用于水稻的基于毛細(xì)管電泳和ssr熒光標(biāo)記的遺傳分析方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于水稻的遺傳分析方法，該方法應(yīng)用毛細(xì)管凝膠電泳對(duì)SSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，利用毛細(xì)管凝膠電泳技術(shù)的高分辨率特性，區(qū)分出遺傳關(guān)系相近的水稻品種，使得分析結(jié)果更加準(zhǔn)確。采用本發(fā)明的毛細(xì)管凝膠電泳－SSR標(biāo)記的遺傳分析方法，經(jīng)UPGMA聚類分析所建立的樹(shù)狀圖可用于水稻品種的遺傳關(guān)系分析，具有分辨率高、快捷高效、結(jié)果準(zhǔn)確可靠等優(yōu)點(diǎn)，且該方法易于自動(dòng)化，便于大量數(shù)據(jù)的整合與分析，這是傳統(tǒng)的檢測(cè)方法所不能比擬的。
【專利說(shuō)明】用于水稻的基于毛細(xì)管電泳和SSR熒光標(biāo)記的遺傳分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種用于水稻的基于毛細(xì)管電泳技術(shù)和SSR熒光標(biāo)記的遺傳分析方法，該方法還適用于種質(zhì)的收集和管理、品種之間的鑒定、親子關(guān)系的確定以及分子標(biāo)記輔助選擇育種程序的開(kāi)發(fā)。
【背景技術(shù)】
[0002]稻屬(Oryza),隸屬于稻族(Oryzeae Dumort.),由2個(gè)栽培種和20個(gè)野生種組成，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。稻屬遺傳資源十分豐富，據(jù)估計(jì)，全球僅亞洲栽培稻就有14萬(wàn)份不重復(fù)的種質(zhì)。在中國(guó)，隨著雜交水稻的大面積推廣及超級(jí)稻的成功應(yīng)用，水稻產(chǎn)量得到大幅度提供，因此研究水稻的遺傳多樣性，弄清水稻品種間親緣關(guān)系，為雜交水稻高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)抗病育種提供優(yōu)良中間材料就顯得尤為重要。
[0003]隨著分子生物學(xué)、生物技術(shù)的快速發(fā)展，DNA分子標(biāo)記逐漸發(fā)展完善，DNA分子標(biāo)記是核酸水平上遺傳多態(tài)性的直接體現(xiàn)，DNA標(biāo)記的遺傳多態(tài)性表現(xiàn)為核苷酸序列的差異。其中SSR (Simple sequence repeat)標(biāo)記由于具有多態(tài)性高、數(shù)量豐富、遺傳上呈共顯性、結(jié)果穩(wěn)定可靠、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、引物序列易交流等優(yōu)點(diǎn)，已普遍應(yīng)用于遺傳圖譜的構(gòu)建、基因定位、品種鑒定、親緣關(guān)系分析等各個(gè)研究領(lǐng)域。隨著水稻基因組計(jì)劃的順利實(shí)施以及水稻基因組序列測(cè)序工作的完成，水稻的SSR標(biāo)記密度不斷提高，尋找多態(tài)性高的SSR標(biāo)記可應(yīng)用于水稻品種鑒定及分析不同品種間的遺傳多樣性，其結(jié)果可為基因定位群體親本的選擇提供理論依據(jù)。
[0004]目前以SSR分子標(biāo)記為基礎(chǔ)的水稻遺傳分析已趨于成熟，基因組DNA的提取、PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物分離與檢測(cè)是其三個(gè)重要環(huán)節(jié)，其中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分離與檢測(cè)是技術(shù)難度最大、最復(fù)雜的環(huán)節(jié)。目前最常用的方法是聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)方法，該方法理論上可以分離相差I(lǐng)bp的兩個(gè)片段，但實(shí)際操作中很難實(shí)現(xiàn)，且不能準(zhǔn)確讀出片段大小，只能人為估計(jì)，難以對(duì)大規(guī)模不同批次品種DNA數(shù)據(jù)進(jìn)行有效整合和準(zhǔn)確比較。因此，要開(kāi)展大規(guī)模的水稻品種遺傳分析，需要建立準(zhǔn)確、高效且能直接讀出DNA片段大小的檢測(cè)方法。
[0005]毛細(xì)管電泳(Capillay Electrophoresis, CE)也叫高效毛細(xì)管電泳(HPCE)是20世紀(jì)80年代后期在全球范圍內(nèi)迅速崛起的一種分離分析技術(shù)，由于CE可以分離分析蛋白質(zhì)、多肽、脫氧核糖核酸(DNA)、核苷酸等小分子，滿足了生命科學(xué)各領(lǐng)域小分子分離分析的要求；因此，CE近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于生物工程的小分子、小離子、多肽及蛋白質(zhì)的分離分析研究。該技術(shù)利用與遺傳系統(tǒng) 相匹配的電腦軟件完成對(duì)數(shù)據(jù)的統(tǒng)一處理，操作簡(jiǎn)便，實(shí)現(xiàn)了分子標(biāo)記研究與高效、自動(dòng)化技術(shù)的結(jié)合。樣品用量少，分析速度快，分離效率高，有利于大規(guī)模、多批次的數(shù)據(jù)采集和分析。該分析技術(shù)將PCR產(chǎn)物和標(biāo)準(zhǔn)分值量樣品在同一泳道中進(jìn)行電泳，精確給出擴(kuò)增片段的大小，減少了人為誤差，使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。

【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的是解決水稻遺傳分析難問(wèn)題，提供一種用于水稻的基于毛細(xì)管電泳和SSR熒光標(biāo)記的遺傳分析方法，該方法能夠高通量、大規(guī)模、多批次的對(duì)水稻品種進(jìn)行遺傳分析，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。并且能夠?yàn)榛虬l(fā)掘和水稻新品種選育提供基礎(chǔ)資料和理論參考。
[0007]本發(fā)明提供的用于水稻的基于毛細(xì)管電泳和SSR熒光標(biāo)記的遺傳分析方法，包括以下步驟:
1)水稻基因組DNA的提取
取水稻嫩葉于液氮研磨成粉末狀，加入1.2 ml 65°C預(yù)熱的SDS提取液，搖勻，65°C水浴 45 min ;加入 200 μ I KAc (5 mol/L, ρΗ4.8),混勻后，冰浴 15 min ;4°C，10000 rpm 離心15 min,取I ml上清液,加入等體積氯仿混勻；4°C, 12000 rpm離心7 min,取上清液,加1/10體積的NaAc (3 mol/L, ρΗ5.2)和2倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇，冰浴20 min ；4°C, 10000rpm離心10 min,棄上清，用70%酒精洗滌2次，晾干沉淀；加入200 μ I已滅菌的TE溶液(ΡΗ8.0)，溶解沉淀，即得DNA溶液，置于_20°C保存?zhèn)溆茫?br> 2)引物的篩選與合成
篩選出多態(tài)性較好的9對(duì)SSR引物對(duì)研究材料全基因組進(jìn)行遺傳多樣分析。將篩選出的引物正向序 列5’端以“CY5”磷熒光染料標(biāo)記，合成熒光引物，并避光保存。引物信息見(jiàn)表1。
[0008]表1引物編號(hào)及引物擴(kuò)增信息
【權(quán)利要求】
1.用于水稻的基于毛細(xì)管電泳和SSR熒光標(biāo)記的遺傳分析方法，分辨出水稻各品種的特異性DNA片段，建立擴(kuò)增片段的分布圖，用NTSYSpc軟件按照UPGMA進(jìn)行聚類分析，得到供試水稻材料的樹(shù)狀圖，可用于水稻資源親緣關(guān)系的分析；其特征是: 實(shí)驗(yàn)步驟: (1)水稻基因組DNA的提取 取水稻嫩葉于液氮研磨成粉末狀，加入1.2 ml 65°C預(yù)熱的SDS提取液，搖勻，65°C水浴 45 min ;加入 200 μ I KAc,混勻后，冰浴 15 min ；4°C 10000 rpm 離心 15 min,取 I ml上清液，加入等體積氯仿混勻；4°C 12000 rpm離心7 min,取上清液,加1/10體積的NaAc和2倍體積的預(yù)冷無(wú)水乙醇,冰浴20 min ；4°C, 10000 rpm離心10 min,棄上清,用70%酒精洗滌2次，晾干沉淀；加入200 μ I ρΗ8.0已滅菌的TE溶液，溶解沉淀，即得DNA溶液，置于-20°C保存?zhèn)溆茫? (2)引物的篩選與合成 篩選出9對(duì)SSR引物對(duì)研究材料全基因組進(jìn)行遺傳多樣分析，將篩選出的引物正向序列5’端以 “CY5”磷熒光染料標(biāo)記，合成熒光引物，并避光保存； (3)PCR擴(kuò)增反應(yīng) 20μ1 反應(yīng)體系包含:12.8 μL ddH20,10XPCR Buffer2.0 μ1,?ΝΤΡ2.0 μL,Primer Fl.0M-1, Primer Rl.0 M-1, rTaq polymerase0.2 M-1, DNA1.0 M-1 ;反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性 4 min,40 個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán) 94°C I min、55°C 45 sec,72°C 45 sec，最后 72°C延伸 10 min ； (4)毛細(xì)管凝膠電泳檢測(cè) ①調(diào)整遺傳分析儀BECKMANCOULTER CEQ 8000系統(tǒng):安裝毛細(xì)管和凝膠，將毛細(xì)管溫度調(diào)整至50°C，按照0.4 ml凝膠，重復(fù)3次模式進(jìn)行初級(jí)管路沖洗，執(zhí)行毛細(xì)管充膠，重復(fù)3次，執(zhí)行光路聚集，監(jiān)控儀器基線，使系統(tǒng)背景值低于6000RFU ； ②輸入樣品信息:輸入待測(cè)樣品名，選擇電泳分離方法和數(shù)據(jù)分析方法，保存樣本信息； ③樣品分析:使用去離子水沖洗水槽三次，加入去離子水至標(biāo)線，擦干水槽外表面，裝入水槽,放入上樣板和緩沖液板,開(kāi)始運(yùn)行樣本； ④數(shù)據(jù)分析=PCR產(chǎn)物與Genescan-400分子量標(biāo)準(zhǔn)品的熒光信號(hào)均由遺傳分析儀自動(dòng)保存；用GeneMapper-V3.0軟件對(duì)遺傳分析系統(tǒng)儀收集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過(guò)人工分析與軟件統(tǒng)計(jì)得出不同參試材料的SSR標(biāo)記的擴(kuò)增片段，利用軟件將SSR標(biāo)記片段與Genescan-400分子量標(biāo)準(zhǔn)品比較，得到SSR標(biāo)記片段長(zhǎng)度大??； (5)遺傳多樣性的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 每對(duì)SSR引物檢測(cè)到I個(gè)位點(diǎn)，視每條多態(tài)性帶為I個(gè)等位基因；將觀測(cè)到的每條帶視為一個(gè)性狀，有帶時(shí)賦值為“1”，無(wú)帶時(shí)賦值為“0”，建立數(shù)據(jù)庫(kù)；所獲得的0/1數(shù)據(jù)用NTSYSpc 2.10軟件進(jìn)行聚類分析，選用相似性SM系數(shù)，以SHAN Clustering進(jìn)行UPGMA聚類分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻的基于毛細(xì)管電泳和SSR熒光標(biāo)記的遺傳分析方法，其特征在于，所述的SDS提取液組成為:Tris-HCl 200 mmol/L, pH8.0 ；EDTA 50 mmol/LpH8.0 ；NaCl 500 mmol/L ；SDS 質(zhì)量分?jǐn)?shù) 3%。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻的基于毛細(xì)管電泳和SSR熒光標(biāo)記的遺傳分析方法，其特征在于，所述上樣板中為Gemescan-400分子量標(biāo)準(zhǔn)品，上樣緩沖液甲酰胺和稀釋后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的混合液，將上樣板在渦旋震蕩器上震蕩30 sec或者用槍頭混勻10次，且不能出現(xiàn)氣泡，加入一滴石蠟油覆蓋樣品。
4 .根據(jù)權(quán)利要求1所述的水稻的基于毛細(xì)管電泳和SSR熒光標(biāo)記的遺傳分析方法，其特征在于，所述緩沖液板為在與上樣板對(duì)應(yīng)的孔內(nèi)加入3/4體積的分離緩沖液。
【文檔編號(hào)】G01N27/447GK103911441SQ201410094022
【公開(kāi)日】2014年7月9日 申請(qǐng)日期:2014年3月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月13日
【發(fā)明者】梁俊, 陳遠(yuǎn)孟, 劉守廷, 覃紅萍, 甘國(guó)勇, 莫璋紅, 宋雪萍, 蔣天成, 趙晶, 蘇小玲, 劉廣林, 陳傳華, 唐梅, 張宗瓊, 羅群昌, 梁益珍, 李碧紅 申請(qǐng)人:南寧益譜檢測(cè)技術(shù)有限公司, 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所, 廣西壯族自治區(qū)分析測(cè)試研究中心, 南寧泰格瑞農(nóng)業(yè)科技有限公司