豬圓環(huán)病毒2型病毒抗體競(jìng)爭(zhēng) AlphaLISA檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種豬圓環(huán)病毒2型抗體競(jìng)爭(zhēng)AlphaLISA檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，其包括供體微珠、受體微珠、豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白單克隆抗體及帶His標(biāo)簽的Cap蛋白抗原。本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化供體微珠、受體微珠、單克隆抗體、抗原以及血清等試驗(yàn)反應(yīng)條件，建立了檢測(cè)PCV抗體的競(jìng)爭(zhēng)AlphaLISA檢測(cè)方法。利用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行PCV抗體的檢測(cè)，特異性好，靈敏度高，血清用量少，不需洗滌，不受溶血影響，檢測(cè)成本低，檢測(cè)時(shí)間短。
【專利說(shuō)明】豬圓環(huán)病毒2型病毒抗體競(jìng)爭(zhēng)AI phaL ISA檢測(cè)試劑盒及檢 測(cè)方法【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明涉及豬圓環(huán)病毒2型抗體的免疫學(xué)檢測(cè)，具體涉及一種豬圓環(huán)病毒2型病 毒抗體競(jìng)爭(zhēng)AlphaLISA檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法?！颈尘凹夹g(shù)】[0002]豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus,PCV)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，為無(wú)囊膜的 單股負(fù)鏈DNA病毒，是已知的最小的動(dòng)物病毒之一，主要分為2個(gè)基因型，即PCVl和PCV2。 PCVl無(wú)致病性，廣泛存在于豬群中。PCV2感染可引起多種疾病綜合征，如斷奶仔豬多系統(tǒng) 衰竭綜合征、懷孕母豬繁殖障礙、斷奶豬和育肥豬呼吸道疾病、豬皮炎和腎炎綜合征、幼齡 仔豬A 2型先天性震顫等疾病。PCV2是20世紀(jì)90年代初首先從出現(xiàn)斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭 綜合征的病豬體內(nèi)分離出的一種病原，如今已成為嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的主要病原之 一，引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。我國(guó)自2000年報(bào)道首例豬圓環(huán)病毒感染以來(lái)，該病已 普遍發(fā)生，表現(xiàn)為流行范圍廣，陽(yáng)性率高，混合感染嚴(yán)重，種豬感染率高，在臨床上表現(xiàn)為不 同的臨床綜合征，已嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。[0003]針對(duì)該病現(xiàn)有的檢測(cè)方法主要有病毒的分離鑒定、免疫過(guò)氧化物酶技術(shù)，原位雜 交(ISH)，免疫膠體金技術(shù)，免疫熒光試驗(yàn)，免疫組化技術(shù)，抗原捕獲ELISA，PCR和real time PCR等，各有優(yōu)缺，且特異性差異較大。同時(shí)，方法對(duì)樣品和人員的要求較高。由于豬 感染豬圓環(huán)病毒2型或免疫豬圓環(huán)病毒疫苗均能產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，且抗體能較好的反應(yīng)其 免疫或感染病毒的情況，因此，可以通過(guò)檢測(cè)PCV的抗體來(lái)反應(yīng)其免疫感染病毒情況。[0004]AlphaLISA技術(shù)主要依賴于Alpha供體微珠和受體微珠的相互作用。當(dāng)生物反應(yīng) 使供體微珠和受體微珠相互接近時(shí)，激光激發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而產(chǎn)生極大放大的信號(hào)。具體 來(lái)說(shuō)，在680nm的激光照射下，供體微珠上的光敏劑將周圍環(huán)境中的氧氣轉(zhuǎn)化為更為活 躍的單體氧。單體氧擴(kuò)散至受體微珠，產(chǎn)生一系列的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，最后將能量傳遞到銪， 發(fā)射波長(zhǎng)為615nm。在生物分子不存在特異的互相作用時(shí)，單體氧無(wú)法擴(kuò)散到受體微珠，則 不會(huì)有信號(hào)的產(chǎn)生。AlphaLISA技術(shù)憑借一種專有的基于微珠的技術(shù)，將傳統(tǒng)的ELISA轉(zhuǎn) 化為均相的“無(wú)需洗滌”的檢測(cè)。[0005]AlphaLISA技術(shù)所使用的稀土元素銪(Eu)，發(fā)射波長(zhǎng)非常尖銳，為615nm，從而大 大減少了檢測(cè)樣品中雜質(zhì)的干擾，可直接檢測(cè)復(fù)雜樣品(血清和體液)中的生物分子。在臨 床上，這非常適合測(cè)定人和動(dòng)物的血清和體液樣本。而此技術(shù)的高通量、高靈敏度、操作簡(jiǎn) 便，能更準(zhǔn)確、更省時(shí)的測(cè)定細(xì)胞因子等生物標(biāo)志物。目前，已廣泛用于藥物篩選、細(xì)胞因 子、病變基因、血清抗體等的檢測(cè)。[0006]中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)(申請(qǐng)?zhí)枮?201210031802.X，201210047016.9)分別公開了采 用AlphaLISA技術(shù)檢測(cè)腸道病毒71型衣殼蛋白(Ant1-EV71 VPl IgM)和甲型肝炎病IgM 的方法。但是，目前尚無(wú)利用AlphaLISA技術(shù)檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型抗體的試劑盒及檢測(cè)方 法的報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明的第一目的是提供一種豬圓環(huán)病毒2型病毒抗體競(jìng)爭(zhēng)AlphaLISA檢測(cè)試劑盒，及編碼試劑盒中抗原的基因，以及擴(kuò)增該基因所使用的引物；本發(fā)明的第二目的是提供一種用于食品安全檢測(cè)的豬圓環(huán)病毒2型病毒抗體競(jìng)爭(zhēng)AlphaLISA檢測(cè)方法。[0008]為實(shí)現(xiàn)第一目的本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:豬圓環(huán)病毒2型病毒抗體競(jìng)爭(zhēng) AlphaLISA檢測(cè)試劑盒包括供體微珠、受體微珠、豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白單克隆抗體及帶 His標(biāo)簽的Cap蛋白抗原。[0009]其中，所述供體微珠為螯合鎳的供體微珠，PE, ASlOlD (即Nickel chelate Donor beads (PE, AS101D));所述受體微珠為抗鼠 IgG 受體微珠，PE, AL105C (即 Ant1-mouse IgG Acceptor beads (PE, AL105C));所述豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有與豬圓環(huán)病毒2型 Cap蛋白抗原同等功能的氨基酸序列。[0010]進(jìn)一步，上述試劑盒包括供體微珠80 μ g/mL、受體微珠80 μ g/mL、豬圓環(huán)病毒2型 Cap蛋白單克隆抗體180nM/L及帶His標(biāo)簽的Cap蛋白抗原100nM/L。使用時(shí)，以總體系 20 μ L計(jì)，每孔添加量為:80μ g/mL受體微珠3μ L、80y g/mL供體微珠5μ L、180nM/L帶His 標(biāo)簽的Cap蛋白抗原5yL、100nM/L豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白單克隆抗體5 μ L及待測(cè)樣本 2 μ L0[0011]具體地，編碼所述豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白抗原的基因?yàn)镻CV Cap基因，其核苷酸序列為SEQ ID N0.2。PCV Cap基因是通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得的，進(jìn)行PCR擴(kuò)增所用的上游引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.3，下游引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.4。[0012]為實(shí)現(xiàn)第二目的本發(fā)明的豬圓環(huán)病毒2型病毒抗體競(jìng)爭(zhēng)AlphaLISA檢測(cè)方法，包括如下步驟:I)反應(yīng)板的待測(cè)孔中每孔加入2μ L待測(cè)樣本，對(duì)照孔加入2μ L IX稀釋緩沖液。[0013]2)每孔加入5μ L 180nM/L帶His標(biāo)簽的Cap蛋白抗原和5yL 100nM/L豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白單克隆抗體，1000rpm離心10 sec,室溫23°C避光孵育lh。[0014]3)每孔加入80 μ g/mL受體微珠3μL、80μg/mL供體微珠5μL, 1000rpm離心10sec，室溫23°C避光孵育30 min。[0015]4)結(jié)果讀取:將反應(yīng)板置Enspire (PE) AlphaLISA檢測(cè)系統(tǒng)中讀值。[0016]采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點(diǎn)及有益效果:利用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行豬圓環(huán)病毒2型抗體的檢測(cè)，特異性好，靈敏度高，血清用量少，不需洗漆，不受溶血影響。[0017]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是(I)、操作簡(jiǎn)單，不需要洗滌；(2)、高特異性:抗原與抗體的特異性結(jié)合,均相的反應(yīng),所需樣本體積小,僅需2 --L ;(3)、檢測(cè)時(shí)間短:檢測(cè)時(shí)間比傳統(tǒng)的 ELISA時(shí)間短，僅需1.5 h即可完成檢測(cè)；(4)、靈敏度高:最低檢測(cè)極限比普通ELISA高 5~10倍；樣本檢測(cè)的檢出率達(dá)到96.3% ; (5)、背景低，抗淬滅能力強(qiáng):采用長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)，短波長(zhǎng)發(fā)射，不會(huì)有來(lái)自熒光的背景；且利用時(shí)間分辨熒光的檢測(cè)模式，進(jìn)一步降低了背景， 確保結(jié)果的真實(shí)性，615nm的發(fā)射波長(zhǎng)，非常尖銳，基本沒(méi)有來(lái)自樣品的淬滅干擾，是進(jìn)行血清、血漿、體液等復(fù)雜樣品檢測(cè)的理想選擇；(6)、用途:可用于血清及其相關(guān)樣本中豬圓環(huán)病毒2型抗體的快速檢測(cè)。【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0018]圖1為PCV Cap全長(zhǎng)的核酸擴(kuò)增電泳圖；圖中第I泳道為PCV Cap基因擴(kuò)增產(chǎn)物， 第2泳道為陰性對(duì)照，第M泳道為DL 2000 DNA marker ；圖2為重組表達(dá)質(zhì)粒pET-PCV-Cap經(jīng)Xho 1、Kpn I雙酶切后電泳圖；圖中第I泳道為 ET-PCV-Cap酶切后，第2泳道為空載體，第3泳道為ET-PCV-Cap酶切前，第M泳道為15000 DL marker ；圖3為PCV Cap蛋白的SDS-PAGE凝膠電泳分析結(jié)果；第M泳道為預(yù)染蛋白分子量標(biāo) 準(zhǔn)，從上至下分子量依次為97.2KD、66.4KD、44.3 KD,29.0KD、20.1KDU4.3KD ;第I泳道為 未誘導(dǎo)的對(duì)照；第2和3泳道為PCV Cap全長(zhǎng)1_702，分子量大小約為42KD，與預(yù)期結(jié)果一 致；圖4為His-標(biāo)簽PCV Cap全長(zhǎng)蛋白的Western blot鑒定結(jié)果；第1、2泳道為PCV Cap 全長(zhǎng)1-702,分子量大小約為42 KD ;第M泳道為Western blot蛋白分子標(biāo)準(zhǔn),從上至下分 子量依次為 170KD、95KD、72 KD,55 KD、43KD、34KD、26KD、17KD、10KD?！揪唧w實(shí)施方式】[0019]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例 中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。[0020]以下實(shí)施中使用的豬圓環(huán)病毒2型(HVRIPCV0002株)購(gòu)自中國(guó)CVCC，由重慶出入 境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心保存。實(shí)施例[0021]一、PCV Cap重組蛋白原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 1、目的片段擴(kuò)增1.1、PCR 擴(kuò)增以毒株P(guān)CV2 (以參考序列GenBank N0.:NC_005148.1設(shè)計(jì)引物)的基因組為模板，進(jìn) 行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增所需目的片段PCV Cap基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所 示，編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。[0022]上下游引物分別引入Kpn I和Xho I酶切位點(diǎn)，引物設(shè)計(jì)采用Primer Preier5( — 種引物設(shè)計(jì)軟件)，引物由寶生物(大連)公司合成，引物序列見表I。[0023]表I引物序列""ianinIEfflPCV Cap 上游引物:5，- cgcggtaccgacgacgacgacaagatgacttaccctcgtcgtcgttatc-3.-下游弓 |物:57-cgcctcgagttacgcagacggagacgcagtaac-3"PCR反應(yīng)體系如表2所示(總體積25 μ L)
【權(quán)利要求】
1.豬圓環(huán)病毒2型病毒抗體競(jìng)爭(zhēng)AlphaLISA檢測(cè)試劑盒，其特征在于:包括供體微 珠、受體微珠、豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白單克隆抗體及帶His標(biāo)簽的Cap蛋白抗原；其中，所述供體微珠為螯合鎳的供體微珠，PEjASIOID ;所述受體微珠為抗鼠IgG受體 微珠，PE, AL105C ；所述豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白抗原的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或該序列經(jīng)替 換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有與豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白抗原同等功能的 氨基酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述豬圓環(huán)病毒2型病毒抗體競(jìng)爭(zhēng)AlphaLISA檢測(cè)試劑盒，其特征 在于:所述供體微珠80 μ g/mL、受體微珠80 μ g/mL、豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白單克隆抗體 100nM/L及帶His標(biāo)簽的Cap蛋白抗原180nM/L ；使用時(shí)，以總體系20 μ L計(jì)，每孔添加量為:80 μ g/mL供體微珠5 μ L、80 μ g/mL受體微 珠3 μ L、180nM/L帶His標(biāo)簽的Cap蛋白抗原5 μ L、100nM/L豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白單克 隆抗體5yL及待測(cè)樣本2yL。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述豬圓環(huán)病毒2型病毒抗體競(jìng)爭(zhēng)AlphaLISA檢測(cè)試劑盒，其特征 在于:編碼所述豬圓環(huán)病毒2型Cap蛋白抗原的基因?yàn)镻CV Cap基因，其核苷酸序列為SEQ ID N0.2。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述豬圓環(huán)病毒2型病毒抗體競(jìng)爭(zhēng)AlphaLISA檢測(cè)試劑盒，其特征 在于:所述PCV Cap基因是通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得的，進(jìn)行PCR擴(kuò)增所用的上游引物的核苷酸序 列為SEQ ID N0.3，下游引物的核苷酸序列為SEQ ID N0.4。
5.利用權(quán)利要求1所述試劑盒進(jìn)行豬圓環(huán)病毒2型病毒抗體競(jìng)爭(zhēng)AlphaLISA檢測(cè)的 非疾病診斷目的的檢測(cè)方法，包括如下步驟:1)反應(yīng)板的待測(cè)孔中每孔加入2μL待測(cè)樣本，對(duì)照孔加入2μ L IX稀釋緩沖液；2)每孔加入5μ L 180nM/L帶His標(biāo)簽的Cap蛋白抗原和5 μ L 100nM/L豬圓環(huán)病毒2 型Cap蛋白單克隆抗體，IOOOrpm離心10 sec,室溫23°C避光孵育Ih ；3)每孔加入80μ g/mL受體微珠3 μ L、80 μ g/mL供體微珠5 μ L, IOOOrpm離心10 sec，室溫23°C避光孵育30 min ；4)結(jié)果讀取:將反應(yīng)板置Enspire(PE) AlphaLISA檢測(cè)系統(tǒng)中讀值。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK103499689SQ201310474037
【公開日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月11日
【發(fā)明者】聶福平, 王昱, 楊俊 , 李應(yīng)國(guó), 向海洋, 王國(guó)民, 肖進(jìn)文 申請(qǐng)人:重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心