對(duì)雙酚A的響應(yīng):
[0053]在酶標(biāo)儀微孔板的5個(gè)孔中分別加入40μ L200mg/L雙酚A溶液，5μ L體積百分濃度0.3%Η202溶液，然后分別加入5 μ L0.01 μ Μ、0.1 μ Μ、I μ Μ、10 μ Μ、100 μ M辣根過氧化物酶溶液，再分別加入200 μ L對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠，作為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，在另一個(gè)微孔板的一個(gè)孔中，加入40 μ L200mg/L雙酚A溶液，5 μ L體積百分比濃度0.3%Η202溶液，5 μ L水和200 μ L對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠，作為空白對(duì)照組，37°C孵育2-180分，辣根過氧化物酶加入的則量多孵育時(shí)間短，加入的量少則孵育時(shí)間長(zhǎng)，檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠在波長(zhǎng)為520nm和720nm處的光密度；
[0054]檢測(cè)的結(jié)果顯示，不同濃度的辣根過氧化物酶溶液對(duì)雙酚A均有良好的響應(yīng)，且720nm與520nm處光密度的比值遠(yuǎn)大于空白對(duì)照組。
[0055]實(shí)施例5
[0056]將4組lmL20 μ M對(duì)巰基苯酚溶液分別加入到100mL5nM納米金粒徑分別為5nm、13nm、30nm、50nm的納米金溶液中，混合均勻后,得到4組對(duì)巰基苯酹修飾納米金溶膠；
[0057]2)不同粒徑的納米金溶液制備的對(duì)巰基苯酹修飾納米金溶膠對(duì)雙酹A的響應(yīng):
[0058]在酶標(biāo)儀微孔板的4個(gè)孔中分別加入40 μ L200mg/L雙酚A溶液，5 μ L體積百分濃度0.3%Η202溶液，5 μ L3 μ M辣根過氧化物酶溶液，再分別加入200 μ L步驟I)中制備的四組對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠，作為四個(gè)實(shí)驗(yàn)組，在另一個(gè)微孔板的一個(gè)孔中，加入40 μ L200mg/L雙酚A溶液，5 μ L體積百分濃度0.3%Η202溶液，5 μ L3 μ M辣根過氧化物酶溶液和200 μ L水作為空白對(duì)照組，IO0C孵育5?30分鐘，檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠在波長(zhǎng)為520nm和720nm處的光密度；
[0059]檢測(cè)的結(jié)果顯示，不同粒徑的納米金溶液制備的對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠對(duì)雙酚A均有良好的響應(yīng)，且720nm與520nm處光密度的比值遠(yuǎn)大于空白對(duì)照組。
[0060]實(shí)施例6
[0061]I)對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠的制備:
[0062]將lmL20 μ M對(duì)巰基苯酚溶液加入到IOOmLlOnM納米金粒徑為13nm的納米金溶液中，混合均勻后，錫箔包被慢搖2小時(shí)，即得對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠；
[0063]2)不同濃度的H2O2溶液對(duì)雙酚A的響應(yīng):
[0064]在酶標(biāo)儀微孔板的5個(gè)孔中分別加入40 μ L200mg/L雙酚A溶液，5 μ L3 μ M辣根過氧化物酶溶液，然后分別加入5 μ L體積百分濃度0.003%,0.03%,0.3%、3%、30%Η202溶液，再分別加入200 μ L對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠，作為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，在另一個(gè)微孔板的一個(gè)孔中，加入40 μ L200mg/L雙酚A溶液，5 μ L3 μ M辣根過氧化物酶溶液，5 μ L水和200 μ L對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠，作為空白對(duì)照組，37°C孵育2?180分，檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠在波長(zhǎng)為520nm和720nm處的光密度，H2O2加入的量多則孵育時(shí)間短，H2O2加入的量少則孵育時(shí)間長(zhǎng)；
[0065]檢測(cè)的結(jié)果顯示，不同濃度的H2O2溶液對(duì)雙酚A均有良好的響應(yīng)，且720nm與520nm處光密度的比值遠(yuǎn)大于空白對(duì)照組。
[0066]實(shí)施例7
[0067]I)對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠的制備:
[0068]將lmL20 μ M對(duì)巰基苯酚溶液加入到IOOmLlOnM納米金粒徑為13nm的納米金溶液中，混合均勻后，錫箔包被慢搖2小時(shí)，即得對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠；
[0069]2)不同濃度的氯化血紅素溶液對(duì)雙酚A的響應(yīng):
[0070]在酶標(biāo)儀微孔板的5個(gè)孔中分別加入40 μ L200mg/L雙酚A溶液，5 μ L體積百分濃度0.3%Η202溶液，然后分別加入5 μ L0.01 μ Μ、0.1 μ MU μ MUO μ MUOO μ M氯化血紅素溶液，再分別加入200 μ L對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠，作為5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，在另一個(gè)微孔板的一個(gè)孔中，加入40 μ L200mg/L雙酹A溶液,5 μ L體積百分濃度0.3%Η202溶液,5 μ L水和200 μ L對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠，作為空白對(duì)照組，42°C孵育至實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組相比有明顯色差后，檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠在波長(zhǎng)為520nm和720nm處的光密度，
[0071]檢測(cè)的結(jié)果顯示，不同濃度的氯化血紅素溶液對(duì)雙酚A均有良好的響應(yīng)，且720nm與520nm處光密度的比值遠(yuǎn)大于空白對(duì)照組。
【權(quán)利要求】
1.一種對(duì)巰基苯酚修飾納米金檢測(cè)雙酚A的方法，其特征在于:將對(duì)巰基苯酚溶液加入到納米金溶液中，避光反應(yīng)至得到對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠，以已知濃度的雙酚A溶液為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠為檢測(cè)物，在過氧化物酶或過氧化物模擬酶，與H2O2共同存在的條件下，對(duì)巰基苯酚修飾納米金發(fā)生聚集，檢測(cè)含不同已知濃度的雙酚A溶液的對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠在720nm和520nm處的光密度，以720nm和520nm處光密度的比值為縱坐標(biāo)，以2為底雙酚A濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，根據(jù)檢測(cè)的數(shù)據(jù)繪圖，擬合后得到雙酚A的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)關(guān)系式y(tǒng)=kx+b，以實(shí)際雙酚A樣品為被檢測(cè)物，對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠為檢測(cè)物，在過氧化物酶或過氧化物模擬酶，與H2O2共同存在的條件下，對(duì)巰基苯酚修飾納米金發(fā)生聚集，檢測(cè)含實(shí)際雙酚A樣品的對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠在720nm和520nm處的光密度，將720nm和520nm處光密度的比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)關(guān)系式的y值中，計(jì)算出X值，再根據(jù)X值計(jì)算出實(shí)際雙酚A樣品的濃度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的對(duì)巰基苯酚修飾納米金檢測(cè)雙酚A的方法，其特征在于包括如下步驟: O對(duì)巰基苯酹修飾納米金溶膠的制備: ①按摩爾比對(duì)巰基苯酚:納米金=0.1:1~100:1，將對(duì)巰基苯酚溶液加入濃度為I~20nM的納米金溶液中至對(duì)巰基苯酚溶液的終濃度為0.1nM~2 μ Μ，混合均勻后，避光反應(yīng)至得到對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠； 2)建立雙酚A的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線: ①在酶標(biāo)儀微孔板的7個(gè)以上的孔中分別加入7組以上的相同體積、不同已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)雙酚A溶液，再分別加入催化量的過氧化物酶溶液或過氧化物模擬酶溶液，過量的H2O2溶液和過量的對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠，作為7個(gè)以上的實(shí)驗(yàn)組，其中7個(gè)以上的實(shí)驗(yàn)組中加入的過氧化物酶溶液或過氧化物模擬酶溶液，H2O2溶液和對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠完全相同，在另一個(gè)微孔板的一個(gè)孔中，加入`與各實(shí)驗(yàn)組中雙酚A溶液等體積的水，再加入與各實(shí)驗(yàn)組相同的過氧化物酶溶液或過氧化物模擬酶溶液，H2O2溶液和對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠，作為陰性對(duì)照組，10~42°C孵育至各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比有色差后，檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組中含已知濃度的雙酚A的對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠在波長(zhǎng)為520nm和720nm處的光密度； ②以720nm和520nm處光密度的比值為縱坐標(biāo)，以2為底雙酚A濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，根據(jù)各實(shí)驗(yàn)組檢測(cè)的數(shù)據(jù)繪圖，擬合后得到雙酚A的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)關(guān)系式y(tǒng)=kx+b ； 3)實(shí)際雙酚A樣品濃度的測(cè)定: ①在酶標(biāo)儀微孔板的一個(gè)孔中先加入與步驟2)中各實(shí)驗(yàn)組中雙酚A溶液等體積的實(shí)際雙酚A樣品，再加入與步驟2)中各實(shí)驗(yàn)組相同的過氧化物酶溶液或過氧化物模擬酶溶液，H2O2溶液和對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠，10~42°C孵育至出現(xiàn)色差后，檢測(cè)含實(shí)際雙酚A樣品的對(duì)巰基苯酚修飾納米金溶膠在720nm和520nm處的光密度，將720nm和520nm處光密度的比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)關(guān)系式的y值中，計(jì)算出X值，再根據(jù)X值計(jì)算出實(shí)際雙酚A樣品的濃度。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述對(duì)巰基苯酚修飾納米金檢測(cè)雙酚A的方法，其特征在于: 所述納米金溶液中納米金的粒徑為5-50nm。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述對(duì)巰基苯酚修飾納米金檢測(cè)雙酚A的方法，其特征在于:所述過氧化物酶為辣根過氧化物酶，過氧化物模擬酶為氯化血紅素。
5.根據(jù)權(quán)利要求5所述對(duì)巰基苯酚修飾納米金檢測(cè)雙酚A的方法，其特征在于:所述辣根過氧化物酶或過氧化物模擬酶的終濃度為0.2ηΜ-2 μ M0
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述對(duì)巰基苯酚修飾納米金檢測(cè)雙酚A的方法，其特征在于:所述Η202溶液的終濃度為0.00·006%-0.6%，該濃度為體積百分比濃度。
【文檔編號(hào)】G01N21/31GK103852432SQ201410111567
【公開日】2014年6月11日 申請(qǐng)日期:2014年3月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月24日
【發(fā)明者】梁曉聲, 熊海容, 王海英, 郭小華, 汪文俊 申請(qǐng)人:中南民族大學(xué)