脂肪氧化酶酶活性的準確定量檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種脂肪氧化酶酶活性的準確定量檢測方法，其中，將酶活檢測體系在235nm波長處在指定時間T內測定其光程長PL和透光率Vmax；根據(jù)公式A=Vmax/T/PL/Conc./V計算出脂肪氧化酶酶活性，其中，A表示脂肪氧化酶酶活性，Conc.表示所測定的脂肪氧化酶酶產(chǎn)品溶液的稀釋倍數(shù)，V表示加入到所述酶活檢測體系中的所述脂肪氧化酶酶產(chǎn)品溶液的體積；所述酶活檢測體系包含pH9.0的硼酸緩沖液、亞油酸溶液以及含脂肪氧化酶的酶產(chǎn)品溶液。本發(fā)明脂肪氧化酶酶活性的準確定量檢測方法操作簡便、靈敏度高、不易受干擾的、結果精確，適合在生產(chǎn)實際中應用。
【專利說明】脂肪氧化酶酶活性的準確定量檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種酶學檢測【技術領域】，尤其涉及一種脂肪氧化酶酶活性的準確定量檢測方法。
【背景技術】
[0002]在制備食品的小麥面粉中，由于小麥產(chǎn)地和品種不同等因素，造成小麥面粉的品質差異很大，通常需要加入面粉改良劑來增強面團的彈性和韌性，并且改良面團的流變學特性，以使制得的面制食品紋理均勻、規(guī)整、平滑、色澤潔白、富于彈性且口感細膩。
[0003]傳統(tǒng)的面粉改良劑，是以化學添加劑為主。隨著人們生活水平的日益提高，食品安全以及健康飲食越來越受到重視。因此，對食品原材料和添加劑的要求和監(jiān)控越來越嚴格。使用安全的生物酶制劑替代傳統(tǒng)的化學制劑已經(jīng)成為了食品行業(yè)的一大趨勢。為了迎合這一行業(yè)趨勢，并和國際水平同步，研發(fā)了脂肪氧化酶系列產(chǎn)品。此系列產(chǎn)品可以良好地增大面團體積，并對面團有一定的漂白功能，受到了用戶的廣泛期待。
[0004]生物酶產(chǎn)品的重要質量指標之一，是酶產(chǎn)品的酶活性。準確的定量測量酶產(chǎn)品活性的大小，對生物酶的生產(chǎn)和銷售都用重要意義。
[0005]《無錫輕工大學學報》(2001.01-0077-04)報道了三種測定脂肪氧化酶的方法，分別為量壓法，分光光度法和KI2淀粉法。
[0006]1.量壓法
[0007]由于脂肪氧化酶的作用，底物亞油酸可以與氧結合，形成過氧化物。量壓法正是利用這一原理，通過測定密閉體系內的氧氣量減少，間接測定脂肪氧化酶產(chǎn)品的活性。
[0008]這種測定方法，對脂肪氧化酶樣品的粗拙程度沒有要求，適合較為初級的樣品測定，但操作步驟較為復雜，不能適應連續(xù)的樣品測定的要求，而且由于測量時需要不斷震動，可能影響酶活力，對微量的酶活性監(jiān)測不夠準確，靈敏度差。
[0009]2.分光光度法
[0010]脂肪氧化酶催化底物亞油酸的過程中，會產(chǎn)生具有共軛二烯鍵的中間體。共軛二烯鍵的一個特點是可以吸收234nm光波。因此通過測定234nm光波，可以間接推算酶活力。分光光度法就是根據(jù)這一原理，測定共軛二烯鍵的濃度，從而測定酶活性的大小。
[0011]這種方法的優(yōu)勢是可以連續(xù)多樣品測定，但對儀器要求較高，且由于是測定紫外光波，因此對樣品中的雜質較為敏感，因此只適合于較為純凈的酶樣品測定，不適合應用于實際生產(chǎn)中較粗樣品的測定。且由于是直接測定的中間體，具有不穩(wěn)定性，因此隨時間變化，分光光度值也在不斷變化。因為靈敏度低，不適合酶活性較低的樣品。
[0012]3.KI2 淀粉法
[0013]脂肪氧化酶催化亞油酸形成過氧化物，過氧化物可以將碘離子氧化還原為碘，而碘可以與淀粉結合并顯色。根據(jù)這一原理，可以間接測定脂肪氧化酶活性，既為KI2法。
[0014]與分光光度法相似，這種方法受到雜質和時間影響較大。而且由于在酸性條件下顯色，酶樣品中的蛋白質和脂肪等雜質也可能在酸性條件下絮凝，影響觀測和結果的可靠性。因此這種方法也無法適應生產(chǎn)條件下復雜的酶樣品條件。
[0015]上述三種方法各有局限性，不能滿足實際生產(chǎn)中的快速準確的測定需要，大大限制了它們的應用。

【發(fā)明內容】

[0016]本發(fā)明的目的是，為克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種操作簡便、靈敏度高、不易受干擾的、結果精確的適合在輕工食品工業(yè)生產(chǎn)過程中實現(xiàn)對面粉烘培酶——脂肪氧化酶酶活性的準確定量檢測方法。
[0017]I單位脂肪氧化酶活力的定義為:在25°C下，pH9.0環(huán)境中，脂肪氧化酶在3.0ml亞油酸溶液中以Icm光照距離，光度值在234nm光波上每分鐘改變0.001所需的酶活力。
[0018]為達到以上技術目的，本發(fā)明采用的技術方案如下:
[0019]一種脂肪氧化酶酶活性的準確定量檢測方法，其中，將酶活檢測體系在235nm波長處在指定時間T內測定其光程長PL和透光率Vmax ;根據(jù)公式A=Vmax/T/PL/C0nc./V計算出脂肪氧化酶酶活性，其中，A表示脂肪氧化酶酶活性，Conc.表示所測定的脂肪氧化酶酶產(chǎn)品溶液的稀釋倍數(shù)，V表示加入到所述酶活檢測體系中的所述脂肪氧化酶酶產(chǎn)品溶液的體積；所述酶活檢測體系包含PH9.0的硼酸緩沖液、亞油酸溶液以及含脂肪氧化酶的酶產(chǎn)品溶液。
[0020]關于試劑的濃度:所述硼酸緩沖液的濃度為0.1M。所述亞油酸溶液的濃度為25mM。
[0021]其中，所述亞油酸溶液為亞麻酸和水的乳化液。具體地，所述乳化液通過適量的亞麻酸與一定量的水充分攪拌成乳狀液得到。
[0022]關于酶產(chǎn)品溶液:所述酶產(chǎn)品溶液為溶解在酶樣品緩沖液中的脂肪氧化酶提取物，所述酶樣品緩沖液包含7.88g/l的三羥甲基氨基甲烷、8.766g/l的氯化鈉和100g/l的甘油。
[0023]進一步地，所述酶活檢測體系中所述硼酸緩沖液、亞油酸溶液和酶產(chǎn)品溶液的混合體積比為89:1 =IO0
[0024]優(yōu)選地，使用96孔板作為所述酶活檢測體系的反應容器。
[0025]關于測量方法:所述測量的指定時間T為lOmin，每30s測量一次。
[0026]與現(xiàn)有技術相比較，本發(fā)明具有如下優(yōu)勢:
[0027]a)本發(fā)明所提供的檢測方法，根據(jù)脂肪氧化酶的酶動力學特性，確立了反應終產(chǎn)物的透光率和反應時間的線性關系，并據(jù)此對脂肪氧化酶酶活性進行定量計算；該方法對比現(xiàn)有技術，測量更可靠，方法更精確。
[0028]b)本發(fā)明所提供的檢測方法，根據(jù)上述的脂肪氧化酶酶學特性，推導出了脂肪氧化酶活性的定量計算公式，使用這一公式，可以得到酶活力的標準化結果；并且，公式中的變量均使用國際單位，可以與現(xiàn)有技術得出的結果作橫向比較。
[0029]本發(fā)明所提供的檢測方法，應用96孔板以及孔板檢測儀對脂肪氧化酶活性進行量化測定，可以一次性對多個樣品進行測量，大大提高了監(jiān)測效率。
【專利附圖】

【附圖說明】[0030]圖1為采用本發(fā)明脂肪氧化酶酶活性的準確定量檢測方法測定大豆脂肪氧化酶提取液的酶動力學變化結果圖。
[0031]圖2為ClO樣品孔中的大豆脂肪氧化酶提取液的酶動力學變化結果圖。
[0032]圖3為A?GlO和A?G12樣品孔中大豆脂肪氧化酶提取液的檢測結果和酶活計
晳奸里
【具體實施方式】
[0033]以下結合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步詳細描述。
[0034]檢測大豆脂肪氧化酶的提取液中脂肪氧化酶的酶活性，步驟如下:
[0035]( I)酶活檢測體系的準備
[0036]I)配制0.1M ρΗ9.0的硼酸緩沖液:將38g四硼酸鈉溶于IL的水中，得到0.1M的硼酸鈉溶液；將6.2g硼酸溶于IL的水中，得到0.1M的硼酸溶液。將所述硼酸鈉溶液與硼酸溶液混合，將PH調整至9.0，得到0.1M的硼酸緩沖液。
[0037]2)配制25mM亞油酸溶液:將155 μ I (140mg)亞麻酸溶解到5ml水溶液中，充分攪拌使得溶液完全乳化成乳狀液，用20ml的容量瓶加水定容至20ml ;將配好的所述溶液分成Iml小份，在_20°C保存。
[0038]3)配制酶產(chǎn)品溶液:
[0039]a.酶樣品緩沖液的配制:將7.88g三羥甲基氨基甲烷(Tris)、8.766g氯化鈉(NaCl)和IOOg甘油(glycerol)溶解在水中，然后用IL的容量瓶加水定容至1L。
[0040]b.大豆脂肪氧化酶提取液的制備:
[0041]-將大豆浸泡過夜。
[0042]-將泡過的大豆用手持破碎機(KitchenAid雙速手持破碎機)打碎，并使用8英尺不銹鋼濾網(wǎng)(Good Cook濾網(wǎng))進行過濾，濾液補充所述酶樣品緩沖液至大豆干重的5倍，得粗提液。
[0043]-將所述粗提液用離心機(HeckmanJ2-HS)在10，500g離心力下離心20min,取上清液，得到大豆脂肪氧化酶提取液。
[0044](2)儀器參數(shù)的設定
[0045]使用Molecular Devices, SpectraMaxl90UV孔板測量儀,測量數(shù)據(jù)設定如下:
[0046]波長:235nm，
[0047]溫度:室溫，
[0048]光程長(pathlength):開啟檢查，
[0049]測量方式:每30s測量一次,測量IOmin (T),
[0050]最大OD 值:3.0
[0051](3)檢測步驟
[0052]I)將所述大豆脂肪氧化酶提取液分別稀釋2、4、8、16、32、64、128倍(Cone.)，分別放入96孔板A?G行的樣品孔中，每孔20 μ I (V)；
[0053]2)在96孔板的H行加入20 μ I /K，作為空白對照；
[0054]3)預留96孔板的第12列作為不加酶產(chǎn)品溶液的空白對照；
[0055]4)每個樣品孔再加入2 μ I亞油酸溶液和178 μ I硼酸緩沖液；[0056]5)迅速將載有所述酶活檢測體系的96孔板放入所述UV孔板測量儀中，開始測量，記錄光程長(PL)和透光率(Vmax)。
[0057](4)檢測結果與計算
[0058]圖1顯示了不同稀釋濃度的所述大豆脂肪氧化酶提取液的酶動力學變化結果，圖中每個方格與96孔板中編號相同的樣品孔相對應，方格內的曲線為指定時間T內該樣品孔中的酶活檢測體系的透光率的連續(xù)的變化曲線，曲線下的數(shù)字為所在曲線的擬合直線的斜率。圖中 A10、B10、C10、D10、E10、F10、G10 分別為含有稀釋了 2、4、8、16、32、64、128 倍的大豆脂肪氧化酶提取液，H10、A12、B12、C12、D12、E12、F12、G12、H12均為空白對照。
[0059]根據(jù)本發(fā)明的檢測原理，需要選取透光率和反應時間線性關系最好的一組作為計算基準，即需要選取變化曲線與其自身擬合直線最接近的一組。如圖2所示，本實施例中ClO為線性關系最佳的一組，下面以ClO的數(shù)據(jù)(參考圖3)為基準計算本實施例中大豆脂肪氧化酶提取液的酶活性:
[0060]脂肪氧化酶酶活性A=Vmax/T/PL/Conc./V，其中 Vmax/T/PL=520.668 (mAu/min),Cone.=0.125, V=0.02 (ml )，因此 Α=208267.0 (mAu/min/ml )。
[0061]綜上所述，本發(fā)明脂肪氧化酶酶活性的準確定量檢測方法操作簡便、靈敏度高、不易受干擾的、結果精確，適合在生產(chǎn)實際中應用。
[0062]上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但并不僅僅受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，均包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【權利要求】
1.一種脂肪氧化酶酶活性的準確定量檢測方法，其特征在于:將酶活檢測體系在235nm波長處在指定時間T內測定其光程長PL和透光率Vmax ； 根據(jù)公式A=Vmax/T/PL/C0nc./V計算出脂肪氧化酶酶活性，其中，A表示脂肪氧化酶酶活性，Conc.表示所測定的脂肪氧化酶酶產(chǎn)品溶液的稀釋倍數(shù)，V表示加入到所述酶活檢測體系中的所述脂肪氧化酶酶產(chǎn)品溶液的體積； 所述酶活檢測體系包含PH9.0的硼酸緩沖液、亞油酸溶液以及含脂肪氧化酶的酶產(chǎn)品溶液。
2.如權利要求1所述的脂肪氧化酶酶活性的準確定量檢測方法，其特征在于:所述硼酸緩沖液的濃度為0.1M。
3.如權利要求1所述的脂肪氧化酶酶活性的準確定量檢測方法，其特征在于:所述亞油酸溶液的濃度為25mM。
4.如權利要求3所述的脂肪氧化酶酶活性的準確定量檢測方法，其特征在于:所述亞油酸溶液為亞麻酸和水的乳化液。
5.如權利要求4所述的脂肪氧化酶酶活性的準確定量檢測方法，其特征在于:所述乳化液通過適量的亞麻酸與一定量的水充分攪拌成乳狀液得到。
6.如權利要求1所述的脂肪氧化酶酶活性的準確定量檢測方法，其特征在于:所述酶產(chǎn)品溶液為溶解在酶樣品緩沖液中的脂肪氧化酶提取物，所述酶樣品緩沖液包含7.88g/l的三羥甲基氨基甲烷、8.766g/l的氯化鈉和100g/l的甘油。
7.如權利要求2?6任意一項所述的脂肪氧化酶酶活性的準確定量檢測方法，其特征在于:所述酶活檢測體系中所述硼酸緩沖液、亞油酸溶液和酶產(chǎn)品溶液的混合體積比為89:1:10o
8.如權利要求7所述的脂肪氧化酶酶活性的準確定量檢測方法，其特征在于:使用96孔板作為所述酶活檢測體系的反應容器。
9.如權利要求8所述的脂肪氧化酶酶活性的準確定量檢測方法，其特征在于:所述測量的指定時間T為lOmin，每30s測量一次。
【文檔編號】G01N21/77GK103913450SQ201410107936
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年3月21日 優(yōu)先權日:2014年3月21日
【發(fā)明者】劉高峰 申請人:中山市南方新元食品生物工程有限公司