視黃醇結(jié)合蛋白(rbp)單域抗體編碼序列及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)的單域抗體的VHH鏈，包括框架區(qū)FR和互補(bǔ)決定區(qū)CDR，公開了框架區(qū)FR選自下組的FR的氨基酸序列和互補(bǔ)決定區(qū)CDR氨基酸序列，本發(fā)明還公開了兩種視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)單域抗體，還公開了兩種DNA分子，它編碼本發(fā)明所述的視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)的單域抗體的VHH鏈或本發(fā)明所述的視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)單域抗體，還公開了一種宿主細(xì)胞，它可以表達(dá)視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)的單域抗體。通過本發(fā)明所公布的單域抗體基因序列及宿主細(xì)胞，該單域抗體能夠在大腸桿菌內(nèi)高效表達(dá)，應(yīng)用于視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)檢測(cè)試劑的研發(fā)。
【專利說明】視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)單域抗體編碼序列及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)或生物制藥【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及針對(duì)于視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)的單域抗體。
【背景技術(shù)】
[0002]視黃醇結(jié)合蛋白是血液中維生素的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，由肝臟合成、廣泛分布于血液、腦脊液、尿液及其他體液中。測(cè)定視黃醇結(jié)合蛋白能早期發(fā)現(xiàn)腎小管的功能損害，并能靈敏反映腎近曲小管的損害程度，還可作為肝功能早期損害和監(jiān)護(hù)治療的指標(biāo)。
[0003]對(duì)于RBP的測(cè)定，現(xiàn)廣泛采用ELISA法；此法簡(jiǎn)便快速，而這種檢測(cè)方法是基于將視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)免疫綿羊獲得的抗體來實(shí)現(xiàn)的。但是這種傳統(tǒng)意義上的抗體穩(wěn)定性差、靈敏度低、生產(chǎn)成本高，所有因素均限制了對(duì)于視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)的檢測(cè)。1993年比利時(shí)科學(xué)家首次在Nature報(bào)道:在駱駝血液中的抗體，有一半沒有輕鏈，而且更讓人驚喜的是，這些缺失輕鏈的“重鏈抗體”能像正常抗體一樣與抗原等靶標(biāo)緊密結(jié)合，另外不像scFv那樣互相沾粘，甚至聚集成塊。這種抗體只包含一個(gè)重鏈可變區(qū)和兩個(gè)常規(guī)的CH2與CH3區(qū)，更重要的是單獨(dú)克隆并表達(dá)出來的VHH區(qū)具有很好的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性與抗原結(jié)合活性，分子量只是普通抗體的1/10，所以VHH也稱Nanobody (單域抗體);與此同時(shí)單域抗體化學(xué)性質(zhì)也更加靈活，穩(wěn)定性好，可溶性高，表達(dá)容易且利用微生物即可大量地獲得，容易偶聯(lián)其他分子，因此應(yīng)用單域抗體為研發(fā)視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)檢測(cè)試劑具有廣闊的前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]發(fā)明目的:本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供針對(duì)視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)的單域抗體，同時(shí)提供該單域抗體的編碼序列及該單域抗體在制備檢測(cè)的應(yīng)用。
[0005]技術(shù)方案:為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的第一方面，提供了一種視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)的單域抗體，包括框架區(qū)FR和互補(bǔ)決定區(qū)⑶R，所述框架區(qū)FR選自下組的FR的氨基酸序列中任意一種:SEQ ID NO:1所示的FRl，SEQ ID NO:2所示的FR2，SEQ ID NO:3所示的 FR3，SEQ ID NO:4 所示的 FR4 ;或 SEQ ID NO:5 所示的 FRl，SEQ ID NO:6 所示的 FR2，SEQ ID NO:7 所示的 FR3，SEQ ID NO:8 所示的 FR4 ；
[0006]所述互補(bǔ)決定區(qū)⑶R選自下組的⑶R的氨基酸序列中任意一種:
[0007]SEQ ID NO:9所示的 CDRl，SEQ ID NO: 10所示的 CDR2，SEQ ID NO: 11 所示的 CDR3 ;或 SEQ ID NO:12 所示的 CDRl，SEQ ID NO:13 所示的 CDR2，SEQ ID NO:14 所示的 CDR3 ；
[0008]優(yōu)選地，所述的視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)的單域抗體的VHH鏈，它具有SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
[0009]本發(fā)明第二方面，一種視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)單域抗體，它針對(duì)視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)表位的單域抗體，包括兩條具有SEQ ID N0:15和SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的VHH 鏈。
[0010]本發(fā)明第三方面，提供了一種DNA分子，它編碼選自下組的蛋白質(zhì):本發(fā)明所述的視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)的單域抗體的VHH鏈，或本發(fā)明所述的視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)單域抗體。
[0011]優(yōu)選地，所述的DNA分子，其特征在于，它具有選自下組的DNA序列:SEQ ID NO:17和 SEQ ID NO:18o
[0012]本發(fā)明的第四方面，提供了一種表達(dá)載體，它含SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18
[0013]所示的核苷酸序列。
[0014]本發(fā)明的第五方面，提供了一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體。
[0015]本發(fā)明的第六方面，提供了本發(fā)明所述的視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)單域抗體用于檢測(cè)視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)的用途。
[0016]有益效果:與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下:本發(fā)明將血液中提取的視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)免疫新疆雙峰駝，隨后利用該駱駝外周血淋巴細(xì)胞建立了針對(duì)于視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)的單域抗體基因庫(kù)，試驗(yàn)中將視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)偶聯(lián)在酶標(biāo)板上，以此形式的抗原利用噬菌體展示技術(shù)篩選免疫性的單域抗體基因庫(kù)(駱駝重鏈抗體噬菌體展示基因庫(kù))，從而獲得了針對(duì)視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)特異性的單域抗體基因，將此基因轉(zhuǎn)至大腸桿菌中，從而建立了能在大腸桿菌中高效表達(dá)的單域抗體株。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是單域抗體的基因電泳圖；其中泳道I是DNA分子標(biāo)準(zhǔn)，泳道2是PCR擴(kuò)增重鏈抗體可變區(qū)片段。
[0018]圖2是構(gòu)建單域抗體 的噬菌體展示文庫(kù)時(shí)，文庫(kù)庫(kù)容測(cè)定圖。
[0019]圖3是對(duì)于所構(gòu)建的視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)特異性的單域抗體文庫(kù)進(jìn)行的菌落PCR電泳圖；其中泳道I是DNA分子標(biāo)準(zhǔn)，泳道2-25是在所構(gòu)建的視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)單域抗體文庫(kù)中隨機(jī)的挑取克隆，通過菌落PCR檢測(cè)文庫(kù)的插入率，計(jì)算結(jié)果表明文庫(kù)插入率至100%。
[0020]圖4是用噬菌體的酶聯(lián)免疫方法(ELISA)篩選特異性單個(gè)陽性克隆的模式圖；其中I是將載脂蛋白偶聯(lián)在酶標(biāo)板上，2是單域抗體，3是鼠抗HA抗體，4是山羊抗小鼠堿性磷酸酶標(biāo)記的抗體，5是堿性磷酸酶顯色液。
[0021]圖5是表達(dá)的視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)單域抗體，經(jīng)鎳柱樹脂凝膠親和層析純化后的SDS-PAGE的電泳圖；其中泳道I是蛋白分子標(biāo)準(zhǔn)，泳道2、3是250毫摩爾咪唑洗脫液所洗脫下來的單域抗體。
[0022]圖6為視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)單域抗體檢測(cè)特異性分析的模式圖。
[0023]圖7為視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)單域抗體檢測(cè)特異性分析的模式圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024]本發(fā)明首先將人血液中提取的視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)免疫一只新疆單峰駝，經(jīng)過5次免疫之后提取該單峰駝外周血淋巴細(xì)胞并構(gòu)建了視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)特異的單域重鏈抗體文庫(kù)。將視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)偶聯(lián)在 NUNC酶標(biāo)板上，展示蛋白質(zhì)的正確空間結(jié)構(gòu)，使得視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)的抗原表位得以暴露出來，以此形式的抗原利用噬菌體展示技術(shù)篩選視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)免疫性的單域抗體基因庫(kù)(駱駝重鏈抗體噬菌體展示基因庫(kù))，而獲得了能在大腸桿菌中高效表達(dá)的單域抗體株。
[0025]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0026]實(shí)施例1:針對(duì)于視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)的單域抗體文庫(kù)的構(gòu)建:
[0027](I)由人血液中提取的視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)(購(gòu)自南京匯標(biāo)生物科技有限公司)，用于免疫所用的視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)的濃度為500 μ g/mL,每次免疫將0.5mg脂蛋白Al與弗氏佐劑等體積混合，免疫一只新疆單峰駝(句容圣龍家畜養(yǎng)殖廠)，每周一次，共免疫5次，除第一次使用完全的弗氏佐劑(購(gòu)自sigma)，剩余幾次全部使用弗式不全佐劑(購(gòu)自sigma),免疫過程中刺激B細(xì)胞表達(dá)抗原特異性的單域抗體。(2) 5次免疫結(jié)束后，提取駱駝外周血淋巴細(xì)胞IOOmL并提取總RNA參照QIAGEN公司提供的RNA提取試劑盒。(3)按照Super-Script 11IFIRSTSTRANDSUPERMIX試劑盒說明書，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用巢式PCR擴(kuò)增重鏈抗體的可變區(qū)片段:
[0028]第一輪PCR:
[0029]上游引物GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGGC
[0030]下游:GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
[0031]擴(kuò)增重鏈抗體引導(dǎo)肽和抗體CH2之間的片段，54°C退火，25個(gè)循環(huán)；結(jié)果如圖1顯示該片段的大小約為700bp，即從左到右的DNA條帶分別是:第一為DNA的分子Marker，第二單域抗體基因電泳帶約為700bp。
[0032]第二輪PCR:`[0033]以第一輪PCR產(chǎn)物作模板，
[0034]上游引物:GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG
[0035]下游引物:GGACTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT擴(kuò)增重鏈抗體 FRl 區(qū)和長(zhǎng)、短鉸鏈區(qū)之間的片段(長(zhǎng)片段和短片段)，60°C退火，17個(gè)循環(huán)，回收目的片段，結(jié)果如圖1顯示，該片段的大小約為500bp，即從左到右的DNA條帶分別是:第一為DNA分子Marker，第二單域抗體基因電泳帶約為500bp。(4)使用限制性的內(nèi)切酶(購(gòu)自NEB) PstI及NotI酶切20 μ g pComb3噬菌體展示載體(Biovector供應(yīng))及10 μ gVHH并用T4DNA連接酶(購(gòu)自TaKaRa公司)連接兩個(gè)片段。(5)將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞TGl (北京神州紅葉科技有限公司)中，構(gòu)建視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)的單域抗體噬菌體展示文庫(kù)并測(cè)定庫(kù)容，庫(kù)容的大小為2.5X108，結(jié)果如圖2顯示。與此同時(shí)，通過菌落PCR檢測(cè)引物使用第二輪PCR引物，Tm55°C。圖3顯示菌落PCR結(jié)果。文庫(kù)構(gòu)建完成后，為檢測(cè)文庫(kù)的插入率，我們隨機(jī)的選取24顆克隆做菌落PCR。結(jié)果顯示:即我們的插入率已達(dá)到90%以上。
[0036]實(shí)施例2:針對(duì)視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)的單域抗體篩選過程:
[0037](I)將溶解在PBS中的100 μ g/mL的視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)包被在NUNC酶標(biāo)板上，4°C放置過夜，同時(shí)設(shè)立負(fù)對(duì)照。(2)第二天兩個(gè)孔中分別加入200 μ Ll%牛奶，室溫封閉2小時(shí)。(3)2小時(shí)后，加入100 μ L噬菌體(8X 10ntfu免疫駱駝單域抗體噬菌展示基因庫(kù))，在室溫下作用I小時(shí)。(4)用PBST (PBS中含有0.05%吐溫20)洗5遍，以洗掉不結(jié)合的噬菌體。(5)用三乙基胺(IOOmM)將與視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)特異性結(jié)合的噬菌體解離下，并感染處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的大腸桿菌TG1，產(chǎn)生并純化噬菌體用于下一輪的篩選，相同篩選過程重復(fù)2輪。結(jié)果如圖4顯示:在不斷地篩選的過程中，陽性的克隆將不斷地被富集，從而達(dá)到了利用噬菌體展示技術(shù)篩取抗體庫(kù)中視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)特異抗體的目的。
[0038]實(shí)施例3:用噬菌體的酶聯(lián)免疫方法(ELISA)篩選特異性單個(gè)陽性克隆:
[0039]該實(shí)驗(yàn)的原理模式圖如圖5所示，具體檢測(cè)如下:
[0040](I)從3-4輪篩選后含有噬菌體的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，挑選96個(gè)單個(gè)菌落并接種于含有100 μ g/mL的氨芐青霉素的TB培養(yǎng)基(1LTB培養(yǎng)基中含有2.3g磷酸二氫鉀，12.52g磷酸氫二鉀，12g蛋白胨，24g酵母提取物，4mL甘油)中，生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期后，加終濃度Immol的IPTG，28°C培養(yǎng)過夜。(2)利用滲透法獲得粗提抗體，并將抗體轉(zhuǎn)移到經(jīng)抗原包被的ELISA板中，在室溫下放置I小時(shí)。(3)用PBST洗去未結(jié)合的抗體,加入一抗mouse ant1-HA tagantibody (抗鼠抗HA抗體,購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司),在室溫下放置I小時(shí)。
(4)用PBST 洗去未結(jié)合的抗體，加入二抗 ant1-mouse alkaline phosphatase conjugate(山羊抗小鼠堿性磷酸酶標(biāo)記抗體，購(gòu)自艾美捷科技有限公司)，在室溫下放置I小時(shí)。(5)用PBST洗去未結(jié)合的抗體，加入堿性磷酸酶顯色液，于ELISA儀上，在405nm波長(zhǎng)，讀取吸收值。(6)當(dāng)樣品孔OD值大于對(duì)照孔OD值3倍以上時(shí)，判為陽性克隆孔。(7)將陽性克隆孔的菌轉(zhuǎn)搖在含有100 μ g/mL的LB液體中以便提取質(zhì)粒并進(jìn)行測(cè)序。[0041]根據(jù)序列比對(duì)軟件Vector NTI及MGT分析軟件分析各個(gè)克隆株的基因序列，把CDRl, CDR2，CDR3序列相同的株視為同一克隆株，而其序列不同的株視為不同克隆株，最終共有2株不同的抗體。其抗體的VHH鏈的氨基酸序列分別如SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO:16所示。
[0042]實(shí)施例4:單域抗體在宿主菌大腸桿菌中表達(dá)、純化:
[0043](I)將前面測(cè)序分析所獲得兩種單域抗體亞克隆至表達(dá)性的載體PET32a中，并將測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)型宿主菌DE3中，其涂布在含有100 μ g/mL氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基的板上，37°C過夜。(2)挑選單個(gè)菌落接種在15mL含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，37°C搖床培養(yǎng)過夜。(3)接種ImL的過夜菌種至330mL LB培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)，培養(yǎng)到OD值達(dá)到0.6-1時(shí)，加入IPTG，28°C搖床培養(yǎng)過夜，(4)第二天，離心收菌。
(5)將菌體破碎以獲得抗體粗提液。(6)經(jīng)鎳柱離子親和層析純化抗體蛋白，為獲得高純度的抗體，采用咪唑梯度洗脫法，低濃度咪唑洗脫液(50mmol)用于洗去雜帶，高濃度咪唑洗脫液(250mmol，500mmol)最終可制備純度達(dá)90%以上的蛋白。圖6所示從左到右的條帶分別是:第一為標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子，第二、第三250mmol咪唑的洗脫液洗脫的蛋白樣品；結(jié)果顯示，單域抗體經(jīng)過該純化后，其純度可達(dá)到95%以上。
[0044]實(shí)施例5:視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)單域抗體檢測(cè)特異性分析:
[0045](I)將視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)前白蛋白包被在酶標(biāo)板上，同時(shí)做空白孔對(duì)照，各包被兩個(gè)孔，將載脂蛋白單域抗體及對(duì)照抗體前白蛋白單域抗體分別轉(zhuǎn)移到經(jīng)抗原包被的ELISA板中，在室溫下放置I小時(shí)。(2)用PBST洗去未結(jié)合的抗體，加入一抗mouseant1-HA tag antibody (抗鼠抗HA抗體,購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司),在室溫下放置I小時(shí)。(3)用PBST洗去未結(jié)合的抗體,加入二抗ant1-mouse alkaline phosphataseconjugate (山羊抗小鼠堿性磷酸酶標(biāo)記抗體，購(gòu)自艾美捷科技有限公司)，在室溫下放置I小時(shí)。(4)用PBST洗去未結(jié)合的抗體，加入堿性磷酸酶顯色液，于ELISA儀上，在405nm波長(zhǎng)，讀取吸收值。結(jié)果顯示視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)單域抗體能特異性的識(shí)別載脂蛋白。模式圖見圖7，結(jié)果如下:
【權(quán)利要求】
1.一種視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)的單域抗體的VHH鏈，包括框架區(qū)FR和互補(bǔ)決定區(qū)CDR，其特征在于，所述框架區(qū)FR選自下組的FR的氨基酸序列: SEQ ID NO:1 所示的 FRl，SEQ ID NO:2 所示的 FR2，SEQ ID NO:3 所示的 FR3，SEQ IDNO:4所示的FR4 ； 或 SEQ ID NO:5 所示的 FRl，SEQ ID NO:6 所示的 FR2，SEQ ID NO:7 所示的 FR3，SEQID NO:8 所示的 FR4 ； 所述互補(bǔ)決定區(qū)⑶R選自下組的⑶R的氨基酸序列:
SEQ ID NO:9 所示的 CDRl，SEQ ID NO:10 所示的 CDR2，SEQ ID NO:11 所示的 CDR3 ；
或SEQ ID NO: 12所示的 CDRl，SEQ ID NO: 13所示的 CDR2，SEQ ID NO: 14所示的 CDR3。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)的單域抗體的VHH鏈，其特征在于，它具有SEQ ID N0:15和SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列。
3.一種視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)單域抗體，其特征在于，它針對(duì)視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)表位的單域抗體，包括兩條具有SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的VHH鏈。
4.一種DNA分子，其特征在于，它編碼選自下組的蛋白質(zhì):權(quán)利要求1或2所述的視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)的單域抗體的VHH鏈，或權(quán)利要求3所述的視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)單域抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的DNA分子，其特征在于，它具有選自下組的DNA序列:
SEQ ID NO:17 和 SEQ ID NO:18。
6.一種表達(dá)載體，其特征在于，它含SEQ ID N0:17和SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列。
7.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它具有表達(dá)視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)的單域抗體的能力。
8.權(quán)利要求3所述的視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)單域抗體用于檢測(cè)視黃醇結(jié)合蛋白(RBP)的用途。
【文檔編號(hào)】G01N33/68GK103864927SQ201410095996
【公開日】2014年6月18日 申請(qǐng)日期:2014年3月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月14日
【發(fā)明者】萬亞坤, 孫燕燕, 李光輝, 母亞雯 申請(qǐng)人:東南大學(xué)