一種同時檢測人體血漿中多種氨基酸含量的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種同時檢測人體血漿中多種氨基酸含量的方法，所述檢測方法包括以下步驟：①采取人體血漿，并將血漿用甲醇進行脫蛋白，得到含有多種氨基酸的上清液；②將所得到的含有多種氨基酸的上清液與衍生化試劑進行衍生化反應，生成有紫外吸收的衍生化產(chǎn)物；③對衍生化產(chǎn)物采用高效液相法進行分析。該檢測方法操作簡單，可同時檢測出人體血液中所含的多種氨基酸，具有高準確度和高靈敏度。
【專利說明】一種同時檢測人體血漿中多種氨基酸含量的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及化學分析檢測領域，尤其是一種操作簡單、檢測成本低、具有高度準確性和高度靈敏的檢測方法，具體涉及一種同時檢測人體血漿中多種氨基酸含量的方法。
【背景技術】
[0002]氨基酸是構成生物體蛋白質并同生命活動有關的最基本的物質，是在生物體內構成蛋白質分子的基本單位，與生物的生命活動有著密切的關系。它在抗體內具有特殊的生理功能，是生物體內不可缺少的營養(yǎng)成分之一。構成人體的最基本的物質，有蛋白質、脂類、碳水化合物、無機鹽、維生素、水和食物纖維等。作為構成蛋白質分子的基本單位的氨基酸，無疑是構成人體最基本物質之一。
[0003]蛋白質在機體內的消化和吸收式通過氨基酸來完成的:作為機體內第一營養(yǎng)要素的蛋白質，它在食物營養(yǎng)中的作用是顯而易見的，它在人體內并不能直接被利用，而是通過變成氨基酸小分子被利用。
[0004]生命的產(chǎn)生、存在和消亡，無一不與蛋白質有關，正如恩格斯所說:“蛋白質是生命的物質基礎，生命是蛋白質存在的一種形式。”如果人體內缺少蛋白質，輕者體質下降，發(fā)育遲緩，抵抗力減弱，貧血乏力，重者形成水腫，甚至危及生命。一旦失去了蛋白質，生命也就不復存在，故有人稱蛋白質為“生命的載體”?？梢哉f，它是生命的第一要素。
[0005]蛋白質的基本單位是氨基酸。如果人體缺乏任何一種必需氨基酸，就可導致生理功能異常，影響機體代謝的正常進行，最后導致疾病。同樣，如果人體內缺乏某些非必需氨基酸，會產(chǎn)生機體代謝障礙。精氨酸和瓜氨酸對形成尿素十分重要；胱氨酸攝入不足就會引起胰島素減少，血糖升高。又如創(chuàng)傷后胱氨酸和精氨酸的需要量大增，如缺乏，即使熱能充足仍不能順利合成蛋白質?？傊?，氨基酸在人體內通過代謝可以發(fā)揮下列一些作用:①合成組織蛋白質變成酸、激素、抗體、肌酸等含氨物質；③轉變?yōu)樘妓衔锖椭?；④氧化成二氧化碳和水及尿素，產(chǎn)生能量。因此，氨基酸在人體中的存在，不僅提供了合成蛋白質的重要原料，而且對于促進生長，進行正常代謝、維持生命提供了物質基礎。如果人體缺乏或減少其中某一種，人體的正常生命代謝就會受到障礙，甚至導致各種疾病的發(fā)生或生命活動終止。由此可見，氨基酸在人體生命活動中顯得多么需要。
[0006]目前國內外使用的檢測方法有電化學法、分光光度法、高效液相色譜法、毛細管電泳法及氣相色譜法等。高效液相色譜法是目前使用最為普遍的方法，而高效液相色譜法中的離子交換法和反相色譜法又是應用最廣泛的兩種。但目前的方法大多比較操作復雜。

【發(fā)明內容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種同時檢測人體血漿中多種氨基酸含量的方法，該檢測方法操作簡單，可同時檢測人體血漿中可能出現(xiàn)的24種氨基酸中的任意一種或幾種或全部，具有高準確度和高靈敏度。
[0008]本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn):[0009]一種同時檢測人體血漿中多種氨基酸含量的方法，所述多種氨基酸分別為:天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、瓜氨酸、牛磺酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、氯化銨、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、鳥氨酸以及賴氨酸中的一種或幾種或全部；所述方法包括以下步驟:①采取人體血漿，并將血漿用甲醇進行脫蛋白，得到含有多種氨基酸的上清液；②將所得到的含有多種氨基酸的上清液與衍生化試劑進行衍生化反應，生成有紫外吸收的衍生化產(chǎn)物；③對衍生化產(chǎn)物采用高效液相法進行分析。
[0010]進一步地，步驟①中脫蛋白的具體過程為:取人體血漿樣品置于離心管中，加入甲醇，震蕩混勻，再用12000r/m的轉速離心5min，并取上清液置于干凈的離心管中，該上清液即為步驟①所述的含有多種氨基酸的上清液。
[0011]進一步地，步驟②中衍生化反應的具體過程為:向所述的含有多種氨基酸的上清液中加入三乙胺溶液、異硫氰酸苯酯溶液和內標溶液，均勻混合，室溫下衍生lh，加入正己烷，漩渦混勻，靜置lOmin，取下層溶液過0.2μπι的濾膜，進樣分析，以色譜峰面積內標法定量。
[0012]進一步地，所述三乙胺溶液為三乙胺乙腈溶液，所述異硫氰酸苯酯溶液為異硫氰酸苯酯乙腈溶液,所述內標溶液為用0.lmol/L鹽酸將內標物溶解并稀釋為50ymol/L的內標溶液。
[0013]進一步地，所述內標物為正亮氨酸(Nle)。
[0014]進一步地，所述人體血漿樣品與所加甲醇的體積比為:1: 3。
[0015]進一步地，所述含有多種氨基酸的上清液、三乙胺乙腈溶液、異硫氰酸苯酯乙腈溶液以及內標溶液的體積比為:2:1:1:1。
[0016]進一步地，在用高效液相法進行分析中，所用流動相包括流動相A和流動相B ;流速 0.8mL/min ;檢測波長:254nm。
[0017]進一步地，所述流動相A為0.05%醋酸鈉溶液，所述醋酸鈉溶液是在醋酸鈉中加水，并用冰醋酸調PH至6.35，搖勻后用0.45 μ m的濾膜過濾，超聲脫氣10min_15min。
[0018]進一步地,所述流動相B為分析純的乙腈。
[0019]本發(fā)明提供了一種同時檢測人體血漿中多種氨基酸含量的方法，其主要具有的有益效果為:本發(fā)明所述的方法能夠同時檢測出血液中可能存在的24種氨基酸中的任何一種或幾種或全部，此方法操作簡單、具有高準確度和高靈敏度，在臨床上具有重要的應用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]下面根據(jù)附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。
[0021]圖1是本發(fā)明實施例所述的以0.lmol/L的鹽酸溶液作為陰性對照所得的高效液相色譜圖；
[0022]圖2是本發(fā)明實施例所述的含24種氨基酸的標準溶液的高效液相色譜圖；
[0023]圖3是本發(fā)明實施例所述的正常人體血漿液中24種氨基酸的高效液相色譜圖；
[0024]圖4是本發(fā)明實施例所述的苯丙氨酸異常者血漿中24種氨基酸的高效液相色譜圖；[0025]在圖1~4中:1、天冬氨酸(asp) ;2、谷氨酸(glu) ;3、天冬酰胺(asn) ;4、絲氨酸(ser) ;5、谷氨酰胺(Gln) ;6、甘氨酸(gly) ;7、組氨酸(his) ;8、瓜氨酸(cit) ;9、?；撬?tau) ;10、精氨酸(arg) ;11、蘇氨酸(thr) ;12、丙氨酸(ala) ;13、脯氨酸(pro) ;14、氯化銨(NH4C1) ;15、酪氨酸(tyr) ;16、繳氨酸(val) ;17、蛋氨酸(met) ;18、半胱氨酸(cys) ;19、異亮氨酸(ile) ;20、亮氨酸(Ieu) ;21、苯丙氨酸(phe) ;22、色氨酸(trp) ;23、鳥氨酸(orn)；24、賴氨酸(Iys) ο
【具體實施方式】
[0026]如圖1-4所示，本發(fā)明所述的所有24種氨基酸均指下述24種，且其分別對應附圖標記為:1、天冬氨酸(asp) ;2、谷氨酸(glu) ;3、天冬酰胺(asn) ;4、絲氨酸(ser) ;5、谷氨酰胺(Gln) ;6、甘氨酸(gly) ;7、組氨酸(his) ;8、瓜氨酸(cit) ;9、?；撬?tau) ;10、精氨酸(arg) ;11、蘇氨酸(thr) ;12、丙氨酸(ala) ;13、脯氨酸(pro) ;14、氯化銨(NH4C1) ;15、酪氨酸(tyr) ;16、纈氨酸(val) ;17、蛋氨酸(met) ;18、半胱氨酸(cys) ;19、異亮氨酸(ile)；20、亮氨酸(Ieu) ;21、正亮氨酸(Nle，為內標，不屬于本發(fā)明所述的24種氨基酸)；22、苯丙氨酸(phe) ;23、色氨酸(trp) ;24、鳥氨酸(orn) ;25、賴氨酸(Iys)。[0027]本發(fā)明所述的同時檢測人體血漿中多種氨基酸含量的方法具體包括以下步驟:①采取人體血漿，并將血漿用甲醇進行脫蛋白，即取人體血漿200 μ L的樣品置于1.5mL的離心管中，加入600 μ L的甲醇，震蕩混勻，再用12000r/m的轉速離心5min 取步驟a中所得上清取200 μ L置于另一離心管中，再加入三乙胺乙腈溶液、異硫氰酸苯酯乙腈溶液和內標各100 μ L，混勻3min，室溫下衍生Ih ;加入正己烷400 μ L，漩渦混勻，靜置lOmin，取下層溶液(即為所得的衍生化產(chǎn)物)；③對衍生化產(chǎn)物采用高效液相法進行進樣分析，以色譜峰面積內標法定量，其中，流動相包括流動相A和流動相B，流速0.8mL/min ;檢測波長:254nm ；所述流動相A是0.05%醋酸鈉溶液，用醋酸調PH至6.35，搖勻后用0.45 μ m的濾膜過濾，超聲脫氣10min-15min ;所述流動相B是分析純的乙腈。流動相A和流動相B的體積百分比與時間的對應關系可參見下表。
[0028]
【權利要求】
1.一種同時檢測人體血漿中多種氨基酸含量的方法，其特征在于:所述多種氨基酸分別為:天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、絲氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、瓜氨酸、牛磺酸、精氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、氯化銨、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、鳥氨酸以及賴氨酸中的一種或幾種；所述方法包括以下步驟: ①采取人體血漿，并將血漿用甲醇進行脫蛋白，得到含有多種氨基酸的上清液； ②將所得到的含有多種氨基酸的上清液與衍生化試劑進行衍生化反應，生成有紫外吸收的衍生化產(chǎn)物； ③對衍生化產(chǎn)物采用高效液相法進行分析。
2.根據(jù)權利要求1所述的同時檢測人體血漿中多種氨基酸含量的方法，其特征在于:步驟①中脫蛋白的具體過程為:取人體血漿樣品置于離心管中，加入甲醇，震蕩混勻，再用12000r/m的轉速離心5min，并取上清液置于干凈的離心管中，該上清液即為步驟①所述的含有多種氨基酸的上清液。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的同時檢測人體血漿中多種氨基酸含量的方法，其特征在于:步驟②中衍生化反應的具體過程為:向所述的含有多種氨基酸的上清液中加入三乙胺溶液、異硫氰酸苯酯溶液和內標溶液，均勻混合，室溫下衍生lh，加入正己烷，漩渦混勻，靜置lOmin，取下層溶液過0.2 μ m的濾膜，進樣分析，以色譜峰面積內標法定量。
4.根據(jù)權利要求3所述的同時檢測人體血漿中多種氨基酸含量的方法，其特征在于:所述三乙胺溶液為三乙胺乙腈溶液，所述異硫氰酸苯酯溶液為異硫氰酸苯酯乙腈溶液，所述內標溶液為用0.lmol/L鹽酸將內標物溶解并稀釋為50ymol/L的內標溶液。
5.根據(jù)權利要求4所述的同時檢測人體血漿中多種氨基酸含量的方法，其特征在于:所述內標物為正亮氨酸。
6.根據(jù)權利要求2所述的同時檢測人體血漿中多種氨基酸含量的方法，其特征在于:所述人體血漿樣品與所加甲醇的體積比為:1: 3。
7.根據(jù)權利要求4所述的同時檢測人體血漿中多種氨基酸含量的方法，其特征在于:所述含有多種氨基酸的上清液、三乙胺乙腈溶液、異硫氰酸苯酯乙腈溶液以及內標溶液的體積比為:2:1:1:1。
8.根據(jù)權利要求1所述的同時檢測人體血漿中多種氨基酸含量的方法，其特征在于:在用高效液相法進行分析中，所用流動相包括流動相A和流動相B ;流速0.8mL/min ;檢測波長:254nm。
9.根據(jù)權利要求8所述的同時檢測人體血漿中多種氨基酸含量的方法，其特征在于:所述流動相A為0.05%醋酸鈉溶液，所述醋酸鈉溶液是在醋酸鈉中加水，并用冰醋酸調PH至6.35,搖勻后用0.45 μ m的濾膜過濾,超聲脫氣10min_15min。
10.根據(jù)權利要求8所述的同時檢測人體血漿中多種氨基酸含量的方法，其特征在于:所述流動相B為分析純的乙腈。
【文檔編號】G01N30/02GK103837620SQ201410105963
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2014年3月21日 優(yōu)先權日:2014年3月21日
【發(fā)明者】徐立旭 申請人:上海碩源健標生物醫(yī)學科技有限公司