用于診斷阿扎胞苷耐藥性的試驗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及使用包含在取自患者生物流體樣品中的BCL2L10蛋白質(zhì)，預測所述患者對阿扎胞治療苷治療的耐藥性的體外分析方法以及特異性結合BCL2L10蛋白質(zhì)的生物分子。其特征在于從患者中取出生物流體樣品；計算所述生物流體樣品中表達BCL2L10蛋白質(zhì)的總細胞的百分比；將該計算的百分比與參比閾值進行比較，該閾值介于20％和60％之間；并所述生物流體中表達BCL2L10蛋白質(zhì)的細胞的百分比大于所述參比值的患者被診斷為對阿扎胞苷治療有耐藥性。
【專利說明】用于診斷阿扎胞音耐藥性的試驗

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及能夠體外診斷患者對阿扎胞巧治療的耐藥性的分析方法。本發(fā)明還涉 及使得能夠預測患者對阿扎胞巧治療的耐藥性的體外分析試劑盒W及所述試劑盒的用途。

【背景技術】
[0002] NHa 人O HO. W U OH Ih
[0003] 具有上式的阿扎胞巧是目前患有不適于造血干細胞移植的骨髓增生異常綜合征 (MD巧和急性髓細胞白血?。ˋML)的患者的唯一被認可的治療。阿扎胞巧還使用Vidaza⑩ 的名稱銷售用于治療該些疾病。
[0004] 阿扎胞巧（AZA)是一種在該兩種疾病中產(chǎn)生40%-60%反應的低甲基化劑 化ypomethylating agent)D
[0005] 骨髓增生異常綜合征（MD巧和急性髓細胞白血?。ˋML)是發(fā)生于骨髓干細胞的髓 系血液病，骨髓干細胞包含相當于白細胞的粒細胞系的前體、相當于紅細胞的成紅細胞系 的前體、相當于血小板的巨核細胞系的前體和組織-單核細胞系的前體。MDS的特征在于粒 細胞、紅細胞和巨核細胞骨髓細胞系的一種或所有H種的嚴重成熟障礙（其是引起血細胞 減少癥的原因）。DMS可發(fā)展成為急性白血?。ˋL)。傳統(tǒng)上，診斷W血液和骨髓的細胞學研 究、細胞遺傳學和分子生物學為基礎。DMS包括各種類型的貧血或難治性血細胞減少癥W及 5q-綜合征。
[0006] AML的特征在于粒細胞、紅細胞和巨核細胞系H種的骨髓前體的快速增殖，導致不 成熟細胞在血液和骨髓中蓄積，破壞了正常的血細胞生成。其診斷基于與用于MDS的相同 技術。AML包括未分化型AML、極低分化型AML、髓細胞性白血病、單核細胞性白血病、粒-單 核細胞性白血病W及急性紅細胞性白血病和急性成巨核細胞性白血病。原發(fā)性或繼發(fā)性 AML可能是在各種器官或組織（皮膚、神經(jīng)節(jié)、乳腺、消化道、脾等）中形成腫瘤的原因，產(chǎn)生 了髓系肉瘤，亦稱綠色瘤或粒細胞肉瘤。AML可表現(xiàn)為急性白血病，并且與惡性淋己瘤一起 提出了診斷難題。
[0007] 用阿扎胞巧治療的MDS或AML患者對阿扎胞巧有耐藥性（"AZA耐藥"）或?qū)Π⒃?胞巧敏感（"AZA敏感"）。然而，甚至"AZA敏感"患者在差不多的一段時間過去后，似乎都 遭到全身性復發(fā)。
[000引換句話說，即使40%用阿扎胞巧治療的患者立即有耐藥性，且約60%的患者在最 初數(shù)月對所述治療敏感，全部患者在短期或中期都將發(fā)生對該種治療的耐藥性。該種現(xiàn)象 在傳統(tǒng)上被稱為復發(fā)，是指對患者W前對之敏感的治療產(chǎn)生耐藥性。
[0009] 現(xiàn)行的預后評級系統(tǒng)使得可能預測和預計用低甲基化劑治療的患者的總體生存。 該些系統(tǒng)基于患者亞群中所評價的預后評分。該些是由患者的核型研究和某些臨床特征限 定的風險群。然而，與該些評級系統(tǒng)有關的結果是不可靠的反應預測因子。
[0010] MDS患者中有一半具有正常核型，并且具有相同染色體異常的患者常常在臨床上 是異質(zhì)的。體細胞點突變常見于MDS。基因TP53、EZ肥、ETV6、RUNX1和ASXLl的突變是MDS 患者中總體生存率低的預測因子，其獨立于其它已確立的危險因子。
[0011] 然而，現(xiàn)有系統(tǒng)不提供在不給予患者所述治療的情況下能夠診斷患者對阿扎胞巧 的敏感性的合適結果。
[0012] 目前，用于測定患者是否對阿扎胞巧治療有耐藥性的唯一的已知方法是將所述治 療給予患者至少6個月，并確定所述治療是否有效果。
[0013] 使用該相同方法來鑒定患者的復發(fā)。實際上，目前已知的鑒定患者復發(fā)的唯一方 法是確定阿扎胞巧治療對患者不再有效的時間。不存在在相關癥狀出現(xiàn)之前能夠預測該種 復發(fā)的時間的方法。
[0014] 當被建議用于MDS和/或AML患者時，阿扎胞巧治療是每日皮下注射至上臂、大腿 或腹部7天，接著21天的休息期?？赡墚a(chǎn)生多種較嚴重或不太嚴重的不良反應，例如頗內(nèi)出 血、敗血癥、血壓變化、嗜睡、全身不適感和脫發(fā)。另外，阿扎胞巧治療的費用相當可觀。每 年治療約為80, 000歐元。因此目前沒有可靠且便宜地診斷患者對阿扎胞巧治療是敏感還 是耐藥的方法。
[0015] 另外，目前需要預測患者對阿扎胞巧治療的耐藥性W避免將阿扎胞巧給予該治療 對其無效的患者，不論是從其給藥開始無效，還是在所述患者產(chǎn)生耐藥性的數(shù)月之后無效。 實際上，將該類治療給予耐藥患者是強制性的，對患者可能是有危險的，并且還可產(chǎn)生相當 大的不必要的費用。該適用于建議MDS和/或AML患者阿扎胞巧治療的兩種情況，并適用 于所有治療性阿扎胞巧治療。實際上，阿扎胞巧耐藥性與阿扎胞巧分子有關，而非其給予的 方式。
[0016] 更快地鑒定立即產(chǎn)生耐藥性的患者W及最初是敏感的患者的復發(fā)時間的能力也 是有利的，因為它使得可能在所述患者的臨床病況惡化之前提供其它的臨床試驗。
[0017] 因此能夠盡早診斷是必要的，不論患者將對阿扎胞巧治療敏感，還是能夠預測患 者的復發(fā)時間。
[0018] 出乎意料的是，本 申請人:能夠證實取自患者的生物流體樣品中B化化10蛋白質(zhì)的 表達水平與該患者對阿扎胞巧治療的敏感性之間的聯(lián)系。
[0019] 在整個說明書中，通用術語B化2L10定義為相當于B化2L10基因、B化化10 RNA轉 錄物或B化2L10蛋白質(zhì)。
[0020] B化化10基因是具有體外促調(diào)亡作用的Bcl-2家族的成員。B化化10蛋白質(zhì)與 Bcl-2蛋白家族都具有BHUBH4和肌2結構域。作為Bcl-2家族促調(diào)亡因子特有的B冊結 構域不存在于B化2L10蛋白質(zhì)中。然而，在有關B化2L10的促調(diào)亡或抗調(diào)亡性質(zhì)的文獻中 仍然有相互矛盾的結果，特別是因為其在小鼠中的假定的直向同源物（Odholog)也被描 述為具有促調(diào)亡活性。
[0021] B化化10可與Bcl-2家族的成員，特別是Bd-2、Bd-xL和Bax相互作用，W調(diào)節(jié) 不同情況下的細胞調(diào)亡。某些出版物例如論文"Loss of B化化10 protein expression as prognostic predictor for poor clinical outcome in gastric carcinoma(BCL2L10 蛋白質(zhì)表達喪失作為胃癌中臨床結局差的預后預測因子），化Stopathology 2010, 57, 814-82"提出B化化10是一種抗調(diào)亡基因。
[0022] B化化10的過量表達被描述為通過抑制由線粒體釋放的細胞色素C遏制細胞調(diào) 亡。
[002引最近表明，低甲基化劑地西他濱引發(fā)細胞調(diào)亡和許多基因（包括B化2L10)的 正調(diào)節(jié)，亦稱"增量調(diào)節(jié)"。現(xiàn)今，已表明患者對某些抗癌治療的抗性和BCL2L10基因的 表達之間有關系，特別在專利申請JP201016203UA)中，該申請描述了該樣的事實，即 B化化10基因的擴增使得能夠檢測對基于喜樹堿的治療有耐藥性的癌細胞。同樣，專利申請 US2009143236(A1)描述了通過研究某些基因（特別包括BCL2L10)的擴增來檢測某些藥物 耐藥性獲得的方法。然而，在該兩項專利申請中，對其耐藥性進行了評價的抗癌劑不包括阿 扎胞巧。
[0024] 專利申請US2011/0129833表明患者中Bcl-2家族基因表達的增加與將響應化療 治療的患者的可能性降低關聯(lián)。然而，該專利申請中絲毫未提到該個結論適用于基于阿扎 胞巧的治療。
[00巧]論文 "Role of B化2L10 methylation and TET2 mutations in M曲er risk myelodysplastic (較高危骨髓增生異常中B化2L10甲基化和TET2突變的作 用），Le址emia. 2011 Dec ;25(12)"描述了阿扎胞巧耐藥性的現(xiàn)象。該文件描述了 B化2L10 基因啟動子的甲基化和阿扎胞巧耐藥性之間的關聯(lián)的存在。具體地講，B化化10基因啟動子 過度甲基化與患有胃癌的患者的低生存率關聯(lián)。該出版物教導了具有高甲基化的BCL2L10 啟動子的患者患MDS的風險高和響應外遺傳治療（例如阿扎胞巧治療）的機會小。然而， 該出版物絲毫未教導BCL2L10蛋白質(zhì)的高水平表達能夠得出相同結論。
[0026] 取而代之的是，該出版物提出正是BCL2L10表達的低水平與響應阿扎胞巧的機會 小有關。另外，即使高水平的BCL2L10甲基化確實與對阿扎胞巧治療的耐藥性有關，該個數(shù) 據(jù)也不會與BCL2L10蛋白質(zhì)的表達水平相關聯(lián)。實際上，基因的甲基化水平不必與產(chǎn)生自 所述基因的蛋白質(zhì)的表達有關。特別是在BCL2L10的情況下。
[0027] 另外，鑒于上述先有技術，絲毫未提出在BCL2L10蛋白質(zhì)的表達水平和阿扎胞巧 耐藥性現(xiàn)象之間存在聯(lián)系。并且更加絲毫未提出在BCL2L10蛋白質(zhì)的高表達水平和阿扎胞 巧耐藥性之間存在關系。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0028] 所述問題的解決辦法涉及使用包含在取自所述患者的生物流體樣品中的BCL2L10 蛋白質(zhì)W及特異性結合BCL2L10蛋白質(zhì)的生物分子，使得可診斷患者的阿扎胞巧治療耐藥 性的體外分析方法，其特征在于：
[0029] -從患者中取得生物流體樣品；
[0030] -計算所述生物流體中表達B化化10蛋白質(zhì)的總細胞的百分比；
[003。-將所述計算的百分比與參比闊值進行比較，所述闊值介于20%和60%之間；和
[003引-所述生物流體中表達B化2L10蛋白質(zhì)的細胞的百分比高于所述參比值的患者被 診斷為對阿扎胞巧治療有耐藥性。
[0033] 出乎意料的是，本 申請人:表明在表達BCL2L10蛋白質(zhì)的患者生物流體細胞的百分 比和阿扎胞巧耐藥性之間關系的存在。
[0034] W前從未提出用于該百分比的參比闊值的測定，超出該參比闊值，便可斷定患者 對阿扎胞巧耐藥。
[0035] 該種方法使得可能在給予患者所述阿扎胞巧分子之前診斷出患者的阿扎胞巧耐 藥性。該種方法還使得可能有利地預測之前對阿扎胞巧治療敏感的患者的復發(fā)。
[0036] 本發(fā)明的分析方法使得可避免用阿扎胞巧對患者的任何不必要的治療。因此就患 者的健康和適當治療而言，W及經(jīng)濟觀點來看，該是有利的。本發(fā)明的第二個目的涉及能夠 進行本發(fā)明的體外分析方法的用于體外分析的試劑盒，所述試劑盒包括特異性結合從取自 患者的生物流體獲取的細胞中的BCL2L10蛋白質(zhì)的生物分子。
[0037] 最后，本發(fā)明的第H個目的涉及本發(fā)明的體外分析試劑盒用于實施監(jiān)測阿扎胞巧 治療W預測復發(fā)的方法中的用途。
[0038] 為了更好地理解與體外阿扎胞巧耐藥性有關的機制，本發(fā)明人制備了阿扎胞巧耐 藥性SKMl髓樣細胞，稱為AZA-R或SKM^R。相比之下，AZA-S或SKMl-S是阿扎胞巧敏感細 胞。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0039] 在閱讀下列有關附圖給出的非限制性描述，將更好地理解本發(fā)明，其中：
[0040] 圖1顯示篩選獲自表達Bcl-2蛋白的SKMl細胞系的細胞的結果。SKMl-S和SKM^R 細胞用1 U M阿扎胞巧處理24小時。然后進行蛋白質(zhì)印跡實驗W評價Bd-2、Md-l、Bd-xl 和B化2L10蛋白質(zhì)的量?？狗60抗體用作加載對照。
[0041] 圖2-6顯示患AML的SKMl-S和SKMl-R細胞系中B化化10蛋白質(zhì)的表達。
[0042] 在圖2、3和4中，通過流式細胞術，定量測定SKMl-S和SKMl-R細胞中的B化2L10 蛋白質(zhì)水平。
[0043] 圖5顯示通過逆轉錄酶聚合鏈式反應（稱為RT-PCR)進行的SKMl-S和SKMl-R細 胞的mRNA分析。
[0044] 圖6顯示能夠觀察SKM^S和SKM^R細胞中B化化10蛋白質(zhì)水平的蛋白質(zhì)印跡結 果。
[0045] 圖7-10顯示SKMl-R細胞對阿扎胞巧重新敏感，接著消除B化2L10基因表達。 B化化10基因表達的消除通常稱為"敲減"，在該種情況下為B化2L10敲減。
[0046] SKMl-S 和 SK]\a-R 細胞用 W下干擾 RNA 轉染；Luc siRNA、BCL2L10siRNA 或 Bd-2 siRNA。轉染72小時后，細胞用I y M阿扎胞巧刺激。
[0047] 圖7中，通過XTT試驗（木糖耐量試驗），在刺激24小時后測量細胞代謝。所示結 果等于進行了 4次的3個獨立實驗的平均值的平均標準誤差（ + SEM)。
[0048] 圖8顯示在加入1 U M阿扎胞巧后24小時通過流式細胞術觀察到的脫天蛋白酶-3 標記的結果。
[0049] 圖9顯示在加入1 U M阿扎胞巧后24小時通過流式細胞術所得的楓化丙錠（PI) 標記的結果。
[0050] 圖10顯示為了測定BCL2L10和Bcl-2表達的抑制在加入1 U M阿扎胞巧后24小 時進行的蛋白質(zhì)印跡的結果。
[005。 圖11、12和13中，顯示了 B化化10的蛋白質(zhì)表達在阿扎胞巧耐藥患者中特異性增 加。
[0052] 圖11顯示通過對7名健康患者、7名阿扎胞巧敏感患者和5名阿扎胞巧耐藥患者 的"新鮮"骨髓樣品進行蛋白質(zhì)印跡檢出的B化2L10、Bcl-2和邸K蛋白質(zhì)的表達。顯示了 各亞群中兩名患者的蛋白質(zhì)印跡結果。
[0053] 圖 12 顯不借助 ImageJ 軟件程序（ImageJ 是由 P^Jational Insti1:ute of Health(NIH)編寫于化va中的用于圖像處理的免費軟件程序）分析的B化2L10和E服蛋白 質(zhì)表達及B化2L10表達與E服表達的比率的定量測定。
[0054] 圖13顯示借助ImageJ軟件程序分析的B化2L10和E服蛋白質(zhì)表達的定量測定及 B化化10表達與E服表達的比率的定量測定。
[005引 圖14-17顯示阿扎胞巧耐藥MDS或AML患者中，骨髓中表達B化化10蛋白質(zhì)的細 胞的百分比增加的事實。
[005引圖14中，在患有32名患MDS或AML并正進行阿扎胞巧治療的患者中和在8名健 康患者（全部來自組群1)中，通過流式細胞術，定量測定表達BCL2L10蛋白質(zhì)的細胞的百 分比。
[0057] 圖15中，通過流式細胞術，定量測定冷凍于DMSO的樣品中表達B化2L10蛋白質(zhì)的 細胞的百分比，所述樣品來自14名患有低危MDS的患者、31名患有高危MDS或AML且用阿 扎胞巧治療的患者（全部來自組群2)。
[0058] 通過流式細胞術，定量測定冷凍于DMSO的樣品中表達B化2L10蛋白質(zhì)的細胞的百 分比，所述樣品來自16名患有高危MDS的患者或診斷中的患者，如圖16所示。
[0059] 通過流式細胞術，定量測定冷凍于DMSO的樣品中表達B化2L10蛋白質(zhì)的細胞的百 分比，所述樣品來自15名全都正在進行阿扎胞巧治療的患有高危MDS或AML的患者，如圖 17所示。
[0060] 圖18a和18b顯示表達B化化10蛋白質(zhì)的細胞的百分比和接受治療的MDS或AML 患者的總體生存之間的相關性。
[00川按照Kaplan-Meier,檢查了用AZA治療的MDS或AML患者的具有移植 (transplantation)的總體生存的比較，W及其骨髓中表達BCL2L10的細胞的百分比。
[0062] 圖19-22使得可證實通過流式細胞術進行的BCL2L10蛋白質(zhì)定量技術。
[0063] 圖19中，肥K293系的細胞用W下轉染：并入B化2L10的Myc表位標簽N端部分的 PCDNA3表達質(zhì)粒或并入僅Myc表位標簽的N端部分的PCDNA3表達質(zhì)粒。通過流式細胞術 定量測定BCL2L10蛋白質(zhì)表達水平。該實驗的結果見圖19。
[0064] 圖20中，肥K293系的細胞用干擾SiLuc RNA或干擾Si-B化化10 RNA轉染。通過 流式細胞術定量測定BCL2L10蛋白質(zhì)表達水平。該實驗的結果見圖20。
[0065] 圖21和22顯示通過蛋白質(zhì)印跡檢測的B化化10蛋白質(zhì)水平?？狗60抗體用作 加載對照。

【具體實施方式】
[0066] 本發(fā)明涉及分析尤其通過對生物流體總細胞的BCL2L10蛋白質(zhì)表達進行定量測 定能夠體外診斷患者對阿扎胞巧治療耐藥性的方法。
[0067] 按照本發(fā)明，患者是人類。有利的是，該分析方法特別適于惡性血液?。ɡ缢柘?血液病）的患者。再準確地說，患者患有AML或MDS。
[0068] 按照本發(fā)明，生物流體是從人體獲得的流體。作為生物流體的非限制性實例，可提 及骨髓、血液、腦脊液和尿液。優(yōu)選本發(fā)明的生物流體是骨髓。
[0069] 按照本發(fā)明，術語"總細胞"涵蓋存在于所采集的生物流體中的全部細胞。如果所 采集的生物流體是骨髓，總細胞特別包括造血干細胞化SC)和骨髓間質(zhì)細胞，它們是造血 細胞。
[0070] 按照本發(fā)明，特異性結合B化2L10蛋白質(zhì)的生物分子是能夠特異性結合B化2L10 蛋白質(zhì)的分子。有利的是，該些是單克隆或多克隆抗體、可溶性受體或適配體，優(yōu)選單克隆 或多克隆抗體。還優(yōu)選特異性結合BCL2L10蛋白質(zhì)的生物分子為單克隆抗體。作為特異性 結合BCL2L10蛋白質(zhì)的生物分子的非限制性實例，可提及"Cell Si即aling化chnologies" 公司參考號為"#3869"的抗B化2L10蛋白質(zhì)。
[OCm] 按照本發(fā)明，參比闊值，亦稱"截止"值，相當于生物流體中B化2L10陽性細胞的百 分比，即表達BCL2L10蛋白質(zhì)的細胞的百分比。
[007引當所獲得的生物流體總細胞中表達BCL2L10蛋白質(zhì)的細胞的百分比值大于該"截 止"值時，受測試的患者可診斷為對阿扎胞巧耐藥。相反地，當所獲得的值低于該"截止"值 時，受測試的患者可診斷為對阿扎胞巧敏感。
[0073] 按照本發(fā)明，參比闊值介于20 %和60 %之間，優(yōu)選介于30 %和55 %，更優(yōu)選該參 比闊值等于50%。
[0074] 本發(fā)明的分析方法使得可診斷患者對阿扎胞巧治療有耐藥性。所述用阿扎胞巧治 療的患者在其治療期間每1、3和6個月然后在之后每3個月通常必須進行骨髓抽吸。因此， 所采集的作為阿扎胞巧治療傳統(tǒng)監(jiān)測一部分的骨髓樣品還可用于本發(fā)明的分析方法。因此 就該種對阿扎胞巧治療有耐藥性的診斷而言，不一定在患者中進行特定的骨髓抽吸。
[00巧]換句話說，鑒于所述體外分析方法能夠診斷患者的阿扎胞巧耐藥性，因此不必進 行在傳統(tǒng)治療情況下對所抽吸的骨髓樣品進行的額外檢查，該對患者是有利的。
[0076] 按照本發(fā)明，生物流體中表達BCL2L10蛋白質(zhì)的細胞的百分比的測量通過流式細 胞術（免疫分型）、疏水作用色譜法化IC)或定量聚合酶鏈式反應（qPCR)進行。優(yōu)選該種 測量通過流式細胞術（免疫分型）進行。
[0077] 本發(fā)明還涉及通過檢測包含在取自所述患者的生物流體樣品中的BCL2L10基因 的過量表達，能夠診斷患者的阿扎胞巧治療耐藥性的體外分析方法，其特征在于：
[0078] -從患者中取得生物流體樣品；
[0079] -通過檢測B化2L10基因的過量表達，計算所述生物流體中表達B化2L10的總細胞 的百分比；
[0080] -將所述計算的百分比與參比闊值進行比較，所述闊值介于20%和60%之間；和
[0081] -所述生物流體中表達BCL2L10的細胞的百分比大于所述參比闊值的患者被診斷 為對阿扎胞巧治療有耐藥性。
[0082] B化化10基因過量表達的檢測優(yōu)先通過比較基因組雜交CO!方法、流式細胞術方 法、ELISA方法、DNA芯片方法或定量聚合鏈式反應（quantitative polymerization chain reaction) (qPCR)進行。B化化10基因過量表達的檢測更優(yōu)先通過比較基因組雜交CO!方 法、DNA芯片方法或定量聚合鏈式反應（qPCR)進行。B化化10基因過量表達的檢測還更優(yōu) 先通過DNA芯片方法或定量聚合鏈式反應（qPCR)進行。
[0083] 本發(fā)明還涉及包含特異性結合取自患者的生物流體樣品的細胞中的BCL2L10蛋 白質(zhì)的生物分子的體外分析試劑盒，所述試劑盒使得可預測所述生物流體中表達BCL2L10 蛋白質(zhì)的細胞的百分比大于介于20%和60%之間的參比闊值的患者對阿扎胞巧治療有耐 藥性。
[0084] 還涉及包含選自W下的至少一種試劑的體外分析試劑盒：
[00財-能夠擴增B化化10片段的一對引物，和
[0086] -能夠檢測B化化10存在的探針，
[0087] 所述試劑盒使得可預測所述生物流體中表達BCL2L10的細胞的百分比大于介于 20%和60%之間的參比闊值的患者對阿扎胞巧治療有耐藥性。
[0088] 本發(fā)明的另一個目的涉及本發(fā)明的試劑盒或方法在實施監(jiān)測阿扎胞巧治療W預 測復發(fā)的方法中的用途。
[0089] 按照本發(fā)明的一個具體實施方案，使用本發(fā)明的試劑盒或方法還使得可根據(jù)患者 的反應修改治療。
[0090] 按照本發(fā)明的一個具體實施方案，當患者特別是患有骨髓增生異常綜合征和/或 急性髓細胞白血病的患者診斷出阿扎胞巧治療耐藥性時，將包括至少一種抗腫瘤藥和/或 抗炎藥在內(nèi)的替代治療給予所述患者。
[0091] 優(yōu)選將選自焼化劑、抗代謝物、植物生物堿、拓撲異構酶抑制劑和抗腫瘤抗生素的 抗腫瘤化合物給予所述患者。
[0092] 作為可按照本發(fā)明使用的抗腫瘤藥的非限制性實例，特別可提及阿卡地新（亦稱 AICAR，為5-氨基咪哇-4-甲醜胺-1-目-D-巧喃核糖巧的簡稱）、阿卡地新的衍生物、放 線菌素D、安嚇巧、意環(huán)類例如多柔比星或柔紅霉素、阿糖胞巧（aracytin)、ATRA(全反式 維甲酸）、博來霉素、測替佐米、白消安、喜樹堿的衍生物、順笛、卡笛、苯下酸氮芥、地西他 濱、德己金（Cbpakine)、多西他賽、表鬼白毒素的衍生物、埃羅替尼、依巧泊巧、5-氣尿嚼巧 巧即)、氣達拉濱、輕基脈、異環(huán)磯醜胺、組蛋白脫己醜酶（HDAC)抑制劑、來那度胺、甲氨蝶 嶺、絲裂霉素C、紫杉醇、普卡霉素、琉基嘿嶺、塞替派、長春新堿、長春堿和長春瑞濱。還可提 及用于不同腫瘤病理學的酪氨酸激酶抑制劑（TKI)，例如伊馬替尼、達沙替尼、尼洛替尼和 舒尼替尼。
[0093] 可W使用的阿卡地新的衍生物、其外消旋體、對映體和非對映體及其混合物、其互 變異構體及其藥學上可接受的鹽優(yōu)選具有W下通式：
[0094]

【權利要求】
1. 一種使用包含在取自患者的生物流體樣品中的BCL2L10蛋白質(zhì)以及特異性結合 BCL2L10蛋白質(zhì)的生物分子，使得可診斷所述患者的阿扎胞苷治療耐藥性的體外分析方法， 其特征在于： -從患者中取得生物流體樣品； -計算所述生物流體中表達BCL2L10蛋白質(zhì)的總細胞的百分比； -將所述計算的百分比與參比閾值進行比較，所述閾值介于20%和60%之間；和 -所述生物流體中表達BCL2L10蛋白質(zhì)的細胞的百分比高于所述參比值的患者被診斷 為對阿扎胞苷治療有耐藥性。
2. 權利要求1的方法，其特征在于所述生物流體是骨髓。
3. 權利要求1或2之一的方法，其特征在于所述參比閾值等于50%。
4. 權利要求1-3中任一項的方法，其特征在于所述生物流體中表達BCL2L10蛋白質(zhì) 的細胞的百分比的測量通過流式細胞術、疏水作用色譜法（HIC)或定量聚合酶鏈式反應 (qPCR)進行，優(yōu)選通過流式細胞術進行。
5. 權利要求1-5中任一項的方法，其特征在于所述特異性結合BCL2L10蛋白質(zhì)的生物 分子是對BCL2L10蛋白質(zhì)有特異性的抗體。
6. -種通過檢測包含在取自患者的生物流體樣品中的BCL2L10基因的過量表達，使得 可診斷所述患者的阿扎胞苷治療耐藥性的體外分析方法，其特征在于： -從患者中取得生物流體樣品； -通過檢測BCL2L10基因的過量表達，計算所述生物流體中表達BCL2L10的總細胞的百 分比； -將所述計算的百分比與參比閾值進行比較，所述閾值介于20%和60%之間；和 -所述生物流體中表達BCL2L10的細胞的百分比大于所述參比閾值的患者被診斷為對 阿扎胞苷治療有耐藥性。
7. 權利要求6的方法，其特征在于BCL2L10基因過量表達的檢測通過比較基因組雜交 CGH方法、流式細胞術方法、ELISA方法、DNA芯片方法或定量聚合鏈式反應（qPCR)進行。
8. 權利要求7的方法，其特征在于BCL2L10基因過量表達的檢測通過比較基因組雜交 CGH方法、通過DNA芯片方法或定量聚合鏈式反應（qPCR)進行。
9. 權利要求8的方法，其特征在于BCL2L10基因過量表達的檢測通過DNA芯片方法或 定量聚合鏈式反應（qPCR)進行。
10. -種包含特異性結合取自患者的生物流體樣品細胞中的BCL2L10蛋白質(zhì)的生物分 子的體外分析試劑盒，所述試劑盒使得可預測所述生物流體中表達BCL2L10蛋白質(zhì)的細胞 的百分比大于介于20%和60%之間的參比閾值的患者對阿扎胞苷治療有耐藥性。
11. 權利要求6的分析試劑盒，其特征在于所述生物流體是骨髓。
12. -種包含選自以下至少一種試劑的體外分析試劑盒： -能夠擴增BCL2L10片段的一對引物，和 -能夠檢測BCL2L10存在的探針， 所述試劑盒使得可預測所述生物流體中表達BCL2L10的細胞的百分比大于介于20% 和60 %之間的參比閾值的患者對阿扎胞苷治療有耐藥性。
13. 權利要求10、11或12的試劑盒在實施用于監(jiān)測阿扎胞苷治療以預測復發(fā)的方法中 的用途。
14. 權利要求13的試劑盒的用途，其特征在于使得能夠根據(jù)所述患者的反應修改所述 治療。
15. 權利要求13或14的用途，其特征在于所述患者患有骨髓增生異常綜合征和/或急 性髓細胞白血病。
【文檔編號】G01N33/50GK104321649SQ201380013105
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2013年2月28日 優(yōu)先權日:2012年2月28日
【發(fā)明者】托馬斯·克魯塞奧, 帕特里克·奧伯格, 基洛姆·羅伯特, 弗雷德里克·盧西亞諾 申請人:尼斯-索菲亞·安蒂波利斯大學, 尼斯大學中心醫(yī)院, 國家健康和醫(yī)學研究院