對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明是將硅納米線或硅納米線有序陣列進行表面活化后，再依次與3-2-（2-氨基乙基氨基）乙基氨基丙基三甲氧基硅烷和丹磺酰氯進行反應(yīng)，實現(xiàn)硅納米線或硅納米線有序陣列的表面功能化修飾，從而得到所述的熒光化學傳感器。本發(fā)明的熒光化學傳感器可用于含有游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子的普通溶液體系及生物體系中的游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子的檢測，也可以將所述的熒光化學傳感器作為細胞生長的基底，構(gòu)筑載有細胞的活性檢測芯片，并利用其實時、原位觀察細胞凋亡過程中游離態(tài)和絡(luò)合態(tài)銅離子的釋放。
【專利說明】對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米結(jié)構(gòu)的熒光化學傳感器領(lǐng)域，特別涉及對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器及其制備方法，以及該熒光化學傳感器的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]作為人體當中含量最多的金屬離子之一，銅離子在調(diào)節(jié)人體生理過程中發(fā)揮著非常重要的作用。在生物體中，大多數(shù)銅離子都是以絡(luò)合態(tài)形式存在:一部分銅離子和一些特定的蛋白質(zhì)結(jié)合，一部分和眾多的小分子營養(yǎng)物質(zhì)結(jié)合。這些銅離子絡(luò)合物在生物催化過程中起到了至關(guān)重要的作用。盡管生物體中銅離子的總濃度大體高達100微摩爾，但是游離態(tài)的銅離子卻非常少，甚至每個細胞中不到一個。近年來相繼發(fā)展了眾多的用來檢測銅離子的熒光傳感器，但是這些傳感器大都是針對于游離態(tài)銅離子的檢測，對絡(luò)合態(tài)銅離子的檢測方法還比較匱乏。因此，為了更好的研究銅離子在生物體系中的作用，僅靠高靈敏的游離態(tài)銅離子熒光傳感器是遠遠不夠的，更重要的是發(fā)展能夠應(yīng)用于絡(luò)合態(tài)銅離子檢測的優(yōu)良熒光傳感器。能夠應(yīng)用于絡(luò)合態(tài)銅離子檢測的有效方法之一，就是設(shè)計一個對游離態(tài)銅離子具有足夠強的絡(luò)合能力的熒光傳感器。當該熒光化學傳感器存在于含有絡(luò)合態(tài)銅離子的體系中時，它能夠輕易的從銅絡(luò)合物中奪出銅離子并和這些銅離子發(fā)生絡(luò)合作用，進一步促使該熒光化學傳感器自身的熒光信號發(fā)生改變，從而根據(jù)傳感器熒光信號的改變來實現(xiàn)絡(luò)合態(tài)銅離子的檢測。同時該熒光傳感器對銅離子的檢測還應(yīng)具有高選擇性、高靈敏性等優(yōu)點，能夠有效避免其它金屬離子及生物體系中的活性生物分子對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子檢測的干擾。
[0003]近年來的研究表明，通過將具有高選擇性識別能力的有機分子或生物分子固定到一維納米材料的表面，可以極大的提高一些突光傳感器的選擇性和靈敏度。在眾多的一維納米材料中，硅納米線由于具有無毒性、生物兼容性好以及利于集成等優(yōu)點，已經(jīng)被廣泛的應(yīng)用于熒光傳感器的構(gòu)筑，并且這些傳感器都展現(xiàn)出了良好的檢測性能。同時硅納米線的有序陣列不僅可以自發(fā)的穿透細胞膜，而且還可以增強細胞和基底之間的粘附力起到固定細胞的作用，因此被成功的應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)導(dǎo)、支架結(jié)構(gòu)以及抗菌材料等領(lǐng)域中?；谝陨系目紤]，本發(fā)明首先將有機小分子物質(zhì)3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷修飾到硅納米線或硅納米線有序陣列的表面，之后再通過表面修飾有3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷的硅納米線或硅納米線有序陣列表面的氨基和丹磺酰氯反應(yīng)，得到了經(jīng)過表面修飾的對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器，該熒光化學傳感器不僅能夠應(yīng)用于普通溶液和生物體系中游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子的檢測，并能進一步將其作為細胞生長的基底，構(gòu)筑載有細胞的活性檢測芯片，并利用該芯片實時、原位檢測細胞凋亡過程中釋放的游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的之一是提供對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器。
[0005]本發(fā)明的目的之二是提供對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器的制備方法。
[0006]本發(fā)明的目的之三是提供對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器在生物檢測方面的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器，是將硅納米線(可用化學氣相沉積法制備得到)或硅納米線有序陣列(可用化學刻蝕法制備得到)進行表面活化后，再依次與3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷和丹磺酰氯進行反應(yīng)，實現(xiàn)硅納米線或硅納米線有序陣列的表面功能化修飾，從而得到對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器。本發(fā)明的對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器可用于含有游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子的普通溶液體系及生物體系中的游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子的檢測，也可以將對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器作為細胞生長的基底，構(gòu)筑載有細胞的活性檢測芯片，并利用其實時、原位觀察細胞凋亡過程中游離態(tài)和絡(luò)合態(tài)銅離子的釋放。
[0008]本發(fā)明的對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器，是將表面活化的硅納米線或硅納米線有序陣列和3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷反應(yīng)，得到表面修飾有3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷的硅納米線或硅納米線有序陣列，并利用3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷修飾的硅納米線或硅納米線有序陣列表面的氨基與丹磺酰氯分子中的酰氯鍵發(fā)生取代反應(yīng)，將得到的表面修飾有3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷的硅納米線或硅納米線有序陣列與丹磺酰氯反應(yīng)，使3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷和丹磺酰氯的反應(yīng)產(chǎn)物修飾在硅納米線或硅納米線陣列的表面后得到的。
[0009]所述的表面活化的硅納米線中的硅納米線是由化學氣相沉積法得到的不同尺寸的娃納米線，優(yōu)選直徑為5?15nm的娃納米線。
[0010]所述的表面活化的硅納米線有序陣列中的硅納米線有序陣列是由化學刻蝕法得到的不同尺寸的硅納米線有序陣列，優(yōu)選硅納米線有序陣列中的硅納米線的直徑為100?250nm,長度為5?30 μ m。
[0011]本發(fā)明的對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器的制備方法包括以下步驟:
[0012]I)將硅納米線(可用化學氣相沉積法制備得到)置于溫度為75?90°C的體積比為1:2?9:1的濃硫酸(質(zhì)量濃度為98%)與H2O2的混合液中加熱30?180分鐘，冷卻至室溫，取出硅納米線并水洗至中性；室溫下將硅納米線置于體積比為2:1:1?8:1:1的H20:H202:NH40H的混合液中(一般硅納米線在混合液中的時間為0.5?3小時)，然后取出硅納米線并水洗至中性，真空干燥，得到表面經(jīng)活化的硅納米線；[0013]或?qū)⒐杓{米線有序陣列(可用化學刻蝕法制備得到)置于溫度為75?95°C的體積比為1:1?9:1的濃硫酸(質(zhì)量濃度為98%)與H2O2的混合液中加熱30?180分鐘，冷卻至室溫，取出硅納米線有序陣列并水洗至中性；然后將硅納米線有序陣列置于氧等離子體系統(tǒng)中進行處理(處理條件:氧氣的質(zhì)量含量為5?100%，電壓為100?700伏，時間為5秒?8分鐘，溫度為15?45°C)，得到表面經(jīng)活化的硅納米線有序陣列；
[0014]2)在反應(yīng)器中加入5?IOOmg干燥的步驟I)得到的表面經(jīng)活化的硅納米線或硅納米線有序陣列、2.5?50mL的無水甲苯和0.05?0.6mL的3_2_ (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷，在惰性氣體保護下加熱至75?125°C后，恒溫反應(yīng)10?40小時，冷卻至室溫，收集硅納米線或硅納米線有序陣列，用有機溶劑超聲清洗除去未反應(yīng)的3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷，得到表面修飾有3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷的硅納米線或硅納米線有序陣列；
[0015]3)將5?IOOmg步驟2)得到的表面修飾有3_2_ (2_氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷的硅納米線或硅納米線有序陣列置于裝載有5?15mL的二氯甲烷的反應(yīng)器中，隨后加入0.05?1.0mL的三乙胺,室溫攪拌(一般攪拌的時間為5?80分鐘),之后逐滴加入丹磺酰氯的二氯溶液I?IOmL (優(yōu)選丹磺酰氯的濃度為0.05?8mmol/L)，室溫下攪拌反應(yīng)(一般攪拌反應(yīng)的時間為0.5?6小時)，通過3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷修飾的硅納米線或硅納米線有序陣列表面的氨基與丹磺酰氯分子中的酰氯鍵發(fā)生取代反應(yīng)，得到表面修飾有3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷和丹磺酰氯的反應(yīng)產(chǎn)物的硅納米線或硅納米線有序陣列；然后用有機溶劑反復(fù)超聲清洗除去未反應(yīng)的丹磺酰氯，得到對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器。
[0016]步驟I)中的硅納米線是由化學氣相沉積法得到的不同尺寸的硅納米線，優(yōu)選直徑為5?15nm的娃納米線。
[0017]步驟I)中的硅納米線有序陣列是由化學刻蝕法得到的不同尺寸的硅納米線有序陣列，優(yōu)選硅納米線有序陣列中的硅納米線的直徑為100?250nm，長度為5?30 μ m。
[0018]所述的無水甲苯優(yōu)選是新蒸的無水甲苯。
[0019]所述的清洗用的有機溶劑可以是常用的有機溶劑，如甲醇、乙醇或丙酮。
[0020]本發(fā)明中所述的由化學氣相沉積法制備硅納米線的方法可是:室溫下，將一氧化硅經(jīng)研缽研磨后放入瓷舟中，并將瓷舟放在石英管的中部，推入真空管式爐中；系統(tǒng)先用機械泵和分子泵抽至l(T3Pa,隨后以10?40sccm (mL/min)的流速通入IS氣(占混合氣體的體積95% )與氫氣(占混合氣體的體積5% )的混合氣體，當壓力穩(wěn)定在750?IOOOOPa時，系統(tǒng)開始升溫；系統(tǒng)以10?25°C /min升至300°C，再以10?25°C /min升溫至800°C，此時關(guān)閉氣閥和泵閘，保溫10?40分鐘后繼續(xù)升溫至1350°C，在1350°C下反應(yīng)3?10小時后，自然冷卻至室溫，在瓷舟的兩側(cè)收集產(chǎn)物硅納米線。
[0021]本發(fā)明中所述的由化學刻蝕法制備硅納米線有序陣列的方法可是:取不同尺寸的(100)硅片，依次用乙醇、丙酮、蒸餾水進行超聲清洗5?35分鐘；之后將該硅片置于質(zhì)量濃度為I?6%的HF水溶液中25秒?20分鐘；取出硅片后置于含有濃度為3?IOmmol/L的AgNO3和2?8mol/L的HF的混合水溶液中I?10分鐘；取出硅片后浸入含有濃度為I?10mol/L的HF和0.05?0.8mol/L的H2O2的混合水溶液中，在25?65°C的水浴保溫5?55分鐘；將取出的硅片放入濃鹽酸(質(zhì)量濃度為36%):濃硝酸(質(zhì)量濃度為36%)的體積比為3:1的混合液中，浸泡0.5?3小時，取出硅片并用蒸餾水沖洗后自然晾干，得到由娃納米線構(gòu)成的娃納米線陣列。
[0022]本發(fā)明的對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器可用于含有游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子的普通溶液體系或生物體系(肝臟提取液或細胞培養(yǎng)液)中的游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子的檢測；也可以將對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器作為細胞生長的基底，在所述的熒光化學傳感器的表面上得到生長的細胞，構(gòu)筑載有細胞的活性檢測芯片，并利用該芯片實時、原位檢測細胞凋亡過程中釋放的游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子。
[0023]所述的用于含有游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子的普通溶液體系或生物體系(肝臟提取液或細胞培養(yǎng)液)中的游離態(tài)銅離子或絡(luò)合態(tài)銅離子的檢測，是將所述的熒光化學傳感器置于待檢測的普通溶液體系或生物體系(肝臟提取液或細胞培養(yǎng)液)中作為熒光檢測的活性檢測基底，用熒光光譜儀或者激光共聚焦顯微鏡檢測在待檢測的普通溶液體系或生物體系(肝臟提取液或細胞培養(yǎng)液)中所述的熒光化學傳感器的熒光特征峰強度，通過比較在待檢測的普通溶液體系或生物體系(肝臟提取液或細胞培養(yǎng)液)中所述的熒光化學傳感器的熒光特征峰強度和該熒光化學傳感器對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子檢測的定標曲線中的熒光特征峰強度，定量檢測出待檢測的普通溶液體系或生物體系(肝臟提取液或細胞培養(yǎng)液)中的游離態(tài)銅離子濃度和絡(luò)合態(tài)銅離子濃度。即，在有游離態(tài)銅離子或絡(luò)合態(tài)銅離子存在的體系中，所述的基于硅納米線的化學傳感器的熒光會被猝滅，通過繪制游離態(tài)銅離子或絡(luò)合態(tài)銅離子的濃度和熒光特征峰強度的定標曲線，憑借作為活性檢測基底的本發(fā)明的熒光化學傳感器的高選擇性和靈敏度，由所述的熒光化學傳感器檢測到的熒光特征峰的強度確定體系中游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子的濃度，可以定量檢測出待檢測的普通溶液體系或生物體系(肝臟提取液或細胞培養(yǎng)液)中的游離態(tài)銅離子濃度或絡(luò)合態(tài)銅離子濃度，檢測的濃度范圍為Onm?5μΜ。
[0024]結(jié)果表明本發(fā)明的對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器的熒光強度隨著普通溶液體系或生物體系中的游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子濃度的升高而降低。通過繪制得到游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子的濃度和本發(fā)明的基于硅納米線的熒光化學傳感器的熒光特征峰強度的關(guān)系，得到該熒光化學傳感器對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子檢測的定標曲線。
[0025]所述的熒光光譜儀中所用的激發(fā)光源為氙燈，激發(fā)波長為350?500nm。
[0026]所述的激光共聚焦顯微鏡中的激光器的激發(fā)波長為405nm。
[0027]所述的普通溶液體系可以是磷酸緩沖液或HEPES緩沖液等。
[0028]所述的生物體系可以是動物肝臟提取液或是細胞培養(yǎng)液等。
[0029]所述的實時、原位檢測細胞凋亡過程中釋放的游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子，是將所述的構(gòu)筑載有細胞的活性檢測芯片倒置于共聚焦培養(yǎng)皿中，然后加入能夠使細胞發(fā)生消化、凋亡的生物試劑或化學試劑，使細胞凋亡，細胞在凋亡的過程中會逐漸釋放出銅離子(包括游離態(tài)和絡(luò)合態(tài))，從而引起所述的熒光化學傳感器所發(fā)射的綠色熒光被猝滅，由此可通過觀察生物試劑或化學試劑中所述的熒光化學傳感器所發(fā)射的綠色熒光被猝滅，實時、原位檢測細胞凋亡過程中釋放的游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子。
[0030]所述的生物試劑如胰蛋白酶。
[0031]所述的化學試劑如乙醇、甲醇、丙酮或甲苯等有機溶劑。
[0032]所述的絡(luò)合態(tài)銅離子可以是含有銅離子的絡(luò)合物如(EDTA-Cu)，也可以是含有銅離子的生物活性分子(如超氧化物歧化酶)。
[0033]本發(fā)明的對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器，無論在游離態(tài)銅離子還是絡(luò)合態(tài)銅離子的檢測中都顯示了良好的選擇性和高的靈敏性，可以實現(xiàn)待測體系中銅離子(游離態(tài)和絡(luò)合態(tài))的定量檢測，為進一步的研究生物體系中銅離子的生理作用提供了很好的方便。本發(fā)明的對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器，由于結(jié)構(gòu)中包含有對銅離子具有強的絡(luò)合能力的基團，因此能夠有效和銅離子發(fā)生作用，從而避免其它金屬離子和生物活性分子對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子檢測的干擾。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0034]圖1.本發(fā)明實施例1中化學氣相沉積法得到的硅納米線的HRTEM照片。
[0035]圖2.本發(fā)明實施例2中化學刻蝕法得到的硅納米線陣列的SEM照片。
[0036]圖3.本發(fā)明實施例1?4的硅納米線或硅納米線陣列的修飾過程示意圖。
[0037]圖4.本發(fā)明實施例3的基于硅納米線的熒光化學傳感器在不同濃度的游離態(tài)銅離子溶液中的熒光特征峰曲線。
[0038]圖5.本發(fā)明實施例3中的以基于硅納米線的熒光化學傳感器的熒光特征峰為特征峰，以游離態(tài)銅離子濃度作標準曲線，得到基于硅納米線的熒光化學傳感器的熒光特征峰強度隨游離態(tài)銅離子濃度的變化的線性曲線。
[0039]圖6.本發(fā)明實施例1的基于硅納米線的熒光化學傳感器在不同濃度的絡(luò)合態(tài)銅離子(超氧化物歧化酶S0D)溶液中的熒光特征峰曲線。
[0040]圖7.本發(fā)明實施例1中的基于硅納米線的熒光化學傳感器的熒光特征峰為特征峰，以絡(luò)合態(tài)銅離子濃度(超氧化物歧化酶S0D)作標準曲線，得到基于硅納米線的熒光化學傳感器的熒光特征峰強度隨絡(luò)合態(tài)銅離子濃度(超氧化物歧化酶S0D)的變化的線性曲線。
[0041]圖8.本發(fā)明實施例3中的基于硅納米線的熒光化學傳感器的熒光特征峰為特征峰，以肝臟提取液的體積作標準曲線，得到基于硅納米線的熒光化學傳感器的熒光特征峰強度隨肝臟提取液的體積的變化的線性曲線。
[0042]圖9a.本發(fā)明實施例4中的實時原位監(jiān)測細胞凋亡過程中銅離子的釋放的熒光共聚焦圖像；其中圖中的a)、b)和c)為細胞在加入胰蛋白酶后O分鐘、10分鐘和20分鐘后的熒光照片；d)、e)和f)為活性芯片在加入胰蛋白酶后O分鐘、10分鐘和20分鐘后的熒光共聚焦顯微鏡照片。
[0043]圖9b.為圖9a中藍色熒光(細胞熒光)強度隨時間的變化曲線。
[0044]圖9c.為圖9a中綠色熒光(活性芯片熒光)強度隨時間的變化曲線。
【具體實施方式】
[0045]實施例1[0046]I)硅納米線的制備:
[0047]室溫下，將一氧化硅經(jīng)研缽研磨后放入瓷舟中，并將瓷舟放在石英管的中部，推入真空管式爐中；系統(tǒng)先用機械泵和分子泵抽至10_3Pa,隨后以IOsccm (mL/min)的流速通入氬氣(占混合氣體的體積95% )與氫氣(占混合氣體的體積5% )的混合氣體，當壓力穩(wěn)定在IOOOOPa時，系統(tǒng)開始升溫；系統(tǒng)以25°C /min升至300°C，再以25°C /min升溫至800°C，此時關(guān)閉氣閥和泵閘，保溫10分鐘后繼續(xù)升溫至1350°C，在1350°C下反應(yīng)10小時后，自然冷卻至室溫，在瓷舟的兩側(cè)收集產(chǎn)物硅納米線，硅納米線的直徑為5?15nm，硅納米線的HRTEM照片如圖1所示；
[0048]2)硅納米線的表面活化:
[0049]將步驟I)用化學氣相沉積法制備得到的硅納米線置于溫度為75°C的體積比為9:1的濃硫酸(質(zhì)量濃度為98%)與H2O2的混合液中加熱180分鐘，冷卻至室溫，取出硅納米線并水洗至中性；室溫下將硅納米線置于體積比為8:1:1的H2O:H2O2:NH4OH的混合液中3小時，然后取出硅納米線并水洗至中性，真空干燥，得到表面經(jīng)活化的硅納米線；
[0050]3)硅納米線的修飾(修飾過程示意圖如圖3所示):
[0051]在反應(yīng)器中加入5mg干燥的步驟2)得到的表面經(jīng)活化的硅納米線、2.5mL的無水甲苯和0.05mL的3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷，在氬氣保護下加熱至125°C后，恒溫反應(yīng)10小時，冷卻至室溫，收集硅納米線，用甲醇超聲清洗除去未反應(yīng)的3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷，得到表面修飾有3-2- (2-氨基乙基氣基)乙基氣基丙基二甲氧基娃燒的娃納米線；
[0052]將5mg上述得到的表面修飾有3-2- (2_氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷的硅納米線置于裝載有5mL的二氯甲烷的反應(yīng)器中，隨后加入0.05mL的三乙胺，室溫攪拌5分鐘，之后逐滴加入丹磺酰氯的二氯溶液ImL(丹磺酰氯的濃度為0.05mmol/L)，室溫下攪拌反應(yīng)0.5小時。通過3-2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷修飾的硅納米線表面的氨基與丹磺酰氯分子中的酰氯鍵發(fā)生取代反應(yīng)，從而得到表面修飾有3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷和丹磺酰氯的反應(yīng)產(chǎn)物的硅納米線；用甲醇反復(fù)超聲清洗除去未反應(yīng)的丹磺酰氯，得到對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器。
[0053]將上述得到的對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器作為熒光檢測的基底，聯(lián)用熒光光譜儀，對具有不同游離態(tài)銅離子濃度和絡(luò)合態(tài)銅離子濃度的溶液體系進行熒光檢測，激發(fā)光源為氙燈。將所述的熒光化學傳感器分散在PH值為7.4的HEPES緩沖液中，之后逐漸于該體系中加入絡(luò)合態(tài)銅離子(超氧化物歧化酶)，并對上述具有不同濃度絡(luò)合態(tài)銅離子的溶液體系進行熒光檢測，發(fā)現(xiàn)隨著絡(luò)合態(tài)銅離子濃度的增加，上述溶液體系的熒光特征峰的強度逐漸減弱，如圖6所示，其中縱坐標為傳感器的熒光特征峰強度，橫坐標為發(fā)射光的波長。熒光特征峰的強度和絡(luò)合態(tài)銅離子的濃度呈線性關(guān)系，從而繪制了熒光特征峰的強度和絡(luò)合態(tài)銅離子濃度的線性定標曲線，如圖7所示，其中縱坐標為所述的熒光化學傳感器的熒光特征峰強度，橫坐標為絡(luò)合態(tài)銅離子的濃度。根據(jù)所述的熒光化學傳感器在分散的溶液體系中檢測到的熒光特征峰的強度確定被檢測溶液體系中的絡(luò)合態(tài)銅離子的濃度，從而實現(xiàn)對溶液體系中絡(luò)合態(tài)銅離子濃度的檢測。[0054]取新鮮的小鼠肝臟，稱重6.5克，于2mL除菌的PBS緩沖液中攪勻，于4000rpm離心15分鐘，取上層清液，于4000rpm離心15分鐘，收集清液，得到肝臟提取液，冷凍保存。
[0055]將上述得到的對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器作為熒光檢測的基底，聯(lián)用熒光光譜儀，對動物肝臟提取液中的銅離子進行熒光檢測，激發(fā)光源為氙燈。將所述的熒光化學傳感器分散在PH值為7.4的HEPES緩沖液中，之后逐漸于該體系中加入動物肝臟提取液，并對上述具有不同肝臟提取液濃度的溶液體系進行熒光檢測，發(fā)現(xiàn)隨著肝臟提取液的增加，上述溶液體系中的熒光特征峰的強度逐漸減弱。
[0056]實施例2
[0057]I)硅納米線有序陣列的制備:
[0058]取0.5cmX 3cm的(100)娃片，依次用乙醇、丙酮、蒸懼水進行超聲清洗5?35分鐘；之后將該娃片置于質(zhì)量濃度為1%的HF水溶液中20分鐘；取出娃片后置于含有濃度為3mmol/L的AgNO3和2mol/L的HF的混合水溶液中10分鐘；取出硅片后浸入含有濃度為lmol/L的HF和0.05mol/L的H2O2的混合水溶液中，在65°C的水浴保溫55分鐘；將取出的硅片放入濃鹽酸(質(zhì)量濃度為36%):濃硝酸(質(zhì)量濃度為36%)的體積比為3:1的混合液中，浸泡3小時，取出硅片并用蒸餾水沖洗后自然晾干，得到由硅納米線構(gòu)成的硅納米線有序陣列，硅納米線有序陣列的SEM照片如圖2所示，其中:左邊的圖為硅納米線陣列的俯視圖，右邊的圖為硅納米線陣列的側(cè)面圖；硅納米線有序陣列中的硅納米線的直徑為100?250nm,長度為5?30 μ m ;
[0059]2)硅納米線有序陣列的表面活化:
[0060]將步驟I)用化學刻蝕法制備得到的硅納米線有序陣列置于溫度為75?95°C的體積比為1:1的濃硫酸(質(zhì)量濃度為98%)與H2O2的混合液中加熱30分鐘，冷卻至室溫，取出硅納米線有序陣列并水洗至中性；然后將硅納米線有序陣列置于氧等離子體系統(tǒng)中進行處理(處理條件:氧氣的質(zhì)量含量為5%，電壓為100伏，時間為8分鐘，溫度為15°C)，得到表面經(jīng)活化的硅納米線有序陣列；
[0061]3)硅納米線陣列的修飾(修飾過程示意圖如圖3所示):
[0062]在反應(yīng)器中加入55mg干燥的步驟2)得到的表面經(jīng)活化的硅納米線有序陣列、
2.5mL的無水甲苯和0.05mL的3_2_ (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷，在氬氣保護下加熱至75°C后，恒溫反應(yīng)10小時，冷卻至室溫，收集硅納米線有序陣列，用乙醇超聲清洗除去未反應(yīng)的3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷，得到表面修飾有3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷的硅納米線有序陣列。
[0063]將上述得到的表面修飾有3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷的硅納米線有序陣列置于裝載有5mL的二氯甲烷的反應(yīng)器中，隨后加入0.05mL的三乙胺，室溫攪拌80分鐘，之后逐滴加入丹磺酰氯的二氯溶液ImL (丹磺酰氯的濃度為0.05mmol/L),室溫下攪拌反應(yīng)0.5小時；通過3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷修飾的硅納米線有序陣列表面的氨基與丹磺酰氯分子中的酰氯鍵發(fā)生取代反應(yīng)，從而得到表面修飾有3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷和丹磺酰氯的反應(yīng)產(chǎn)物的硅納米線有序陣列；用乙醇反復(fù)超聲清洗除去未反應(yīng)的丹磺酰氯，得到對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線陣列的熒光化學傳感器。[0064]將上述得到的對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線陣列的熒光化學傳感器切成0.5厘米X0.5厘米的方形，并用質(zhì)量濃度為75%的酒精消毒，取其中的一片，將其置于24孔細胞培養(yǎng)板的一個孔中，并在該孔中加入I毫升細胞濃度為IO6個細胞/毫升的A549細胞懸浮液，將細胞培養(yǎng)板置于細胞培養(yǎng)箱中(CO2:5% ;溫度:37°C)進行細胞培養(yǎng)，15小時之后，取出生長有A549細胞的活性芯片，用除菌的PBS緩沖液(pH7.4)洗滌三次。為了便于細胞的觀察，之后將生長有A549細胞的活性芯片轉(zhuǎn)移至另外一個干凈的孔中，并于該孔中加入I毫升DMEM細胞培養(yǎng)液，再向該孔中加入1.5微升2微克/毫升的DAPI水溶液，于細胞培養(yǎng)箱中(CO2:5% ;溫度:37°C )中孵育15分鐘之后，用除菌的PBS緩沖液(pH7.4)洗滌五次，得到生長有經(jīng)過DAPI染色的A549細胞的活性芯片。
[0065]將上述得到的生長有A549細胞的活性芯片倒置于盛有ImL胰蛋白酶的共聚焦培養(yǎng)皿中，再聯(lián)用激光共聚焦顯微鏡，對A549細胞凋亡過程中銅離子的釋放過程進行實時、原位的檢測。用405nm的激光激發(fā)，立即檢測隨著時間的變化，A549細胞和基底熒光的變化，發(fā)現(xiàn)隨著時間的增加，A549細胞逐漸凋亡，活性芯片的熒光強度逐漸減弱。
[0066]實施例3
[0067]I)硅納米線的制備:
[0068]室溫下，將一氧化硅經(jīng)研缽研磨后放入瓷舟中，并將瓷舟放在石英管的中部，推入真空管式爐中；系統(tǒng)先用機械泵和分子泵抽至10_3Pa,隨后以40sccm (mL/min)的流速通入氬氣(占混合氣體的體積95% )與氫氣(占混合氣體的體積5% )的混合氣體，當壓力穩(wěn)定在750Pa時，系統(tǒng)開始升溫；系統(tǒng)以10°C/min升至300°C，再以10°C/min升溫至800°C，此時關(guān)閉氣閥和泵閘，保溫40分鐘后繼續(xù)升溫至1350°C，在1350°C下反應(yīng)3時后，自然冷卻至室溫，在瓷舟的兩側(cè)收集產(chǎn)物硅納米線，硅納米線的直徑為5?15nm ；
[0069]2)硅納米線表面活化:
[0070]將用化學氣相沉積法制備得到的硅納米線置于溫度為90°C的體積比為9:1的濃硫酸(質(zhì)量濃度為98%)與H2O2的混合液中加熱30分鐘，冷卻至室溫，取出硅納米線并水洗至中性；室溫下將硅納米線置于體積比為2:1:1的H2O = H2O2 = NH4OH的混合液中0.5小時，然后取出硅納米線并水洗至中性，真空干燥，得到表面經(jīng)活化的硅納米線；
[0071]3)硅納米線的修飾(修飾過程示意圖如圖3所示):
[0072]在反應(yīng)器中加入IOOmg干燥的步驟2)得到的表面經(jīng)活化的硅納米線、50mL的無水甲苯和6mL的3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷，在氬氣保護下加熱至75°C后，恒溫反應(yīng)40小時，冷卻至室溫，收集硅納米線，用丙酮超聲清洗除去未反應(yīng)的3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷，得到表面修飾有3-2- (2-氨基乙基氣基)乙基氣基丙基二甲氧基娃燒的娃納米線；
[0073]將IOOmg上述得到的表面修飾有3_2_ (2_氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷的硅納米線置于裝載有15mL的二氯甲烷的反應(yīng)器中，隨后加入ImL的三乙胺，室溫攪拌80分鐘，之后逐滴加入丹磺酰氯的二氯溶液IOmL (丹磺酰氯的濃度為8mmol/L)，室溫下攪拌反應(yīng)6小時。通過3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷修飾的硅納米線表面的氨基與丹磺酰氯分子中的酰氯鍵發(fā)生取代反應(yīng)，從而得到表面修飾有3-2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷和丹磺酰氯的反應(yīng)產(chǎn)物的硅納米線；用丙酮反復(fù)超聲清洗除去未反應(yīng)的丹磺酰氯，得到對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器。
[0074]將上述得到的對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器作為熒光檢測的基底，聯(lián)用熒光光譜儀，對具有不同游離態(tài)銅離子濃度和絡(luò)合態(tài)銅離子濃度的溶液體系進行熒光檢測，激發(fā)光源為氙燈。將所述的熒光化學傳感器分散在PH值為7.4的HEPES緩沖液中，之后逐漸于該體系中加入游離態(tài)銅離子，并對上述具有不同游離態(tài)銅離子濃度的溶液體系進行熒光檢測，發(fā)現(xiàn)隨著游離態(tài)銅離子濃度的增加，上述溶液體系的熒光特征峰的強度逐漸減弱，如圖4所示，其中縱坐標為傳感器的熒光特征峰強度，橫坐標為發(fā)射光的波長。熒光特征峰的強度和游離態(tài)銅離子的濃度呈線性關(guān)系，從而繪制了熒光特征峰的強度和游離態(tài)銅離子濃度的線性定標曲線，如圖5所示，其中縱坐標為所述的熒光化學傳感器的熒光特征峰強度，橫坐標為游離態(tài)銅離子的濃度。根據(jù)所述的熒光化學傳感器在分散的溶液體系中檢測到的熒光特征峰的強度確定被檢測溶液體系中的游離態(tài)銅離子的濃度，從而實現(xiàn)對溶液體系中游離態(tài)銅離子濃度的檢測。
[0075]取新鮮的小鼠肝臟，稱重10克，于2mL除菌的PBS緩沖液中攪勻，于4000rpm離心15分鐘，取上層清液，于4000rpm離心15分鐘，收集清液，得到肝臟提取液，冷凍保存。
[0076]將上述得到的對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器作為熒光檢測的基底，聯(lián)用熒光光譜儀，對動物肝臟提取液中的銅離子進行熒光檢測，激發(fā)光源為氙燈。將所述的熒光化學傳感器分散在PH值為7.4的HEPES緩沖液中，之后逐漸于該體系中加入動物肝臟提取液，并對上述具有不同肝臟提取液濃度的溶液體系進行熒光檢測，發(fā)現(xiàn)隨著肝臟提取液的增加，上述溶液體系的熒光特征峰的強度逐漸減弱，如圖8所示，其中縱坐標為所述的熒光化學傳感器的熒光特征峰強度，橫坐標為發(fā)射光的波長。
[0077]實施例4
[0078]I)硅納米線有序陣列的制備:
[0079]取lcmX4cm的(100)硅片，依次用乙醇、丙酮、蒸餾水進行超聲清洗35分鐘；之后將該硅片置于質(zhì)量濃度為6%的HF水溶液中25秒；取出硅片后置于含有濃度為lOmmol/L的AgNO3和8mol/L的HF的混合水溶液中I分鐘；取出硅片后浸入含有濃度為lOmol/L的HF和0.8mol/L的H2O2的混合水溶液中，在25°C的水浴保溫55分鐘；將取出的硅片放入濃鹽酸(質(zhì)量濃度為36%):濃硝酸(質(zhì)量濃度為36%)的體積比為3:1的混合液中，浸泡0.5小時，取出硅片并用蒸餾水沖洗后自然晾干，得到由硅納米線構(gòu)成的硅納米線有序陣列；硅納米線有序陣列中的硅納米線的直徑為100?250nm，長度為5?30 μ m ;
[0080]2)硅納米線有序陣列的表面活化:
[0081]將步驟I)用化學刻蝕法制備得到的硅納米線有序陣列置于溫度為95°C的體積比為9:1的濃硫酸(質(zhì)量濃度為98%)與H2O2的混合液中加熱180分鐘，冷卻至室溫，取出硅納米線有序陣列水洗至中性。然后將硅納米線有序陣列置于氧等離子體系統(tǒng)中進行處理(處理條件:氧氣的質(zhì)量含量為100%，電壓為700伏，時間為5秒，溫度為45°C )，得到表面經(jīng)活化的硅納米線有序陣列；
[0082]3)硅納米線有序陣列的修飾(修飾過程示意圖如圖3所示):
[0083]在反應(yīng)器中加入45mg干燥的步驟2)得到的表面經(jīng)活化的硅納米線有序陣列、50mL的無水甲苯和0.6mL的3_2_ (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷，在惰性氣體保護下加熱至125°C后，恒溫反應(yīng)40小時，冷卻至室溫，收集硅納米線有序陣列，用乙醇超聲清洗除去未反應(yīng)的3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷，得到表面修飾有3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷的硅納米線有序陣列。
[0084]將上述得到的表面修飾有3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷的硅納米線有序陣列置于裝載有15mL的二氯甲烷的反應(yīng)器中，隨后加入ImL的三乙胺，室溫攪拌5分鐘，之后逐滴加入丹磺酰氯的二氯溶液IOmL (丹磺酰氯的濃度為0.8mmol/L)，室溫下攪拌反應(yīng)5小時。通過3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷修飾的硅納米線有序陣列表面的氨基與丹磺酰氯分子中的酰氯鍵發(fā)生取代反應(yīng)，從而得到表面修飾有3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷和丹磺酰氯的反應(yīng)產(chǎn)物的硅納米線有序陣列；用乙醇反復(fù)超聲清洗除去未反應(yīng)的丹磺酰氯，得到對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線陣列的熒光化學傳感器。
[0085]將上述得到的對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線陣列的熒光化學傳感器切成0.5厘米X0.5厘米的方形，并用質(zhì)量濃度為75%的酒精消毒，取其中的一片，將其置于24孔細胞培養(yǎng)板的一個孔中，并在該孔中加入I毫升細胞濃度為IO6個細胞/毫升的A549細胞懸浮液，將細胞培養(yǎng)板置于細胞培養(yǎng)箱中(CO2:5% ;溫度:37°C)進行細胞培養(yǎng)，15小時之后，取出生長有A549細胞的活性芯片，用除菌的PBS緩沖液(pH7.4)洗滌三次。為了便于細胞的觀察，之后將生長有A549細胞的活性芯片轉(zhuǎn)移至另外一個干凈的孔中，并于該孔中加入I毫升DMEM細胞培養(yǎng)液，再向該孔中加入1.5微升2微克/毫升的DAPI水溶液，于細胞培養(yǎng)箱中(CO2:5% ;溫度:37°C )中孵育15分鐘之后，用除菌的PBS緩沖液(pH7.4)洗滌五次，得到生長有經(jīng)過DAPI染色的A549細胞的活性芯片。
[0086]將上述得到的生長有A549細胞的活性芯片倒置于盛有ImL胰蛋白酶的共聚焦培養(yǎng)皿中，再聯(lián)用激光共聚焦顯微鏡，對A549細胞凋亡過程中銅離子的釋放過程進行實時、原位的檢測。用405nm的激光激發(fā)，立即檢測隨著時間的變化，A549細胞和基底熒光的變化。發(fā)現(xiàn)隨著時間的增加，A549細胞逐漸凋亡，活性芯片的熒光強度逐漸減弱，如圖9a、圖9b及圖9c所示，其中:圖9a是生長有A549細胞的活性芯片的熒光照片，其中a_c是A549細胞凋亡過程的熒光照片，d-e是所述的熒光化學傳感器的熒光強度減弱的熒光照片；圖9b是在A549細胞凋亡過程中，A549細胞的熒光強度隨時間的變化曲線；圖9c是在A549細胞凋亡的過程中，所述的熒光化學傳感器的熒光強度隨時間的變化曲線。
[0087]實施例5
[0088]I)硅納米線的制備:
[0089]室溫下，將一氧化硅經(jīng)研缽研磨后放入瓷舟中，并將瓷舟放在石英管的中部，推入真空管式爐中；系統(tǒng)先用機械泵和分子泵抽至10_3Pa,隨后以20sccm (mL/min)的流速通入氬氣(占混合氣體的體積95% )與氫氣(占混合氣體的體積5% )的混合氣體，當壓力穩(wěn)定在8000Pa時，系統(tǒng)開始升溫；系統(tǒng)以20°C /min升至300°C，再以20°C /min升溫至800°C，此時關(guān)閉氣閥和泵閘，保溫30分鐘后繼續(xù)升溫至1350°C，在1350°C下反應(yīng)6小時后，自然冷卻至室溫，在瓷舟的兩側(cè)收集產(chǎn)物硅納米線，硅納米線的直徑為5?15nm ；
[0090]2)硅納米線的表面活化:
[0091]將步驟I)用化學氣相沉積法制備得到的硅納米線置于溫度為80°C的體積比為5:1的濃硫酸(質(zhì)量濃度為98%)與H2O2的混合液中加熱100分鐘，冷卻至室溫，取出硅納米線并水洗至中性；室溫下將硅納米線置于體積比為5:1:1的H2O = H2O2 = NH4OH的混合液中2小時，然后取出硅納米線并水洗至中性，真空干燥，得到表面經(jīng)活化的硅納米線；
[0092]3)硅納米線的修飾:
[0093]在反應(yīng)器中加入50mg干燥的步驟2)得到的表面經(jīng)活化的硅納米線、SmL的無水甲苯和0.5mL的3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷，在惰性氣體保護下加熱至10(TC后，恒溫反應(yīng)15小時，冷卻至室溫，收集硅納米線，用乙醇超聲清洗除去未反應(yīng)的3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷，得到表面修飾有3-2- (2-氨基乙基氣基)乙基氣基丙基二甲氧基娃燒的娃納米線；
[0094]將65mg上述得到的表面修飾有3-2- (2_氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷的硅納米線置于裝載有IOmL的二氯甲烷的反應(yīng)器中，隨后加入0.2mL的三乙胺，室溫攪拌15分鐘，之后逐滴加入丹磺酰氯的二氯溶液5mL (丹磺酰氯的濃度為0.4mmol/L),室溫下攪拌反應(yīng)2.5小時。通過3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷修飾的硅納米線表面的氨基與丹磺酰氯分子中的酰氯鍵發(fā)生取代反應(yīng)，從而得到表面修飾有3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷和丹磺酰氯的反應(yīng)產(chǎn)物的硅納米線；用乙醇反復(fù)超聲清洗除去未反應(yīng)的丹磺酰氯，得到對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器。
[0095]將上述得到的對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器作為熒光檢測的基底，聯(lián)用熒光光譜儀，對具有不同游離態(tài)銅離子濃度和絡(luò)合態(tài)銅離子濃度的溶液體系進行熒光檢測，激發(fā)光源為氙燈。將所述的熒光化學傳感器分散在PH值為7.4的HEPES緩沖液中，之后逐漸于該體系中加入絡(luò)合態(tài)銅離子(超氧化物歧化酶)，并對上述具有不同濃度絡(luò)合態(tài)銅離子的溶液體系進行熒光檢測，發(fā)現(xiàn)隨著絡(luò)合態(tài)銅離子濃度的增加，上述溶液體系的熒光特征峰的強度逐漸減弱。熒光特征峰的強度和絡(luò)合態(tài)銅離子的濃度呈線性關(guān)系，從而繪制了熒光特征峰的強度和絡(luò)合態(tài)銅離子濃度的線性定標曲線。根據(jù)所述的熒光化學傳感器在溶液體系中檢測到的熒光特征峰的強度確定被檢測溶液體系中的絡(luò)合態(tài)銅離子的濃度，從而實現(xiàn)對溶液體系中絡(luò)合態(tài)銅離子濃度的檢測。
[0096]取新鮮的小鼠肝臟，稱重7.5克，于2.5mL除菌的PBS緩沖液中攪勻，于4000rpm離心15分鐘，取上層清液，于4000rpm離心15分鐘，收集清液，得到肝臟提取液，冷凍保存。
[0097]將上述得到的對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器作為熒光檢測的基底，聯(lián)用熒光光譜儀，對動物肝臟提取液中的銅離子進行熒光檢測，激發(fā)光源為氙燈。將所述的熒光化學傳感器分散在PH值為7.4的HEPES緩沖液中，之后逐漸于該體系中加入動物肝臟提取液，并對上述具有不同肝臟提取液濃度的溶液體系進行熒光檢測，發(fā)現(xiàn)隨著肝臟提取液的增加，上述溶液體系的熒光特征峰的強度逐漸減弱。
[0098]實施例6
[0099]I)硅納米線有序陣列的制備:
[0100]取2cmX 3cm的(100)硅片，依次用乙醇、丙酮、蒸餾水進行超聲清洗25分鐘；之后將該娃片置于質(zhì)量濃度為4%的HF水溶液中10分鐘；取出娃片后置于含有濃度為5mmol/L的AgNO3和4mol/L的HF的混合水溶液中6分鐘；取出硅片后浸入含有濃度為6mol/L的HF和0.lmol/L的H2O2的混合水溶液中，在45°C的水浴保溫35分鐘；將取出的硅片放入濃鹽酸(質(zhì)量濃度為36%):濃硝酸(質(zhì)量濃度為36%)的體積比為3:1的混合液中，浸泡1.5小時，取出硅片并用蒸餾水沖洗后自然晾干，得到由硅納米線構(gòu)成的硅納米線有序陣列；硅納米線有序陣列中的硅納米線的直徑為100?250nm，長度為5?30 μ m ;
[0101]2)硅納米線陣列的表面活化:
[0102]將步驟I)用化學刻蝕法制備得到的硅納米線有序陣列置于溫度為65°C的體積比為4:1的濃硫酸(質(zhì)量濃度為98%)與H2O2的混合液中加熱90分鐘，冷卻至室溫，取出硅納米線有序陣列并水洗至中性；然后將硅納米線有序陣列置于氧等離子體系統(tǒng)中進行處理(處理條件:氧氣的質(zhì)量含量為50%，電壓為400伏，時間為4分鐘，溫度為25°C)，得到表面經(jīng)活化的硅納米線有序陣列；
[0103]3)硅納米線有序陣列的修飾:
[0104]在反應(yīng)器中加入35mg干燥的步驟2)得到的表面經(jīng)活化的硅納米線有序陣列、20mL的無水甲苯和0.3mL的3_2_ (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷，在氬氣保護下加熱至110°C后，恒溫反應(yīng)30小時，冷卻至室溫，收集硅納米線有序陣列，用乙醇超聲清洗除去未反應(yīng)的3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷，得到表面修飾有3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷的硅納米線有序陣列；
[0105]將上述得到的表面修飾有3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷的硅納米線或硅納米線有序陣列置于裝載有12mL的二氯甲烷的反應(yīng)器中，隨后加入0.6mL的三乙胺，室溫攪拌45分鐘，之后逐滴加入丹磺酰氯的二氯溶液4mL (丹磺酰氯的濃度為
0.6mmol/L)，室溫下攪拌反應(yīng)4小時。通過3_2_ (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷修飾的硅納米線有序陣列表面的氨基與丹磺酰氯分子中的酰氯鍵發(fā)生取代反應(yīng)，從而得到表面修飾有3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷和丹磺酰氯的反應(yīng)產(chǎn)物的硅納米線有序陣列；用乙醇反復(fù)超聲清洗除去未反應(yīng)的丹磺酰氯，得到對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線陣列的熒光化學傳感器。
[0106]將上述得到的對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線陣列的熒光化學傳感器切成0.5厘米X0.5厘米的方形，并用質(zhì)量濃度為75%的酒精消毒，取其中的一片，將其置于24孔細胞培養(yǎng)板的一個孔中，并在該孔中加入I毫升細胞濃度為IO6個細胞/毫升的A549細胞懸浮液，將細胞培養(yǎng)板置于細胞培養(yǎng)箱中(CO2:5% ;溫度:37°C)進行細胞培養(yǎng)，15小時之后，取出生長有A549細胞的活性芯片，用除菌的PBS緩沖液(pH7.4)洗滌三次。為了便于細胞的觀察，之后將生長有A549細胞的活性芯片轉(zhuǎn)移至另外一個干凈的孔中，并于該孔中加入I毫升DMEM細胞培養(yǎng)液，再向該孔中加入1.5微升2微克/毫升的DAPI水溶液，于細胞培養(yǎng)箱中(CO2:5% ;溫度:37°C )中孵育15分鐘之后，用除菌的PBS緩沖液(pH7.4)洗滌五次，得到生長有經(jīng)過DAPI染色的A549細胞的活性芯片。
[0107]將上述得到的生長有A549細胞的活性芯片倒置于盛有ImL胰蛋白酶的共聚焦培養(yǎng)皿中，再聯(lián)用激光共聚焦顯微鏡，對A549細胞凋亡過程中銅離子的釋放過程進行實時、原位的檢測。用405nm的激光激發(fā)，立即檢測隨著時間的變化，A549細胞和基底熒光的變化。發(fā)現(xiàn)隨著時間的增加，A549細胞逐漸凋亡，活性芯片的熒光強度逐漸減弱。
【權(quán)利要求】
1.一種對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器，其特征是:所述的熒光化學傳感器是將表面活化的硅納米線或硅納米線有序陣列和3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷反應(yīng)，并將得到的表面修飾有3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷的硅納米線或硅納米線有序陣列與丹磺酰氯反應(yīng)，使3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷和丹磺酰氯的反應(yīng)產(chǎn)物修飾在硅納米線或硅納米線陣列的表面后得到的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器，其特征是:所述的表面活化的硅納米線中的硅納米線是由化學氣相沉積法得到的直徑為5~15nm的硅納米線； 所述的表面活化的硅納米線有序陣列中的硅納米線有序陣列是由化學刻蝕法得到的硅納米線有序陣列，硅納米線有序陣列中的硅納米線的直徑為100~250nm，長度為5~30 μ m0
3.—種權(quán)利要求1或2所述的對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器的制備方法，其特征是，所述的制備方法包括以下步驟: 1)將硅納米線置于溫度為75~90°C的體積比為1:2~9:1的濃硫酸與H2O2的混合液中加熱30~180分鐘，冷卻至室溫，取出硅納米線并水洗至中性；室溫下將硅納米線置于體積比為2:1:1~8:1:1的H2O = H2O2 = NH4OH的混合液中，然后取出硅納米線并水洗至中性，真空干燥，得到表面經(jīng)活化的硅納米線； 或?qū)⒐杓{米線有序陣列置于溫度為75~95°C的體積比為1:1~9:1的濃硫酸與H2O2的混合液中加熱30~1 80分鐘，冷卻至室溫，取出硅納米線有序陣列并水洗至中性；然后將硅納米線有序陣列置于氧等離子體系統(tǒng)中進行處理，得到表面經(jīng)活化的硅納米線有序陣列； 2)在反應(yīng)器中加入5~IOOmg干燥的步驟I)得到的表面經(jīng)活化的硅納米線或硅納米線有序陣列、2.5~50mL的無水甲苯和0.05~0.6mL的3_2_(2_氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷，在惰性氣體保護下加熱至75~125°C后，恒溫反應(yīng)10~40小時，冷卻至室溫，收集硅納米線或硅納米線有序陣列，用有機溶劑超聲清洗除去未反應(yīng)的3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷，得到表面修飾有3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氣基丙基二甲氧基硅烷的娃納米線或娃納米線有序陣列； 3)將5~IOOmg步驟2)得到的表面修飾有3_2_(2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷的硅納米線或硅納米線有序陣列置于裝載有5~15mL的二氯甲烷的反應(yīng)器中，隨后加入0.05~1.0mL的三乙胺，室溫攪拌，之后逐滴加入丹磺酰氯的二氯溶液I~10mL，室溫下攪拌反應(yīng)，得到表面修飾有3-2- (2-氨基乙基氨基)乙基氨基丙基三甲氧基硅烷和丹磺酰氯的反應(yīng)產(chǎn)物的硅納米線或硅納米線陣列；然后用有機溶劑超聲清洗除去未反應(yīng)的丹磺酰氯，得到對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是:所述的將硅納米線置于體積比為2:1:1~8:1:1的H2O:H2O2:NH4OH的混合液中的時間為0.5~3小時； 所述的將硅納米線有序陣列置于氧等離子體系統(tǒng)中進行處理，處理條件:氧氣的質(zhì)量含量為5~100%，電壓為100~700伏，時間為5秒~8分鐘，溫度為15~45°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是:所述的丹磺酰氯的二氯溶液中丹磺酰氯的濃度為0.05~8mmol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征是:所述的有機溶劑是甲醇、乙醇或丙酮。
7.—種權(quán)利要求1或2所述的對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子具有選擇性熒光響應(yīng)的基于硅納米線的熒光化學傳感器的應(yīng)用，其特征是:所述的熒光化學傳感器用于含有游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子的普通溶液體系或生物體系中的游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子的檢測； 或?qū)⑺龅臒晒饣瘜W傳感器作為細胞生長的基底，在所述的熒光化學傳感器的表面上得到生長的細胞，構(gòu)筑載有細胞的活性檢測芯片，并利用該芯片實時、原位檢測細胞凋亡過程中釋放的游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子； 所述的普通溶液體系是磷酸緩沖液或HEPES緩沖液； 所述的生物體系是動物肝臟提取液或是細胞培養(yǎng)液。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征是:所述的基于硅納米線的游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子熒光化學傳感器的應(yīng)用，其特征是:所述的用于含有游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子的普通溶液體系或生物體系中的游離態(tài)銅離子或絡(luò)合態(tài)銅離子的檢測，是將所述的熒光化學傳感器置于待檢測的普通溶液體系或生物體系中作為熒光檢測的活性檢測基底，用熒光光譜儀或者激光共聚焦顯微鏡檢測在待檢測的普通溶液體系或生物體系中所述的熒光化學傳感器的熒光特征峰強度，通過比較在待檢測的普通溶液體系或生物體系中所述的熒光化學傳感器的熒光特征峰強度和該熒光化學傳感器對游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子檢測的定標曲線中的熒光特征峰強度，定量檢測出待檢測的普通溶液體系或生物體系中的游離態(tài)銅離子濃度和絡(luò)合態(tài)銅離子濃度； 所述的實時、原位檢測細胞凋亡過程中釋放的游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子，是將所述的構(gòu)筑載有細胞的活性檢測·芯片倒置于共聚焦培養(yǎng)皿中，然后加入能夠使細胞發(fā)生消化、凋亡的生物試劑或化學試劑，使細胞凋亡，通過觀察生物試劑或化學試劑中所述的熒光化學傳感器所發(fā)射的綠色熒光被猝滅，實時、原位檢測細胞凋亡過程中釋放的游離態(tài)銅離子和絡(luò)合態(tài)銅離子。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征是:所述的生物試劑是胰蛋白酶；所述的化學試劑是乙醇、甲醇、丙酮或甲苯。
10.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征是:所述的絡(luò)合態(tài)銅離子是含有銅離子的絡(luò)合物或是含有銅離子的生物活性分子。
【文檔編號】G01N21/64GK103712968SQ201410005686
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2014年1月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月6日
【發(fā)明者】師文生, 苗榮, 穆麗璇 申請人:中國科學院理化技術(shù)研究所