一種獸藥殘留的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種獸藥的檢測(cè)方法，所述方法包括如下步驟：（1）樣品的處理：將待測(cè)樣品進(jìn)行前處理，加入提取劑后經(jīng)過(guò)多個(gè)步驟處理得到上清液過(guò)濾得到的濾液用于UPLC-MS/MS測(cè)定；（2）獸藥殘留的測(cè)定，將得到的樣品在一定的測(cè)定條件下進(jìn)行超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的測(cè)定。本發(fā)明的檢測(cè)方法具有靈敏度高，專屬性強(qiáng)的特點(diǎn)，能夠滿足獸藥殘留的測(cè)定。
【專利說(shuō)明】一種獸藥殘留的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及以一種檢測(cè)方法，特別是涉及一種獸藥殘留的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]獸藥在防治動(dòng)物疾病、提高生產(chǎn)效率、改善畜產(chǎn)品質(zhì)量等方面起著十分重要的作用。然而，由于養(yǎng)殖人員對(duì)科學(xué)知識(shí)的缺乏以及一味地追求經(jīng)濟(jì)利益，致使濫用獸藥現(xiàn)象在當(dāng)前畜牧業(yè)中普遍存在。
[0003]隨著人們對(duì)動(dòng)物源食品由需求型向質(zhì)量型的轉(zhuǎn)變，動(dòng)物源食品中的獸藥殘留已逐漸成為全世界關(guān)注的一個(gè)焦點(diǎn)。獸藥殘留是指用藥后蓄積或存留于畜禽機(jī)體或產(chǎn)品(如雞蛋、奶品、肉品等)中原型藥物或其代謝產(chǎn)物，包括與獸藥有關(guān)的雜質(zhì)殘留。目前，在動(dòng)物源食品中較容易引起獸藥殘留量超標(biāo)的獸藥主要有抗生素類、磺胺類和激素類等藥物。
[0004]濫用獸藥極易造成動(dòng)物源食品中有害物質(zhì)的殘留，這對(duì)人體健康造成直接危害。例如長(zhǎng)期食用獸藥殘留超標(biāo)的食品后，當(dāng)體內(nèi)蓄積的藥物濃度達(dá)到一定量時(shí)人體會(huì)產(chǎn)生多種急慢性中毒現(xiàn)象。目前，國(guó)內(nèi)外已有多起有關(guān)人食用鹽酸克侖特羅超標(biāo)的豬肺臟而發(fā)生急性中毒事件的報(bào)道。
[0005]四環(huán)素類藥物能夠與骨骼中的鈣結(jié)合，抑制骨骼和牙齒的發(fā)育?；前奉愃幬锬軌蚱茐娜梭w造血機(jī)能等。另一方面，動(dòng)物機(jī)體長(zhǎng)期反復(fù)接觸某種抗菌藥物后，其體內(nèi)敏感菌株受到選擇性的抑制，從而使耐藥菌株大量繁殖，耐藥性細(xì)菌的產(chǎn)生使得一些常用藥物的療效下降甚至失去療效。此外，濫用獸藥對(duì)畜牧業(yè)的發(fā)展和生態(tài)環(huán)境也造成極大危害。動(dòng)物用藥后，一些性質(zhì)穩(wěn)定的藥物隨糞便、尿被排泄到環(huán)境中后仍能穩(wěn)定存在，從而造成環(huán)境中的藥物殘留。長(zhǎng)期濫用藥物嚴(yán)重制約著畜牧業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。如長(zhǎng)期使用抗生素易造成畜禽機(jī)體免疫力下降，影響疫苗的接種效果，還可引起畜禽內(nèi)源性感染和二重感染。
[0006]對(duì)動(dòng)物性食品中的獸藥殘留進(jìn)行監(jiān)控的一個(gè)重要手段就是建立快速準(zhǔn)確的殘留分析方法。目前，報(bào)道的文獻(xiàn)及國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中大多是單一獸藥或單一種類獸藥的檢測(cè)方法，但在實(shí)際工作中，由于動(dòng)物性食品安全的保證需要多個(gè)指標(biāo)進(jìn)行綜合指證，因此，單個(gè)樣本常需要多次檢測(cè)工作，極大的浪費(fèi)了人力、物力及財(cái)力。多殘留的檢測(cè)能夠更好的節(jié)省時(shí)間、提高工作效率，并能更加有效地監(jiān)測(cè)動(dòng)物產(chǎn)品的安全性。另一方面，國(guó)內(nèi)外報(bào)道的動(dòng)物源性食品中藥物殘留檢測(cè)的檢測(cè)方法主要有液相色譜法(HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)、酶聯(lián)免疫法及生物傳感器技術(shù)。
[0007]酶聯(lián)免疫分析技術(shù)(ELISA)是一種將酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性和抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性相結(jié)合的方法，其敏感性和特異性較好。ELISA具有樣品前處理簡(jiǎn)單，純化步驟少，大量樣本分析時(shí)間短，適合于做成試劑盒現(xiàn)場(chǎng)篩選等優(yōu)點(diǎn)，使其可實(shí)現(xiàn)快速現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)，是現(xiàn)階段食品安全檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用較多的一項(xiàng)檢測(cè)技術(shù)。但它也存在著很多缺陷:對(duì)試劑的選擇性高，很難同時(shí)分析多種成分；對(duì)結(jié)構(gòu)類似的化合物有一定程度的交叉反應(yīng)；分析分子量很小的化合物或很不穩(wěn)定的化合物有一定的困難。
[0008]生物傳感器是由一種生物敏感膜和電化學(xué)轉(zhuǎn)換器兩部分配合，對(duì)特定種類的化學(xué)物質(zhì)或生物活性物質(zhì)具有選擇性和可逆響應(yīng)的分析裝置。在獸藥殘留分析上得到了較廣泛的應(yīng)用。雖然生物傳感器具有微型化、響應(yīng)速度快、樣品用量少的特點(diǎn)，但還存在著結(jié)果的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性和使用壽命方面的問(wèn)題。
[0009]現(xiàn)有技術(shù)的方法常有靈敏度不高、前處理繁瑣、檢測(cè)藥物單一或重現(xiàn)性不好等問(wèn)題，很難滿足對(duì)藥物殘留的同時(shí)確證檢測(cè)。
[0010]液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)的檢測(cè)方法以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測(cè)系統(tǒng)。樣品在質(zhì)譜部分被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測(cè)器得到質(zhì)譜圖。液質(zhì)聯(lián)用體現(xiàn)了色譜和質(zhì)譜優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，將色譜對(duì)復(fù)雜樣品的高分離能力，與MS具有高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對(duì)分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)，在藥物分析領(lǐng)域具有了廣泛的應(yīng)用。液質(zhì)聯(lián)用(HPLC-MS)分析樣品中定性和定量方面的優(yōu)勢(shì)是單獨(dú)液相分析不能媲美的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是:提供一種新的獸藥殘留的檢測(cè)方法，具體來(lái)說(shuō)，其是通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用的檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)多種類多樣品的檢測(cè)。
[0012]具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0013]一種獸藥殘留的檢測(cè)方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟:
[0014](I)樣品的處理:將待測(cè)樣品進(jìn)行前處理，加入提取劑后進(jìn)行勻漿，之后進(jìn)行超聲提取，之后進(jìn)行第一次離心分離得到上清液，用氮?dú)鈱⑸锨逡捍蹈珊蟮玫降臍堄辔镉贸跏剂鲃?dòng)相溶解，混勻，之后進(jìn)行第二次離心分離得到上清液，取上清液進(jìn)行微孔濾膜過(guò)濾得到的濾液用于UPLC-MS/MS測(cè)定；
[0015](2)獸藥殘留的測(cè)定
`[0016]將步驟(1)得到的樣品進(jìn)行超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的測(cè)定，測(cè)定條件如下:
[0017]色譜條件:色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18柱；流動(dòng)相為甲醇和甲酸水溶液，洗脫方式為梯度洗脫；
[0018]質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI+);源溫為105 0C -115 °C ;脫溶劑溫度為340 V -360 °C ;脫溶劑氣流速度為600L.h^-TOOL.IT1 ;錐孔反吹氣流速度為45L.h ^h10
[0019]其中，所述獸藥為四環(huán)素類藥物、β受體激動(dòng)劑類藥物、喹諾酮類藥物和/或磺胺類藥物。
[0020]其中，所述獸藥為四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素、特步他林、西馬特羅、沙丁胺醇、菲諾特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、噴布洛爾、苯乙醇胺Α、培氟沙星，環(huán)丙沙星，恩諾沙星，氧氟沙星，伊諾沙星、吡哌酸、萘啶酸、西諾沙星、諾氟沙星、達(dá)氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、沙氟沙星、司帕沙星、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡唆、磺胺甲基嘧唆、磺胺二甲基噁唑、磺胺對(duì)甲氧嘧唆、磺胺二甲嘧唆、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺甲噁唑、磺胺氯達(dá)嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺二甲異噁唑、磺胺苯吡唑、磺胺二甲氧嘧啶和/或磺胺喹噁啉中的一種、幾種或全部。
[0021]其中，步驟(2)所述梯度洗脫程序?yàn)?
[0022]0-10.0min:甲醇的體積比為 3.0% -90.0% ；[0023]10.0-10.1min:甲醇的體積比為 90.0% A-3.0% ；
[0024]10.1-13.0min:甲醇的體積比為 3.0%.[0025]其中，步驟(1)所述氮?dú)獯蹈缮锨逡旱臏囟葹?5°C -35°C，優(yōu)選在30°C下進(jìn)行。
[0026]其中，步驟(1)所述第一次離心和第二次離心的轉(zhuǎn)速為9000r.min_1-l1000r.mirf1,離心的時(shí)間為8min-12min,優(yōu)選所述第一次離心和第二次離心的轉(zhuǎn)速為1000Or.min \離心的時(shí)間為IOmin0
[0027]其中，步驟(1)所述提取劑為10%三氯乙酸水溶液與乙腈的混合溶液；優(yōu)選兩者的體積比例為10%三氯乙酸水溶液:乙腈=(15~25): (75~85);更優(yōu)選兩者的體積比例為10%三氯乙酸水溶液:乙腈=20:80。
[0028]其中，步驟(1)所述在第一次離心分離后得到上清液的同時(shí)得到沉淀，對(duì)沉淀進(jìn)行再次提取和分離，得到上清液與第一次離心分離得到的上清液進(jìn)行合并，將合并后的上清液進(jìn)行下一步驟的氮?dú)獯蹈伞?br> [0029]其中，步驟(2)的甲酸水溶液的體積濃度為0.04% -0.07%，優(yōu)選體積濃度為
0.05%。
[0030]其中，步驟(2)所述色譜條件:色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18柱；流動(dòng)相為甲醇和甲酸水溶液，洗脫方式為梯度洗脫；流速為0.25mL.rniiT1 ;柱溫為30°C ；
[0031]質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI+);毛細(xì)管電壓為3.5KV ;錐孔電壓為3.0V ;RF透鏡電壓為0.5V ;源溫為110 °C ;脫溶劑溫度為350°C ;脫溶劑氣流速度為650L.IT1 ;錐孔反吹氣流速度為50L.IT1。
[0032]本發(fā)明的有益技術(shù)效果如下:
[0033]本發(fā)明的檢測(cè)方法具有靈敏度高，專屬性強(qiáng)的特點(diǎn)。
[0034]本發(fā)明采用的超高液相色譜進(jìn)行測(cè)定，超高效液相色譜(Ultra PerformanceLiquid Chromatography簡(jiǎn)稱UPLC)是分離科學(xué)中的一個(gè)全新類別，UPLC借助于HPLC的理論及原理，涵蓋了小顆粒填料、非常低系統(tǒng)體積及快速檢測(cè)手段等全新技術(shù)，增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量。超高液相色譜在測(cè)定上相對(duì)于普通液相色譜存在很多優(yōu)點(diǎn)。與傳統(tǒng)的HPLC相比，UPLC的速度、靈敏度及分離度分別是HPLC的9倍、3倍及1.7倍，它縮短了分析時(shí)間，同時(shí)減少了溶劑用量降低了分析成本。
[0035]UPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)，結(jié)合了液相色譜的高分離能力和質(zhì)譜提供結(jié)構(gòu)信息的功能，具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，尤其是串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(MS/MS或MSn)的應(yīng)用，可以獲得豐富、有效的化合物結(jié)構(gòu)信息，建立快速、高效的分析研究體系。
[0036]本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，針對(duì)4種四環(huán)素類藥物、18種磺胺類藥物、14種喹諾酮類藥物及10種β受體激動(dòng)劑藥物建立了一種快速簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)、靈敏度高的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)方法，以保障對(duì)動(dòng)物源性食品中該類藥物殘留的檢測(cè)。
[0037]此外，本發(fā)明為了提高分析的靈敏度和專一性，進(jìn)行多時(shí)間段的多反應(yīng)檢測(cè)掃描(MRM) (mult1-period MRM,mpMRM),即按照待測(cè)藥物的保留時(shí)間，分為多個(gè)時(shí)間段分別進(jìn)行MRM掃描，并同時(shí)進(jìn)行定性和定量的雙離子通道分析，進(jìn)而進(jìn)一步提高該方法的準(zhǔn)確性和專屬性。
[0038]本發(fā)明建立了穩(wěn)定高效的測(cè)定方法，當(dāng)待測(cè)樣品通過(guò)本發(fā)明測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定時(shí)，通過(guò)與所述的定性離子色譜圖及保留時(shí)間進(jìn)行殘留藥物的定性分析，并進(jìn)一步通過(guò)定量離子色譜圖和標(biāo)準(zhǔn)曲線最終確定殘留藥物的含量。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0039]圖1:4種四環(huán)素類藥物混合對(duì)照物的定量離子通道色譜圖；
[0040]圖2:10種β -受體激動(dòng)劑類藥物和3種氘代內(nèi)標(biāo)混合對(duì)照物的定量離子通道色譜圖；
[0041]圖3:14種喹諾酮類藥物混合對(duì)照物的定量離子通道色譜圖；
[0042]圖4:18種磺胺類藥物混合對(duì)照物的定量離子通道色譜圖；
[0043]上述各圖是UPLC-MS/MS測(cè)定結(jié)果的原始圖譜，由于軟件系統(tǒng)是英文的，故輸出的原始圖是英文的，其中1207代表樣品的名稱，圖中的英文翻譯如下:
[0044]Channels:質(zhì)譜檢測(cè)離子的通道
[0045]Tetracycline:四環(huán)素、Oxytetracycline: 土霉素、Chlorotetracycline:金霉素、Doxycycline:強(qiáng)力霉素；
[0046]Terbutaline ;特步他林、Cimaterol:西馬特羅、Salbutamol:沙丁 胺醇、Salbutamol-D6:氣代沙丁胺醇、Fenoterol:菲諾特羅、Ractopamine:萊克多巴胺、Ractopamine-D6:氣代萊克多巴胺、Clorprenaline:氯丙那林、Clenbuterol:克倫特羅、Clenbuterol_D9:氣代克倫特羅、Tulobuterol:妥布特羅、Penbutolol:噴布洛爾、PhenylEA A:苯乙醇胺A ;
[0047]Pefloxacin:培氟沙星，Ciprofloxacin:環(huán)丙沙星，Enrofloxacin:恩諾沙星，Ofloxacin:氧氟沙星，Enoxacin:伊諾沙星、Pipemidic Acid 卩比哌酸、NalidixicAcid:萘唳酸、Cinoxacin:西諾沙星、Norfloxacin:諾氟沙星、Danofloxacin:達(dá)氟沙星、Lomefloxacin:洛美沙星、Difloxacin: 二氟沙星、Sarafloxacin:沙氟沙星、Sparfloxacin:司帕沙星；
[0048]Sulfadoxine:橫胺鄰二甲氧卩密唳、Sulfadiazine:橫胺卩密唳、Sulfathiazole:橫胺噻唑、Sulfapyridine:橫胺卩比唳、Sulfamerazine:橫胺甲基卩密唳、Sulfamoxol:橫胺二甲基tl惡唑、Sulfameter:橫胺對(duì)甲氧卩密卩定、Sulfamethazine:橫胺二甲卩密卩定、Sulfamethizole:橫胺甲噻二唑、Sulfamethoxypyridazine:橫胺甲氧咕嗪、Sulfamethoxazole:橫胺甲tl惡唑、Sulfachloropyridazine:橫胺氯達(dá)嗪、Sulfamonomethoxine:橫胺間甲氧卩密唳、Sulfacetamide:橫胺醋酸、Sulfisoxazole:橫胺二 甲異卩惡唑、Sulfaphenazole:橫胺苯批唑、Sulfadimethoxine:橫胺二甲氧卩密唳、Sulfaquinoxaline:橫胺喹卩惡啉。
【具體實(shí)施方式】
[0049]本發(fā)明提供了一種獸藥殘留的檢測(cè)方法，所述方法包括如下步驟:
[0050](I)樣品的處理:將待測(cè)樣品進(jìn)行粉碎，加入提取劑后進(jìn)行勻漿，之后進(jìn)行超聲提取，之后進(jìn)行第一次離心分離得到上清液，用氮?dú)鈱⑸锨逡捍蹈珊蟮玫降臍堄辔镉贸跏剂鲃?dòng)相溶解，混勻，之后進(jìn)行第二次離心分離得到上清液，取上清液進(jìn)行微孔濾膜過(guò)濾得到的濾液用于UPLC-MS/MS測(cè)定；
[0051]所述待測(cè)樣品是各類動(dòng)物源的肉、蛋、奶。當(dāng)所述的樣品為肉時(shí)，前處理的步驟是通過(guò)料理機(jī)進(jìn)行粉碎；當(dāng)待測(cè)樣品是蛋時(shí)，去殼打碎；當(dāng)待測(cè)樣品是奶時(shí)，只需要簡(jiǎn)單過(guò)濾除雜就可以。
[0052]所述的兩次離心分離目的是使樣品中蛋白質(zhì)盡量全部除去，防止堵塞液相色譜柱，同時(shí)減少殘留物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾。
[0053]所述的提取劑為10%三氯乙酸水溶液與乙腈的混合溶液，兩者的體積比例為10%三氯乙酸水溶液:乙腈=(15~25):(75~85)，優(yōu)選兩者的體積比例為10%三氯乙酸水溶液:乙腈=20:80。所述的提取劑的選擇是考慮到
[0054]蛋白沉淀、藥物溶解性及酸堿性進(jìn)行選擇的結(jié)果，選擇單獨(dú)的有機(jī)溶劑不利于小分子藥物的溶解。選擇酸性溶液過(guò)多會(huì)使樣品中的殘留藥物破環(huán)，而影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0055]優(yōu)選地，所述在第一次離心分離后得到上清液的同時(shí)得到沉淀，對(duì)沉淀進(jìn)行再次提取，得到上清液與第一次離心分離得到的上清液進(jìn)行合并，將合并后的上清液進(jìn)行下一步驟的氮?dú)獯蹈伞?br> [0056]優(yōu)選地，所述的再次提取是將沉淀加入提取劑后進(jìn)行勻漿，之后進(jìn)行超聲提取，之后進(jìn)行離心分離得到上清液，將得到的該上清液與第一次離心分離得到的上清液進(jìn)行合并，將合并后的上清液進(jìn)行下一步驟的氮?dú)獯蹈?。所述微孔濾膜的孔徑大小為0.45 μ m。
[0057]優(yōu)選地，氮?dú)獯蹈缮锨逡旱臏囟葹?5°C -35°C，優(yōu)選在30°C下進(jìn)行。
[0058]優(yōu)選地，所述第一次離心和第二次離心的轉(zhuǎn)速為9000r.min^-l1000r.mirT1，離心的時(shí)間為8min-12min ;優(yōu)選第一次離心和第二次離心的轉(zhuǎn)速為1000Or.mirT1,離心的時(shí)間為IOmin。
[0059]通過(guò)所述的提取過(guò)程盡量地將藥物提取，并保證動(dòng)物內(nèi)源性雜質(zhì)的去除最大化，在兩者同時(shí)兼顧的前提下，在本發(fā)明檢測(cè)方法中提取的次數(shù)以2次為優(yōu)選。
[0060](2)獸藥殘留的測(cè)定
[0061]將步驟(1)得到的樣品進(jìn)行超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的測(cè)定；測(cè)定條件如下:
[0062]色譜條件:色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18柱；流動(dòng)相為甲醇和0.05%甲酸水溶液，洗脫方式為梯度洗脫；流速為0.25mL.mirT1 ;柱溫為30°C ;進(jìn)樣量為10 μ L ;
[0063]質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI+);毛細(xì)管電壓為3.5KV ;錐孔電壓為3.0V ;RF透鏡電壓為0.5V ;源溫為110°C ;脫溶劑溫度為350°C ;脫溶劑氣流速度為650L.IT1 ;錐孔反吹氣流速度為50L.IT1。
[0064]優(yōu)選地，所述梯度洗脫程序?yàn)?
[0065]0-10.0min:甲醇的體積比為 3.0% -90.0% ；
[0066]10.0-10.1min:甲醇的體積比為 90.0% -3.0% ；
[0067]10.1-13.0min:甲醇的體積比為 3.0%o
[0068]所述梯度洗脫的流動(dòng)相配比和洗脫程序可以保證各個(gè)藥物的良好分離和定量。
[0069]優(yōu)選地，所述獸藥為四環(huán)素類藥物、β受體激動(dòng)劑類藥物、喹諾酮類藥物、磺胺類藥物。 [0070]優(yōu)選地，所述獸藥為四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素、特步他林、西馬特羅、沙丁胺醇、菲諾特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、噴布洛爾、苯乙醇胺Α、培氟沙星，環(huán)丙沙星，恩諾沙星，氧氟沙星，伊諾沙星、吡哌酸、萘啶酸、西諾沙星、諾氟沙星、達(dá)氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、沙氟沙星、司帕沙星、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡唆、磺胺甲基嘧唆、磺胺二甲基噁唑、磺胺對(duì)甲氧嘧唆、磺胺二甲嘧唆、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺甲噁唑、磺胺氯達(dá)嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺二甲異噁唑、磺胺苯吡唑、磺胺二甲氧嘧啶和/或磺胺喹噁啉中的一種或幾種或全部。
[0071]所述的四種獸藥殘用途較為廣泛，在動(dòng)物組織中殘留較多，同時(shí)檢測(cè)上述四類獸藥對(duì)于食品的檢測(cè)具有重要意義。上述46種藥物涉及的范圍很廣，結(jié)構(gòu)類型豐富，這說(shuō)明本發(fā)明的方法可以用于多種藥物的檢測(cè)。
[0072]在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明獸藥殘留的檢測(cè)方法包括如下步驟:(I)樣品前處理
[0073]動(dòng)物性肌肉組織首先用料理機(jī)充分粉碎，冷凍保存；準(zhǔn)確稱取解凍后的動(dòng)物源性食品5.0g，置于50mL的離心管中，加入10%三氯乙酸:乙腈提取液(V:V=20:80)10.0mL,充分勻衆(zhòng)后，超聲提取IOmin, 1000Or.mirT1離心IOmin,上清液轉(zhuǎn)移到另一 50mL離心管中，殘?jiān)儆锰崛∫?0.0mL重復(fù)提取一次，合并提取液，將提取液于30°C下氮?dú)獯蹈?。殘余物用初始流?dòng)相2.0mL溶解，渦旋混勻，以1000Or.mirT1的速率高速離心lOmin。取適量上清液，0.45 μ m微孔濾膜過(guò)濾，供UPLC-MS/MS測(cè)定。
[0074](2)樣品的檢測(cè):色譜條件與質(zhì)譜條件
[0075]色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18柱(IOOmmX 2.1mm, 1.7 μ m);流動(dòng)相:A相為甲醇，B 相為 0.05% 甲酸水溶液，梯度洗脫:0-10.0min:3.0% A-90.0%A ；10.0-10.1min:90.0 % A-3.0% A ；10.1-13.0min:3.0% A ;流速為 0.25mL.mirT1 ;柱溫為 30 °C ;進(jìn)樣量為 10μ L0
[0076]電噴霧離子源(ESI+);毛細(xì)管電壓為3.5KV;錐孔電壓為3.0V ;RF透鏡電壓為
0.5V ;源溫為110°C ;脫溶劑溫度為350°C ;脫溶劑氣流速為650L.IT1 ;錐孔反吹氣流速為50L ^h10
[0077]實(shí)施例
[0078]實(shí)施例1
[0079]I儀器與試藥
[0080]1.1 儀器
[0081]Waters Ultra Performance LC 液相色譜儀(Waters 公司)，Quattro Premier XE質(zhì)譜儀(Waters 公司)，MassLynx ν4.I 數(shù)據(jù)處理軟件(Waters 公司)；Waters Acquity UPLCBEH C18 色譜柱(100mmX2.lmm，1.7ym) ;TranssonicTP690 超聲波清洗器(Elma 公司)；3K15離心機(jī)(Sigma 公司)；Millipore Elix Mill1-Q 純水儀。
[0082]1.2 材料
[0083]色譜純甲醇(Fisher Scientific公司產(chǎn)品)；色譜純乙臆(Fisher Scientific公司產(chǎn)品)；超純水；其他試劑均為分析純。
[0084]所用46種藥物均是商購(gòu)獲得，各個(gè)藥物的純度均高于98.0%。
[0085]將健康牛肉(經(jīng)過(guò)測(cè)定不含所述的46種藥物中的任一種)定量加入所述的四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素、特步他林、西馬特羅、沙丁胺醇、菲諾特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、噴布洛爾、苯乙醇胺A、培氟沙星，環(huán)丙沙星，恩諾沙星，氧氟沙星，伊諾沙星、吡哌酸、萘啶酸、西諾沙星、諾氟沙星、達(dá)氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、沙氟沙星、司帕沙星、磺胺鄰二甲氧嘧唆、磺胺嘧唆、磺胺噻唑、磺胺吡唆、磺胺甲基嘧唆、磺胺二甲基噁唑、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺甲噁唑、磺胺氯達(dá)嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺二甲異噁唑、磺胺苯吡唑、磺胺二甲氧嘧啶和磺胺喹噁啉(以下簡(jiǎn)稱46種獸藥)，將加入獸藥后牛肉加入首先用料理機(jī)充分粉碎，冷凍保存；準(zhǔn)確稱取解凍后的牛肉5.0g，置于50mL的離心管中，加入10%三氯乙酸:乙腈提取液(V:V=20:80)10.0mL，充分勻漿后，超聲提取lOmin，IOOOOr.mirT1離心lOmin，上清液轉(zhuǎn)移到另
一50mL離心管中，殘?jiān)儆锰崛∫?0.0mL重復(fù)提取一次，合并提取液，將提取液于30°C下氮?dú)獯蹈?。殘余物用初始流?dòng)相2.0mL溶解，渦旋混勻，以IOOOOr.mirT1的速率高速離心IOmin0取適量上清液，0.45 μ m微孔濾膜過(guò)濾，供UPLC-MS/MS測(cè)定。
[0086]2方法與結(jié)果
[0087]2.1 方法
[0088]2.1.1色譜條件
[0089]色譜柱:Waters Acquity UPLC BEH C18柱；流動(dòng)相為甲醇和0.05%甲酸水溶液，洗脫方式為梯度洗脫，A相為甲醇，B相為0.05%甲酸水溶液，0-10.0min:3.0% A-90.0%A ；10.0-10.1min:90.0 % A-3.0 % A ；10.1-13.0min:3.0% A ;流速為 0.25mL.mirT1 ;柱溫為30°C ;進(jìn)樣量為10 μ L。
[0090]2.1.2質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI+);毛細(xì)管電壓為3.5KV ;錐孔電壓為3.0V ；RF透鏡電壓為0.5V ;源溫為110°C ;脫溶劑溫度為350°C ;脫溶劑氣流速度為650L.h—1 ;錐孔反吹氣流速度為50L.IT1。
[0091]2.2質(zhì)譜條件優(yōu)化
[0092]將所述的46種藥物分別進(jìn)行MS掃描，確定各個(gè)藥物的定性離子和定量離子，并優(yōu)化各個(gè)藥物離子對(duì)的碰撞電壓。為了提高分析的靈敏度和專一性，選用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(Mult1-Reaction Monitoring,MRM)進(jìn)行檢測(cè)，并同時(shí)進(jìn)行定性和定量的雙離子通道分析，進(jìn)而進(jìn)一步提高該方法的定性準(zhǔn)確性和專屬性。46種藥物保留時(shí)間、定性離子對(duì)和定量離子對(duì)列于表I。
[0093]為了增強(qiáng)方法的靈敏度，本研究進(jìn)行多時(shí)間段的多反應(yīng)檢測(cè)掃描，即按照待測(cè)藥物的保留時(shí)間，分為多個(gè)時(shí)間段分別進(jìn)行MRM掃描，以增加每個(gè)藥物的掃描時(shí)間，進(jìn)而提高靈敏度。具體來(lái)說(shuō)，根據(jù)各個(gè)藥物的保留時(shí)間確定監(jiān)測(cè)時(shí)間，得到測(cè)定結(jié)果見表2。
[0094]表I 46種藥物的保留時(shí)間、定性離子對(duì)和定量離子對(duì)
[0095]
【權(quán)利要求】
1.一種獸藥殘留的檢測(cè)方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: (1)樣品的處理: 將待測(cè)樣品進(jìn)行前處理，加入提取劑后進(jìn)行勻漿，勻漿之后進(jìn)行超聲提取，之后進(jìn)行第一次離心分離得到上清液，用氮?dú)鈱⑸锨逡捍蹈珊蟮玫降臍堄辔镉贸跏剂鲃?dòng)相溶解，混勻，之后進(jìn)行第二次離心分離得到上清液，取上清液進(jìn)行微孔濾膜過(guò)濾得到的濾液用于UPLC-MS/MS 測(cè)定； (2)獸藥殘留的測(cè)定 將步驟(1)得到的樣品進(jìn)行超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用的測(cè)定，測(cè)定條件如下: 色譜條件:色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18柱；流動(dòng)相為甲醇和甲酸水溶液，洗脫方式為梯度洗脫； 質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI+);源溫為105°C -115°C ;脫溶劑溫度為340°C -360°C ；脫溶劑氣流速度為600L.dOOL.h—1 ;錐孔反吹氣流速度為45L..h—1。
2.如權(quán)利要求1所述的獸藥殘留的檢測(cè)方法，其中所述獸藥為四環(huán)素類藥物、β受體激動(dòng)劑類藥物、喹諾酮類藥物和/或磺胺類藥物。
3.如權(quán)利要求1或2所述的獸藥殘留的檢測(cè)方法，其中所述獸藥為四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素、特步他林、西馬特羅、沙丁胺醇、菲諾特羅、萊克多巴胺、氯丙那林、克倫特羅、妥布特羅、噴布洛爾、苯乙醇胺Α、培氟沙星，環(huán)丙沙星，恩諾沙星，氧氟沙星，伊諾沙星、吡哌酸、萘啶酸、西諾沙星、諾氟沙星、達(dá)氟沙星、洛美沙星、二氟沙星、沙氟沙星、司帕沙星、磺胺鄰二甲氧嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基噁唑、磺胺對(duì)甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噻二唑、磺胺甲氧噠嗪、磺胺甲噁唑、磺胺氯達(dá)嗪、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺二甲異噁唑、磺胺苯吡唑、磺胺二甲氧嘧啶和/或磺胺喹噁啉中的一種、幾種或全部。
4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的獸藥殘留的檢測(cè)方法，步驟(2)所述梯度洗脫程序?yàn)? 0-10.0min:甲醇的體積比為3.0% -90.0% ； 10.0-10.1min:甲醇的體積比為 90.0% -3.0% ； 10.1-13.0min:甲醇的體積比為3.0%。
5.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的獸藥殘留的檢測(cè)方法，其中步驟(1)所述氮?dú)獯蹈缮锨逡旱臏囟葹?5°C -35°C，優(yōu)選在30°C下進(jìn)行。
6.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的獸藥殘留的檢測(cè)方法，其中步驟(1)所述第一次離心和第二次離心的轉(zhuǎn)速為9000r.min_1-l1000r.mirf1,離心的時(shí)間為8min-12min,優(yōu)選所述第一次離心和第二次離心的轉(zhuǎn)速為1000Or.min—1，離心的時(shí)間為lOmin。
7.如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的獸藥殘留的檢測(cè)方法，其中步驟(1)所述提取劑為10%三氯乙酸水溶液與乙腈的混合溶液；優(yōu)選兩者的體積比例為10%三氯乙酸水溶液:乙腈=(15~25):(75~85);更優(yōu)選兩者的體積比例為10%三氯乙酸水溶液:乙腈=20:80。
8.如權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的獸藥殘留的檢測(cè)方法，其中步驟(1)所述在第一次離心分離后得到上清液的同時(shí)得到沉淀，對(duì)沉淀進(jìn)行再次提取和分離，得到上清液與第一次離心分離得到的上清液進(jìn)行合并，將合并后的上清液進(jìn)行下一步驟的氮?dú)獯蹈伞?br> 9.如權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的獸藥殘留的檢測(cè)方法，其中步驟(2)的甲酸水溶液的體積濃度為0.04% -0.07%，優(yōu)選體積濃度為0.05%。
10.如權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的獸藥殘留的檢測(cè)方法，其中步驟(2)所述色譜條件:色譜柱為Waters Acquity UPLC BEH C18柱；流動(dòng)相為甲醇和甲酸水溶液，洗脫方式為梯度洗脫;流速為0.25mL.min—1 ;柱溫為30。。。 質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI+);毛細(xì)管電壓為3.5KV;錐孔電壓為3.0V;RF透鏡電壓為0.5V ;源溫為110°C ;脫溶劑溫度為350°C ;脫溶劑氣流速度為650L.;錐孔反吹氣流速度為50L.h-1
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103760269SQ201410032399
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月23日
【發(fā)明者】王海, 田亞平, 姜艷彬, 單吉浩 申請(qǐng)人:姜艷彬, 田亞平