氣相色譜-質(zhì)譜檢測發(fā)酵液中氨基酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測發(fā)酵液中氨基酸的方法，屬于生物化學檢驗測定【技術領域】。本發(fā)明檢測方法步驟包括：（1）取發(fā)酵液，高速離心，分別收集細胞和細胞外液；（2）發(fā)酵液樣品制備：取步驟1）得到的上清液加入乙腈除去蛋白，渦旋振蕩，再離心收集上清液Ⅲ，加入內(nèi)標物核糖醇溶液，室溫真空烘干，得到細胞外液樣品Ⅱ；（3）樣品衍生，加入糖衍生劑、氨基酸衍生劑；（4）氣相色譜-質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)采集。本發(fā)明具有樣品處理簡單，操作簡便，檢測氨基酸時間短，靈敏度高，檢測結果重復性高，可實現(xiàn)多個樣品制備等優(yōu)點。
【專利說明】氣相色譜-質(zhì)譜檢測發(fā)酵液中氨基酸的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化學檢驗測定【技術領域】，特別是涉及一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測發(fā)酵液中中氨基酸的方法。
【背景技術】
[0002]在利用氣相色譜-質(zhì)譜檢測氨基酸代謝物方面，目前已有相關技術報道，如專利201210046953.2，公布了一種氣相色譜一質(zhì)譜檢測尿氨基酸的方法，包括如下步驟:(I)對待檢尿液樣本完成尿酶處理；(2)加入內(nèi)標品，采用冷凍乙醇進行沉淀蛋白的處理，將樣本吹干；(3)對上述樣本進行甲基硅烷化衍生處理；(4)采用上述1-3的步驟處理標準氨基酸，得到標準氨基酸樣本；(5)采用氣相色譜一質(zhì)譜聯(lián)用儀對標準氨基酸樣本和待檢尿液樣本進行檢測；(6)以標準氨基酸樣本的檢測結果作為參比曲線，用常規(guī)算法對待檢尿液樣本的氨基酸進行定量。該專利發(fā)明主要應用領域為尿樣檢測，且該檢測方法僅局限于氨基酸代謝物的檢測。
[0003]對于微生物胞內(nèi)、胞外代謝物的檢測研究，可以揭示微生物在發(fā)酵條件下的代謝規(guī)律，尤其是發(fā)酵條件對于微生物目標產(chǎn)物的影響規(guī)律。掌握微生物的代謝規(guī)律可以不僅有利的促進目標產(chǎn)物的產(chǎn)量提升，而且可確定菌體內(nèi)的代謝通量分布，進而利用基因工程手段實現(xiàn)菌體內(nèi)代謝途徑的優(yōu)化與重構，實現(xiàn)目標產(chǎn)物高效生物合成。
[0004]目前對于發(fā)酵液中的代謝物分析檢測方法局限用于特定某類物質(zhì)，不可實現(xiàn)多類代謝物同時檢測。由于發(fā)酵液中各成分含量復雜多樣，對于樣品的處理方法很關鍵，目前還沒有相關發(fā)酵液中、細胞外代謝物的系統(tǒng)處理檢測方法，使得開發(fā)一種更為靈敏的、廣譜的、通用的發(fā)酵代謝物檢測方法 ，鑒定各種譜峰對映的化合物結構，以及與其它虛擬模型的整合，成為微生物代謝組研究的熱點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測發(fā)酵液中氨基酸的方法，彌補目前在微生物發(fā)酵中對代謝物系統(tǒng)檢測方法的空白，克服現(xiàn)有檢測技術干擾因素很多、操作繁瑣、測試成本高、靈敏度低、檢測范圍窄等缺點。
[0006]本發(fā)明的方案是通過這樣實現(xiàn)的:一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測發(fā)酵液中氨基酸的方法，檢測方法步驟包括:
(1)取發(fā)酵液，高速離心，分別收集菌體和上清液I;
(2)發(fā)酵液樣品制備:取6(T350ul步驟I)得到的上清液I，在清液I中加入乙腈除去蛋白，上清液I與乙腈體積比為1:0.5^1.5，渦旋振蕩，再離心收集上清液III，加入內(nèi)標物核糖醇溶液，上清液III體積與內(nèi)標物核糖醇重量比例為5(T300ul:20 μ g，室溫真空烘干，得到細胞外液樣品II ；
(3)樣品衍生:在步驟2)得到的樣品II中，分別加入5(Tl50ul糖衍生劑，恒溫放置1.5~4h，再分別加入5(Tl50ul氨基酸衍生劑，恒溫放置過夜，衍生完畢，離心衍生后的樣品II，收集上清得到待測胞內(nèi)樣品II ；
(4)利用氣相色譜-質(zhì)譜對步驟3)得到的待測胞內(nèi)樣品II，進行分析和數(shù)據(jù)采集。
[0007]作為本發(fā)明的進一步限定，所述菌體其取樣量為用冷甲醇溶解后生物量干重達
0.2^1.0g/ml ;所述的冷甲醇為經(jīng)過冷浴槽預冷至-40°C;所述低溫萃取為_40°C至_50°C下萃取2~7h。
[0008]作為本發(fā)明的進一步改進，所述糖衍生劑為0.1~0.3mg甲氧胺鹽酸溶于IOml吡啶溶液中配制而得；所述氨基酸衍生劑為5(T200ul三甲基氯硅烷溶于IOml的三氟乙酰胺中。
[0009]作為本發(fā)明的進一步改進，所述氣相色譜-質(zhì)譜其儀器分析條件為:氣相色譜:色譜柱為30 mX0.25 mm的HP-5MS或者DB-5MS毛細管柱，進樣口溫度300°C，檢測器溫度250°C，柱箱升溫程序平衡時間3 min — 80°C維持1min — 2V /min升溫至100°C— 15°C /min升溫至220°C— 30°C /min升溫至300°C— 300°C維持3 min,進樣體積IyL ;質(zhì)譜:離子源EI，檢測器為四級桿，電離能70 eV，離子源表面溫度280°C。
[0010]作為本發(fā)明的進一步改進，該方法應用于檢測酵母菌、乳酸菌、梭菌、霉菌的生物發(fā)酵過程中的發(fā)酵液中的氨基酸。
[0011]作為本發(fā)明的進一步改進，其特征在于，所述氨基酸為谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、賴氨酸、丙氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天門冬氨酸、天門冬酰胺、酪氨酸、脯氨酸。
[0012]本發(fā)明的實質(zhì)性特點和顯著進步是:(1)該方法可以檢測發(fā)酵液中氨基酸類物質(zhì)的檢測，不需要對發(fā)酵液進行多次復雜處理，節(jié)約時間和簡化操作步驟，及時得到發(fā)酵過程中微生物代謝規(guī)律，分析胞內(nèi)代謝流量。(2)該方法采用冷甲醇萃取發(fā)酵液中代謝物法，其萃取效果優(yōu)良，獲得發(fā)酵液中較多代謝物種類，有利于代謝規(guī)律的分析。(3)樣品分析得到的色譜峰分析效果良好，可對谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、賴氨酸、丙氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天門冬氨酸、天門冬酰胺、酪氨酸、脯氨酸等氨基酸實現(xiàn)檢測。
【具體實施方式】
[0013]下面將通過實施例對本發(fā)明方法進一步的描述，這些描述并不是對本
【發(fā)明內(nèi)容】
作進一步的限定。
[0014]以下實施例中離心條件為:_4°C下10000 rpm離心10 min。
[0015]以下實施例中氣相色譜-質(zhì)譜其儀器分析條件為:氣相色譜:色譜柱為30mX 0.25 mm的HP-5MS或者DB-5MS毛細管柱，進樣口溫度300°C，檢測器溫度250°C，柱箱升溫程序平衡時間3 min — 80°C維持Imin — 2V /min升溫至100°C— 15°C /min升溫至2200C- 30°C /min升溫至300°C— 300°C維持3 min，進樣體積1 μ L ;質(zhì)譜:離子源EI，檢測器為四級桿，電離能70 eV，離子源表面溫度280°C。
[0016]以下實施例皆可實現(xiàn)對谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、賴氨酸、丙氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天門冬氨酸、天門冬酰胺、酪氨酸、脯氨酸等氨基酸進行檢測。
[0017]實施例1 取酵母菌發(fā)酵液。[0018](I)細胞內(nèi)代謝物樣品制備:取5ml發(fā)酵液，離心得到菌體，用生理鹽水清洗菌體2次，-40°C冷甲醇溶解后生物量干重達0.2g/ml，超聲破碎至細胞裂解，得到裂解液，低溫萃取裂解液，低溫條件為:-40°C至-50°C下萃取4h，離心收集150ul萃取后裂解上清液I，力口入內(nèi)標物核糖醇溶液，裂解上清液I體積與內(nèi)標物核糖醇重量比例為150ul:20y g，室溫真空烘干，得到細胞內(nèi)代謝物樣品I。
[0019](2)細胞外液樣品制備:取發(fā)酵液，離心得到上清液II，取300ul上清液II，在清液II中加入乙腈除去蛋白，上清液II與乙腈體積比為1: 1.2，渦旋振蕩，再離心收集得上清液III，加入內(nèi)標物核糖醇溶液，上清液III體積與內(nèi)標物核糖醇重量比例為IOOul:20yg，室溫真空烘干，得到細胞外液樣品II。
[0020](3)樣品衍生:在步驟I)和步驟2)得到的樣品I和樣品II中，分別加入IOOul糖衍生劑(糖衍生劑為0.1mg甲氧胺鹽酸溶于IOml吡啶溶液中配制而得)，恒溫放置1.5h，再分別加入IOOul氨基酸衍生劑(氨基酸衍生劑為IOOul三甲基氯硅烷溶于IOml的三氟乙酰胺中配制而得)，恒溫放置過夜，衍生完畢，分別離心衍生后的樣品I和樣品II，對應收集各自上清得到待測胞內(nèi)樣品I和待測胞外樣品II。
[0021](4)按照氣相色譜-質(zhì)譜其儀器分析條件，對待測胞內(nèi)樣品I和待測胞外樣品II進行分析和數(shù)據(jù)采集。
[0022]實施例2
取霉菌發(fā)酵液。
[0023](I)細胞內(nèi)代謝物樣品制備:取5ml發(fā)酵液，離心得到菌體，用生理鹽水清洗菌體3次，-40°C冷甲醇溶解后生物量干重達1.0g/ml，超聲破碎至細胞裂解，得到裂解液，低溫萃取裂解液，低溫條件為:-40°C至-50°C下萃取5h，離心收集IOOul萃取后裂解上清液I，力口入內(nèi)標物核糖醇溶液，裂解上清液I體積與內(nèi)標物核糖醇重量比例為IOOul: 20 μ g，室溫真空烘干，得到細胞內(nèi)代謝物樣品I。
[0024](2)細胞外液樣品制備:取發(fā)酵液，離心得到上清液II，取350ul上清液II，在清液II中加入乙腈除去蛋白，上清液II與乙腈體積比為1:0.7，渦旋振蕩，再離心收集得上清液III，加入內(nèi)標物核糖醇溶液，上清液III體積與內(nèi)標物核糖醇重量比例為200ul:20μ g，室溫真空烘干，得到細胞外液樣品II。
[0025](3)樣品衍生:在步驟I)和步驟2)得到的樣品I和樣品II中，分別加入50ul糖衍生劑(糖衍生劑為0.3mg甲氧胺鹽酸溶于IOml吡啶溶液中配制而得)，恒溫放置2.0h，再分別加入150ul氨基酸衍生劑(氨基酸衍生劑為150ul三甲基氯硅烷溶于IOml的三氟乙酰胺中配制而得)，恒溫放置過夜，衍生完畢，分別離心衍生后的樣品I和樣品II，對應收集各自上清得到待測胞內(nèi)樣品I和待測胞外樣品II。
[0026](4)按照氣相色譜-質(zhì)譜其儀器分析條件，對待測胞內(nèi)樣品I和待測胞外樣品II進行分析和數(shù)據(jù)采集。
[0027]實施例3 取酵母菌發(fā)酵液。
[0028](I)細胞內(nèi)代謝物樣品制備:取5ml發(fā)酵液，離心得到菌體，用生理鹽水清洗菌體3次，-40°C冷甲醇溶解后生物量干重達0.6g/ml，超聲破碎至細胞裂解，得到裂解液，低溫萃取裂解液，低溫條件為:-40°C至-50°C下萃取3h，離心收集200ul萃取后裂解上清液I，力口入內(nèi)標物核糖醇溶液，裂解上清液I體積與內(nèi)標物核糖醇重量比例為200ul:20y g，室溫真空烘干，得到細胞內(nèi)代謝物樣品I。
[0029](2)細胞外液樣品制備:取發(fā)酵液，離心得到上清液II，取60ul上清液II，在清液II中加入乙腈除去蛋白，上清液II與乙腈體積比為1:1.5，渦旋振蕩，再離心收集得上清液III，加入內(nèi)標物核糖醇溶液，上清液III體積與內(nèi)標物核糖醇重量比例為50ul:20μ g，室溫真空烘干，得到細胞外液樣品II。
[0030](3)樣品衍生:在步驟I)和步驟2)得到的樣品I和樣品II中，分別加入150ul糖衍生劑(糖衍生劑為0.15mg甲氧胺鹽酸溶于IOml吡啶溶液中配制而得)，恒溫放置2.5h，再分別加入50ul氨基酸衍生劑(氨基酸衍生劑為200ul三甲基氯硅烷溶于IOml的三氟乙酰胺中配制而得)，恒溫放置過夜，衍生完畢，分別離心衍生后的樣品I和樣品II，對應收集各自上清得到待測胞內(nèi)樣品I和待測胞外樣品II。
[0031](4)按照氣相色譜-質(zhì)譜其儀器分析條件，對待測胞內(nèi)樣品I和待測胞外樣品II進行分析和數(shù)據(jù)采集。
[0032]實施例4 取乳酸菌發(fā)酵液。
[0033](I)細胞內(nèi)代謝物樣品制備:取5ml發(fā)酵液，離心得到菌體，用生理鹽水清洗菌體2次，-40°C冷甲醇溶解后生物量干重達0.8g/ml，超聲破碎至細胞裂解，得到裂解液，低溫萃取裂解液，低溫條件為:-40°C至-50°C下萃取2h，離心收集50ul萃取后裂解上清液I，加入內(nèi)標物核糖醇溶液，裂解上清液I體積與內(nèi)標物核糖醇重量比例為50ul:20y g，室溫真空烘干，得到細胞內(nèi)代謝物樣品I。
[0034](2)細胞外液樣品制備:取發(fā)酵液，離心得到上清液II，取200ul上清液II，在清液II中加入乙腈除去蛋白，上清液II與乙腈體積比為1: 1.0，渦旋振蕩，再離心收集得上清液III，加入內(nèi)標物核糖醇溶液，上清液III體積與內(nèi)標物核糖醇重量比例為150ul:20yg，室溫真空烘干，得到細胞外液樣品II。
[0035](3)樣品衍生:在步驟I)和步驟2)得到的樣品I和樣品II中，分別加入120ul糖衍生劑(糖衍生劑為0.2mg甲氧胺鹽酸溶于IOml吡啶溶液中配制而得)，恒溫放置3.0h，再分別加入80ul氨基酸衍生劑(氨基酸衍生劑為50ul三甲基氯硅烷溶于IOml的三氟乙酰胺中配制而得)，恒溫放置過夜，衍生完畢，分別離心衍生后的樣品I和樣品II，對應收集各自上清得到待測胞內(nèi)樣品I和待測胞外樣品II。
[0036](4)按照氣相色譜-質(zhì)譜其儀器分析條件，對待測胞內(nèi)樣品I和待測胞外樣品II進行分析和數(shù)據(jù)采集。
[0037]實施例5 取酵母菌發(fā)酵液。
[0038](I)細胞內(nèi)代謝物樣品制備:取5ml發(fā)酵液，離心得到菌體，用生理鹽水清洗菌體3次，-40°C冷甲醇溶解后生物量干重達0.5g/ml，超聲破碎至細胞裂解，得到裂解液，低溫萃取裂解液，低溫條件為:-40°C至-50°C下萃取3h，離心收集200ul萃取后裂解上清液I，力口入內(nèi)標物核糖醇溶液，裂解上清液I體積與內(nèi)標物核糖醇重量比例為150ul:20y g，室溫真空烘干，得到細胞內(nèi)代謝物樣品I。
[0039](2)細胞外液樣品制備:取發(fā)酵液，離心得到上清液II，取300ul上清液II，在清液II中加入乙腈除去蛋白，上清液II與乙腈體積比為1:0.5，渦旋振蕩，再離心收集得上清液III，加入內(nèi)標物核糖醇溶液，上清液III體積與內(nèi)標物核糖醇重量比例為300ul:20μ g，室溫真空烘干，得到細胞外液樣品II。
[0040](3)樣品衍生:在步驟I)和步驟2)得到的樣品I和樣品II中，分別加入IOOul糖衍生劑(糖衍生劑為0.2mg甲氧胺鹽酸溶于IOml吡啶溶液中配制而得)，恒溫放置4.0h，再分別加入120ul氨基酸衍生劑(氨基酸衍生劑為120ul三甲基氯硅烷溶于IOml的三氟乙酰胺中配制而得)，恒溫放置過夜，衍生完畢，分別離心衍生后的樣品I和樣品II，對應收集各自上清得到待測胞內(nèi)樣品I和待測胞外樣品II。
[0041](4)按照氣相色譜-質(zhì)譜其儀器分析條件，對待測胞內(nèi)樣品I和待測胞外樣品II進行分析和數(shù)據(jù)采集。
【權利要求】
1.一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測發(fā)酵液中氨基酸的方法，其特征在于，檢測方法步驟包括: (1)取發(fā)酵液，高速離心，分別收集菌體和上清液I; (2)發(fā)酵液樣品制備:取6(T350ul步驟I)得到的上清液I，在清液I中加入乙腈除去蛋白，上清液I與乙腈體積比為1:0.5^1.5，渦旋振蕩，再離心收集上清液III，加入內(nèi)標物核糖醇溶液，上清液III體積與內(nèi)標物核糖醇重量比例為5(T300ul:20 μ g，室溫真空烘干，得到細胞外液樣品II ； (3)樣品衍生:在步驟2)得到的樣品II中，分別加入5(Tl50ul糖衍生劑，恒溫放置1.5~4h，再分別加入5(Tl50ul氨基酸衍生劑，恒溫放置過夜，衍生完畢，離心衍生后的樣品II，收集上清得到待測胞內(nèi)樣品II ； (4)利用氣相色譜-質(zhì)譜對步驟3)得到的待測胞內(nèi)樣品II，進行分析和數(shù)據(jù)采集。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測發(fā)酵液中氨基酸的方法，其特征在于，所述菌體其取樣量為用冷甲醇溶解后生物量干重達0.2^1.0g/ml ;所述的冷甲醇為經(jīng)過冷浴槽預冷至_40°C ;所述低溫萃取為-40°C至-50°C下萃取2~7h。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測發(fā)酵液中氨基酸的方法，其特征在于，所述糖衍生劑為0.1~0.3mg甲氧胺鹽酸溶于IOml吡啶溶液中配制而得；所述氨基酸衍生劑為5(T200ul三甲基氯硅烷溶于IOml的三氟乙酰胺中。
4.根據(jù)權利要求3所述的一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測發(fā)酵液中氨基酸的方法，其特征在于，所述氣相色譜-質(zhì)譜其儀器分析條件為:氣相色譜:色譜柱為30 mX0.25 mm的HP-5MS或者DB-5MS毛細管柱，進樣口溫度300°C，檢測器溫度250°C，柱箱升溫程序平衡時間3min — 80°C維持 Imin — 2°C /min 升溫至 100°C— 15°C /min 升溫至 22CTC— 30°C /min 升溫至300°C— 300°C維持3 min，進樣體積I μ L ;質(zhì)譜:離子源ΕΙ，檢測器為四級桿，電離能70 eV，離子源表面溫度280°C。
5.根據(jù)權利要求4所述一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測發(fā)酵液中氨基酸的方法，其特征在于，該方法應用于檢測酵母菌、乳酸菌、梭菌、霉菌的生物發(fā)酵過程中的發(fā)酵液中的氨基酸。
6.根據(jù)權利要求1~2或4飛任一項所述的一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測發(fā)酵液中氨基酸的方法，其特征在于，所述氨基酸為谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、賴氨酸、丙氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天門冬氨酸、天門冬酰胺、酪氨酸、脯氨酸。
7.根據(jù)權利要求3所述的一種氣相色譜-質(zhì)譜檢測發(fā)酵液中氨基酸的方法，其特征在于，所述氨基酸為谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、纈氨酸、賴氨酸、丙氨酸、組氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天門冬氨酸、天門冬酰胺、酪氨酸、脯氨酸。
【文檔編號】G01N30/88GK103698451SQ201310648730
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月5日 優(yōu)先權日:2013年12月5日
【發(fā)明者】陳東, 梁遠雄 申請人:柳州聯(lián)?？萍加邢薰?br>