一種中藥注射液的核磁共振檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種核磁共振方式介導(dǎo)的丹紅注射液的中藥注射液檢測(cè)方法，針對(duì)該中藥注射液中氨基酸、有機(jī)酸和糖類化合物建立質(zhì)子核磁共振(1H-NMR)指紋圖譜的定性、定量檢測(cè)方法。該方法具有簡(jiǎn)便易行、穩(wěn)定性好、精密度高、重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)等特點(diǎn)，在全面檢測(cè)丹紅注射液質(zhì)量方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】一種中藥注射液的核磁共振檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種中藥注射液的檢測(cè)方法，特別是涉及丹紅注射液用核磁共振方式介導(dǎo)的檢測(cè)方法，屬于醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]丹紅注射液組方以丹參750份、紅花250份組成，其中丹參為主藥，紅花為輔藥的復(fù)方制劑。具有活血化瘀，通脈舒絡(luò)，祛痰生新，除邪不傷正的功效。臨床上用于治療瘀血閉阻所致的胸痹及中風(fēng)、冠心病、心絞痛、心肌梗塞等癥。相關(guān)文獻(xiàn)和專利已報(bào)道了有關(guān)丹紅注射液的質(zhì)量檢測(cè)方法，建立了丹紅注射液的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜，盡管該方法具有許多優(yōu)點(diǎn)，但仍然存在以下缺陷:①色譜分離損失:常用ODS色譜柱在分離過(guò)程中損失極性較大的水溶性成分。②缺乏通用型檢測(cè)器:只能在同一張譜圖下檢測(cè)出某類或某幾類化學(xué)成分。③標(biāo)準(zhǔn)品難分離:不易獲得，為化學(xué)成分的鑒定和定量分析帶來(lái)了困難，同時(shí)也提高了工業(yè)生產(chǎn)成本。因此，丹紅注射液中的氨基酸、有機(jī)酸和糖類化合物是HPLC指紋圖譜技術(shù)的檢測(cè)盲點(diǎn)。
[0003]近年由于核磁譜儀獲得長(zhǎng)足的進(jìn)步，質(zhì)子定量核磁CH-qNMR)的靈敏度、精確度、分析速度以及不確定度等方面已達(dá)到或接近HPLC的水平。在美國(guó)和歐洲1H-CiNMR方法因其特有優(yōu)勢(shì)而獲得越來(lái)越多的關(guān)注，主要應(yīng)用于藥物的發(fā)現(xiàn)，藥物含量測(cè)定和植物代謝產(chǎn)物的定量分析，在食品工業(yè)中用于食品產(chǎn)地的辨別、成分分析、真?zhèn)闻卸?、質(zhì)量評(píng)價(jià)等方面。繼美國(guó)和歐洲等國(guó)將qNMR方法收錄2008版藥典之后，我國(guó)2010版藥典也將qNMR方法收載于附錄中。但在我國(guó)，定量核磁技術(shù)在藥物或食品分析領(lǐng)域中的應(yīng)用尚屬起步階段。與HPLC指紋圖譜相比，以1H-CiNMR為基礎(chǔ)的指紋圖譜技術(shù)具有以下優(yōu)勢(shì):①無(wú)需樣品預(yù)分離，可避免由于預(yù)處理造成的成分丟失。②無(wú)需進(jìn)行柱色譜分離，保持原有平衡環(huán)境，對(duì)樣品無(wú)損傷，不破壞其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。③可提供詳盡的分子結(jié)構(gòu)信息，具有特征性和可解析性。④無(wú)需標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品。質(zhì)子信號(hào)峰與各個(gè)化學(xué)組分的氫原子一一對(duì)應(yīng)，響應(yīng)值和靈敏度無(wú)偏向性，質(zhì)子信號(hào)峰的相對(duì)積分面積可反映各個(gè)化學(xué)組分的相對(duì)含量，不需額外制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，具有可定量性。⑤隨著400M-600M Hz核磁譜儀的普及和自動(dòng)化的提高，儀器不再局限于科研院所，越來(lái)越多的藥廠擁有一臺(tái)甚至多臺(tái)儀器，為該方法在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了硬件保障。
[0004]因此，本發(fā)明采用定性、定量的質(zhì)子核磁共振指紋圖譜技術(shù)，建立一種針對(duì)丹紅注射液中氨基酸、有機(jī)酸和糖類化合物的質(zhì)量檢測(cè)方法，在工業(yè)生產(chǎn)中與HPLC指紋圖譜聯(lián)合使用，實(shí)現(xiàn)對(duì)丹紅注射液產(chǎn)品的全面質(zhì)量檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是提供了一種名為丹紅注射液的中藥注射液的1H-NMR指紋圖譜質(zhì)量檢測(cè)方法，可以有效解決丹紅注射液中氨基酸、有機(jī)酸和糖類化合物的含量測(cè)定問(wèn)題，為丹紅注射液全面質(zhì)量檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是通過(guò)下列關(guān)鍵步驟實(shí)現(xiàn)的:
[0007]①丹紅注射液供試樣品溶液的制備
[0008]丹紅注射液樣品凍干后精密稱取18mg，加入0.6ml D2O,含內(nèi)標(biāo)3_三甲基硅基丙酸鈉-d4 (TSP) 0.01g/ml,即得丹紅注射液樣品溶液，轉(zhuǎn)移至5mm核磁管中，加封直接用于1H-NMR 測(cè)試。
[0009]②標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備
[0010]分別精密稱取異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、琥珀酸、天門冬氨酸、丙二酸、葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甲酸各5mg，溶于0.6mlD2O (含內(nèi)標(biāo)TSP0.004g / ml)，即得標(biāo)準(zhǔn)品溶液，轉(zhuǎn)移至5mm核磁管中，加封直接用于1H-NMR測(cè)試。
[0011]③1H-NMR指紋圖譜的測(cè)定
[0012]將核磁管置于核磁共振儀中，采用水峰抑制脈沖序列測(cè)定丹紅注射液樣品溶液的1H-NMR指紋圖譜和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的1H-NMR圖譜。優(yōu)化的測(cè)試參數(shù)及條件為:抑水峰序列zgcppr，觀測(cè)頻率600.23MHz，測(cè)定溫度298K，譜寬12019.2Hz，90。脈沖寬度13 μ S，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)65536，掃描次數(shù)16次，延遲時(shí)間2s，接受增益128。
[0013]④質(zhì)子信號(hào)峰的解析與鑒定
[0014]丹紅注射液對(duì)照品溶液的1H-NMR圖譜上質(zhì)子信號(hào)峰分布在60-9.0之間(圖1)，其中60.0-3.2是氨基酸和有機(jī)酸質(zhì)子特征信號(hào)區(qū)，63.3-5.5是糖基質(zhì)子特征信號(hào)區(qū)。根據(jù)質(zhì)子信號(hào)峰的化學(xué)位移值和偶合裂分情況，結(jié)合丹紅注射液對(duì)照樣品的二維核磁圖譜信息和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的1H-NMR圖譜(圖2-圖18)，鑒定出7個(gè)氨基酸類、4個(gè)有機(jī)酸類和6個(gè)糖類化合物，分別為:
[0015]氨基酸類:
[0016]異亮氛酸0.93 (t)，1.00 (d)，1.25 (m)，1.45 (m)，1.97 (m)
[0017]纈氨酸0.98(d) ,1.03(d)
[0018]蘇氛酸1.31 (d, 6.7)，3.58 (m)，4.25 (m)
[0019]丙氨酸1.47 (d，7.4)，3.78 (m)
[0020]焦谷氨酸2.04 (m)，2.41 (m) ,2.51 (m), 4.18 (m)
[0021 ]脯氨酸 2.00 (m)，2.34 (m)，3.34 (m)，3.42 (m)，4.14 (m)
[0022]天門冬氨酸2.76 (dd) ,2.97 (dd) ,3.99 (m)
[0023]有機(jī)酸類:
[0024]乙酸1.92 (S)
[0025]琥珀酸2.42 (S)
[0026]丙二酸3.19 (S)
[0027]甲酸8.42 (S)
[0028]糖類:
[0029]葡萄糖5.24 (d)，4.56(d)，3.88 (m)，3.81 (m)，3.75 (m)，3.69 (m)，3.52 (m)，3.48 (m)，3.37 (m)，3.24 (m)
[0030]果糖4.10 (m)，4.04 (m)，3.99 (m)，3.89 (m)，3.79 (m)，3.67 (m)，3.54 (m)
[0031]半乳糖5.26(d)，4.57(d)，4.07(m)，3.98(m)，3.92(m)，3.84(m)，3.79(m)，3.73 (m)，3.67 (m)，3.48 (m)
[0032]鼠李糖 5.18 (d, 1.7Hz)，3.91 (m)，3.79 (m)，3.43 (m)，3.85 (m)，3.92 (m)，3.59 (m)，
3.37 (m)，3.43 (m)
[0033]阿拉伯糖5.24 (d) ,4.51(d), 4.09 (m)，4.04 (m)，3.99 (m)，3.94 (m)，3.87 (m)，
3.80 (m), 3.65 (m), 3.50 (m)
[0034]蕓香糖5.42 (d), 4.50 (d)
[0035]⑤1H-NMR多成分的含量測(cè)定
[0036]選擇17個(gè)化合物中獨(dú)立的特征質(zhì)子信號(hào)峰作為定量峰，3-三甲基硅基丙酸鈉-d4(TSP)為內(nèi)標(biāo)化合物，應(yīng)用以下公式測(cè)定丹紅注射液中異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、琥珀酸、天門冬氨酸、丙二酸、葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、蕓香糖、甲酸的含量。
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[0038]其中Cm和Ctsp分別為化合物和TSP的濃度，Am和Atsp分別是化合物定量峰和TSP甲基峰的積分面積，Nm和Ntsp分別代表化合物定量峰和TSP甲基峰的質(zhì)子個(gè)數(shù)，Tm和Ttsp分別是化合物和TSP的弛豫時(shí)間。
[0039]⑥綜合待測(cè)產(chǎn)品的1H-NMR指紋圖譜相似度信息和含量測(cè)定的結(jié)果評(píng)價(jià)注射液產(chǎn)品的質(zhì)量。
[0040]采用MetresNova軟件對(duì)得到的1H-NMR指紋圖譜進(jìn)行相位調(diào)整、基線校正、分段積分等數(shù)據(jù)處理。計(jì)算不同批次樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的夾角余弦值、相關(guān)系數(shù)相似度；根據(jù)⑤項(xiàng)下方法測(cè)定氨基酸、有機(jī)酸和糖類等17個(gè)化合物的含量。
[0041]本發(fā)明的原理是建立起丹紅注射液的1H-NMR指紋圖譜，在一張圖譜上同時(shí)完成了對(duì)丹紅注射液中的氨基酸、有機(jī)酸和糖類成分的定性、定量檢測(cè)，彌補(bǔ)了常用HPLC指紋圖譜對(duì)上述成分無(wú)法檢測(cè)的缺陷。本發(fā)明具有方法簡(jiǎn)便易行、穩(wěn)定性好、精密度高、重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)等特點(diǎn)，在全面檢測(cè)丹紅注射液質(zhì)量方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0042]圖1為丹紅注射液對(duì)照品溶液的1H-NMR指紋圖譜。
[0043]圖2-圖18分別為異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、乙酸、丙氨酸、焦谷氨酸、琥珀酸、丙二酸、脯氨酸、天門冬氨酸、葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甲酸、蕓香糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的1H-NMR圖譜。
[0044]圖19為10批丹紅注射液樣品溶液1H-NMR指紋圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0045]實(shí)施例1:丹紅注射液1H-NMR標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的建立
[0046]1.1儀器與試藥
[0047]BRUKER AVANCE III600型超導(dǎo)核磁共振波譜儀，質(zhì)子激發(fā)頻率600.23MHz，配置BBFO正相觀察寬帶探頭和BVT3200數(shù)字控溫儀；美國(guó)Wilmad WG-5000核磁樣品管；D20氘代度>99.8%，美國(guó)Norell公司生產(chǎn)；3_三甲基硅基丙酸鈉_d4 (TSP)氘代度>98%，Sigma-Aldrich公司生產(chǎn)；實(shí)驗(yàn)用丹紅注射液為市售產(chǎn)品，規(guī)格為每支裝10ml，生產(chǎn)廠家山東菏澤步長(zhǎng)制藥有限公司，10批樣品批號(hào)分別為12051069，12051076，12051006，12051007，12061020，12061036，12061042，12061050，12071001，12071045。
[0048]1.2丹紅注射液供試品溶液的制備
[0049]取丹紅注射液樣品于-80°C冰箱中迅速冷凍，再將其放入真空冷凍干燥箱中凍干后精密稱取18mg，加入0.6ml D2O (含內(nèi)標(biāo)TSP0.01g / ml)，轉(zhuǎn)移至5mm核磁管中，加封直接用于1H-NMR測(cè)試。
[0050]1.S1H-NMR指紋圖譜的測(cè)定
[0051]將核磁管置于核磁共振儀中，采用水峰抑制脈沖序列zgcppr測(cè)定丹紅注射液樣品溶液的1H-NMR指紋圖譜。觀測(cè)頻率600.23MHz，測(cè)定溫度298K，譜寬12019.2Hz，90°脈沖寬度13 μ S，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)65536，掃描次數(shù)16次，延遲時(shí)間2s，接受增益128。
[0052]1.41H-NMR指紋圖譜質(zhì)子信號(hào)峰的鑒定
[0053]1H-NMR指紋圖譜經(jīng)過(guò)相位校正、基線校正和化學(xué)位移校正后，根據(jù)質(zhì)子信號(hào)峰的化學(xué)位移值和偶合裂分情況，結(jié)合丹紅注射液對(duì)照樣品的二維核磁圖譜信息和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的1H-NMR圖譜鑒定出異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、琥珀酸、天門冬氨酸、丙二酸、葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、蕓香糖、甲酸共17個(gè)氨基酸、有機(jī)酸和糖類化合物。選擇各個(gè)化合物中特征質(zhì)子信號(hào)峰作為定量峰(表1)。
[0054]1.5方法學(xué)考察
[0055]儀器精密度試驗(yàn):取同一份丹紅注射液供試品溶液，在上述1H-NMR測(cè)試條件下連續(xù)6次測(cè)定指紋圖譜，連續(xù)測(cè)定三天，17個(gè)化合物的特征質(zhì)子信號(hào)峰積分面積RSD在
·0.20—1.62%，說(shuō)明該方法日內(nèi)和日間精密度良好。
[0056]重復(fù)性試驗(yàn):取同一批次丹紅注射液供試品溶液6份，測(cè)試1H-NMR指紋圖譜，17個(gè)化合物的特征質(zhì)子信號(hào)峰積分面積RSD在1.21-3.28%，表明該方法的重現(xiàn)性良好。
[0057]穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一份丹紅注射液供試品溶液，分別在0，2,4,6h測(cè)試1H-NMR指紋圖譜，17個(gè)化合物的特征質(zhì)子信號(hào)峰積分面積RSD在0.37-3.10%，表明供試品溶液在常溫實(shí)驗(yàn)條件下穩(wěn)定性良好。
[0058]表11H-NMR定量質(zhì)子信號(hào)峰和方法學(xué)考察
[0059]
【權(quán)利要求】
1.一種中藥注射液的核磁共振質(zhì)量檢測(cè)方法，制備該中藥注射液的原料由丹參750份和紅花250份組成，其特征在于質(zhì)量檢測(cè)方法包括以下步驟: 1)精密稱取中藥注射液凍干后的樣品，加入含化學(xué)名稱為3-三甲基硅基丙酸鈉-d4，簡(jiǎn)寫為含TSP的內(nèi)標(biāo)物的D2O重水溶解，得中藥注射液樣品溶液； 2)分別精密稱取異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、琥珀酸、天門冬氨酸、丙二酸、葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甲酸，溶于含內(nèi)標(biāo)TSP的％0重水即得標(biāo)準(zhǔn)品溶液，轉(zhuǎn)移至5mm核磁管中，加封直接用于1H-NMR測(cè)試； 3)將核磁管置于核磁共振儀中，采用水峰抑制脈沖序列測(cè)定中藥注射液樣品溶液的1H — NMR指紋圖譜和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的1H — NMR圖譜； 4)根據(jù)質(zhì)子信號(hào)峰的化學(xué)位移值和偶合裂分情況，結(jié)合中藥注射液對(duì)照樣品的二維核磁圖譜信息和標(biāo)準(zhǔn)品溶液的1H — NMR圖譜，解析并鑒定中藥注射液1H — NMR指紋圖譜上的質(zhì)子特征信號(hào)峰； 5)選擇17個(gè)化合物中獨(dú)立的特征質(zhì)子信號(hào)峰作為定量峰，TSP為內(nèi)標(biāo)化合物，測(cè)定中藥注射液中異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、琥珀酸、天門冬氨酸、丙二酸、葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、蕓香糖、甲酸的含量； 6)綜合待測(cè)產(chǎn)品的1H—NMR指紋圖譜相似度信息和含量測(cè)定的結(jié)果評(píng)價(jià)注射液產(chǎn)品的質(zhì)量，即得。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)量檢測(cè)方法，其特征在于:步驟I)中精密稱取18mg中藥注射液樣品的凍干粉，加入含內(nèi)標(biāo)TSP0.02g / ml的0.6ml D2O,即得中藥注射液樣品溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)量檢測(cè)方法，其特征在于:步驟2)中分別精密稱取異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、琥珀酸、天門冬氨酸、丙二酸、葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甲酸各5mg,溶于含內(nèi)標(biāo)TSP0.004g / ml的0.6mlD20,即得標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)量檢測(cè)方法，其特征在于步驟3)中優(yōu)化的核磁測(cè)試參數(shù)和條件為:抑水峰序列zgcppr，觀測(cè)頻率600.23MHz，測(cè)定溫度298K，譜寬12019.2Hz，90°脈沖寬度13 μ S，采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)65536，掃描次數(shù)16次，延遲時(shí)間2s，接受增益128。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)量檢測(cè)方法，其特征在于:步驟4)中鑒定出7個(gè)氨基酸類、4個(gè)有機(jī)酸類和6個(gè)糖類共17個(gè)化合物，分別為異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、乙酸、脯氨酸、焦谷氨酸、琥珀酸、天門冬氨酸、丙二酸、甲酸、葡萄糖、果糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖和蕓香糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)量檢測(cè)方法，其特征在于:步驟5)中按照以下公式計(jì)算17個(gè)成分的含量: r _ Ntsp y Aom l-exp(-t/Titsp)
NmAotsp 其中Cm和Ctsp分別為化合物和TSP的濃度，Am和Atsp分別是化合物定量峰和TSP甲基峰的積分面積，Nm和Ntsp分別代表化合物定量峰和TSP甲基峰的質(zhì)子個(gè)數(shù)，Tffl和Ttsp分別是化合物和TSP的弛豫時(shí)間。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的質(zhì)量檢測(cè)方法，其特征在于:步驟6)中采用MetresNova軟件對(duì)得到的1H — NMR指紋圖譜進(jìn)行相位調(diào)整、基線校正、分段積分等數(shù)據(jù)處理，分別采用夾角余弦值、相關(guān)系數(shù)法評(píng)價(jià)不同批次樣品指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜的相似度，17個(gè)化合物含量總和達(dá)丹紅 注射液固含物的40%以上。
【文檔編號(hào)】G01N24/08GK103713004SQ201310567602
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月8日
【發(fā)明者】姜苗苗, 王躍飛, 焦玉嬌, 朱彥, 趙步長(zhǎng), 賈立夫, 陸世海, 王春華 申請(qǐng)人:菏澤步長(zhǎng)制藥有限公司, 天津中醫(yī)藥大學(xué)