信號放大型免疫熒光探針及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種信號放大型免疫熒光探針及其制備方法和應(yīng)用。該探針的制備方法包括：在縮合劑的存在下，對苯二胺和均苯三甲酸經(jīng)縮合反應(yīng)得到多羧基大分子；多羧基大分子經(jīng)活化后，依次加入抗體、聚賴氨酸進(jìn)行反應(yīng)；再用熒光標(biāo)記物標(biāo)記，制得所述的探針?；蛘?，其制備方法包括：將抗體、聚賴氨酸分別加入生物素溶液中反應(yīng)生成相應(yīng)的復(fù)合物，再用熒光標(biāo)記物標(biāo)記；將熒光標(biāo)記的抗體-生物素復(fù)合物與鏈霉親和素溶液混合進(jìn)行反應(yīng)，再加入熒光標(biāo)記的聚賴氨酸-生物素復(fù)合物繼續(xù)反應(yīng)，制得所述的探針。通過上述方法制得的探針，標(biāo)記有較多熒光標(biāo)記物，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，易保藏；用于熒光免疫檢測，具有檢測靈敏度高、檢測時間短、成本低等特點。
【專利說明】 信號放大型免疫熒光探針及其制備方法和應(yīng)用
[0001]本申請是申請?zhí)枮椤?01110456124.7”，申請日為“2011年12月30日”，發(fā)明名稱
為“信號放大型免疫熒光探針及其制備方法和應(yīng)用”發(fā)明專利申請的分案申請
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及免疫快速分析【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種信號放大型免疫熒光探針及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003]免疫檢測技術(shù)是目前醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、食品安全等領(lǐng)域最基本也是最常用的檢測技術(shù)之一。它廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)臨床、環(huán)境檢測，以及食品和微生物污染的檢測中。免疫檢測技術(shù)是基于抗體抗原反應(yīng)的原理對待測物進(jìn)行定量定性分析的檢測方法，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡便等優(yōu)點，是現(xiàn)代生命科學(xué)的重要研究手段，在生物分析檢測領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。
[0004]熒光免疫測定是指將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)(熒光標(biāo)記物對抗體或者抗原進(jìn)行標(biāo)記)結(jié)合起來，并通過熒光信號進(jìn)行檢測的方法。最終目的是通過將抗體與抗原的特異性反應(yīng)和熒光信號相結(jié)合，達(dá)到定量檢測的目的。
[0005]斑點熒光免疫滲透試驗，在斑點金免疫滲透試驗的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，后發(fā)展為斑點熒光免疫滲透試驗，而斑點熒光免疫滲透試驗則是用熒光性物質(zhì)代替了膠體金作為標(biāo)記物，采用免疫滲透技術(shù)、熒光標(biāo)記物和固相載體相結(jié)合的一種檢測方法。
[0006]熒光免疫層析是在膠體金免疫層析的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，是以NC膜為載體，利用微孔膜的毛細(xì)管作用，使滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，如同層析一般。
[0007]目前，F(xiàn)ITC、羅丹明、量子點、熒光微球等熒光標(biāo)記物已經(jīng)廣泛應(yīng)用于熒光免疫分析技術(shù)中。熒光免疫檢測方法具有高特異性、敏感性高、速度快的特點。但是該檢測方法在應(yīng)對非常微量的物質(zhì)時，也存在信號低，噪聲干擾大，傳統(tǒng)方法難以檢出等問題。因此，發(fā)展新的免疫檢測方法，提高檢測的靈敏度是目前分析檢測領(lǐng)域發(fā)展的迫切要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明提供了信號放大型免疫熒光探針的制備方法，將熒光標(biāo)記物標(biāo)記在連接有多羧基大分子和聚賴氨酸或者連接有生物素-鏈霉親和素和聚賴氨酸的抗體復(fù)合物上，使免疫反應(yīng)的熒光信號大大放大，提高了熒光免疫檢測的靈敏度。
[0009]—種信號放大型免疫突光探針的制備方法，包括:
[0010](I)在縮合劑的存在下，將對苯二胺和均苯三甲酸加入有機(jī)溶劑中，于80-100°C縮合反應(yīng)3-5h，得到多羧基大分子；
[0011](2)將步驟(I)得到的多羧基大分子加入含有1-乙基-3-(3- 二甲氨丙基)碳二亞胺和N-羥基琥珀酰亞胺的溶液中進(jìn)行活化，然后加入抗體，反應(yīng)0.5-2h ;再加入聚賴氨酸，繼續(xù)反應(yīng)0.5-2h，得到表面連接有抗體和聚賴氨酸的多羧基大分子；[0012](3)用熒光標(biāo)記物對步驟(2)制得的表面連接有抗體和聚賴氨酸的多羧基大分子進(jìn)行標(biāo)記，制得信號放大型免疫熒光探針。
[0013]步驟(I)中，所述的縮合劑可以為三苯基亞磷酸鹽(TPP)與吡啶(Py)的混合物；所述的有機(jī)溶劑可以為N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)。
[0014]所述對苯二胺與均苯三甲酸的摩爾比優(yōu)選為1:0.8-1:1.2 ;更優(yōu)選為1:1。對苯二胺和均苯三甲酸作為反應(yīng)單體，在縮合劑的存在下能縮合得到多羧基大分子。
[0015]優(yōu)選地，每80-100ml N-甲基_2_吡咯烷酮中，所述對苯二胺的加入量為lOmmol，均苯三甲酸的加入量為lOmmol，三苯基亞磷酸鹽的加入量為20-30mmol，吡啶的加入量為5_15ml ο
[0016]所述的縮合反應(yīng)過程中對溶液進(jìn)行攪拌，確?；旌衔锘ト艹删?。
[0017]所述的縮合反應(yīng)完成后，對反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行后處理得到多羧基大分子；所述的后處理可以為:將縮合反應(yīng)3-5h后的反應(yīng)產(chǎn)物加入含有鹽酸的甲醇溶液中終止反應(yīng)，分離得到縮合物沉淀，再對縮合物沉淀依次進(jìn)行重結(jié)晶、洗滌和干燥處理。
[0018]其中，所述含有鹽酸的甲醇溶液中鹽酸的濃度為10_15mol/L ;所述重結(jié)晶所用的試劑為N-甲基-2-吡咯烷酮/甲醇混合液；所述洗滌所用的試劑為熱的甲醇；所述的干燥處理為:將縮合物沉淀置于80-120°C烘箱中干燥10-15h。
[0019]步驟(2)中，所述含有1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺(EDAC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)的溶液的溶劑可以為磷酸鹽緩沖液(PBS)和二甲基亞砜(DMSO)的混合液。
[0020]所述的抗體可以為單抗或多抗。
[0021]所述步驟(I)得到的多羧基大分子、抗體和聚賴氨酸的摩爾比優(yōu)選為1:2:20-1:3:50。
[0022]所述的活化時間優(yōu)選為10_15min。
[0023]步驟(3)中，所述的熒光標(biāo)記物可以為FITC、羅丹明、量子點或熒光微球。
[0024]本發(fā)明還提供了另一種信號放大型免疫熒光探針的制備方法，包括:
[0025](I)將抗體加入生物素溶液中，攪拌反應(yīng)l_2h，然后加入熒光標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，制得熒光標(biāo)記的抗體-生物素復(fù)合物；
[0026](2)將聚賴氨酸加入生物素溶液中，攪拌反應(yīng)l_2h，然后加入熒光標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，制得熒光標(biāo)記的聚賴氨酸-生物素復(fù)合物；
[0027](3)將步驟(I)制得的熒光標(biāo)記的抗體-生物素復(fù)合物與鏈霉親和素溶液混合，反應(yīng)0.5-lh ;然后加入步驟(2)制得的熒光標(biāo)記的聚賴氨酸-生物素復(fù)合物，繼續(xù)反應(yīng)
0.5-lh，制得信號放大型免疫熒光探針。
[0028]步驟(I)中，所述抗體與生物素的摩爾比優(yōu)選為1:2-1:4。
[0029]所述抗體加入生物素溶液中反應(yīng)l_2h后，可以進(jìn)行透析除雜，所述透析除雜為:將反應(yīng)液裝于透析袋中，置于濃度10mmol/L，pH7.4的磷酸鹽緩沖液中透析48h。
[0030]步驟(2)中，所述聚賴氨酸與生物素的摩爾比優(yōu)選為1:1-1:2。
[0031]所述聚賴氨酸加入生物素溶液中反應(yīng)l_2h后，可以進(jìn)行透析除雜，透析除雜步驟同上。
[0032]步驟(3)中，所述熒光標(biāo)記的抗體-生物素復(fù)合物、鏈霉親和素與熒光標(biāo)記的聚賴氨酸-生物素復(fù)合物的摩爾比優(yōu)選為1:3:10-1:5:15。[0033]本發(fā)明還提供了采用上述兩種制備方法制得的信號放大型免疫熒光探針，該信號放大型免疫熒光探針標(biāo)記有較多的熒光標(biāo)記物，且分子間結(jié)合力強(qiáng)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在4°C無菌環(huán)境下可以穩(wěn)定保存一年以上。
[0034]本發(fā)明還提供了所述的信號放大型免疫熒光探針在熒光免疫檢測中的應(yīng)用。試驗表明，本發(fā)明的信號放大型免疫熒光探針可以用于基于抗體抗原特異性反應(yīng)的熒光免疫檢測，尤其適用于斑點熒光免疫滲透試驗或熒光免疫層析試驗，檢測靈敏度較高，比傳統(tǒng)的熒光標(biāo)記方法要敏感數(shù)倍甚至十幾倍。
[0035]本發(fā)明將熒光標(biāo)記物標(biāo)記在連接有多羧基大分子和聚賴氨酸或者連接有生物素-鏈霉親和素和聚賴氨酸的抗體復(fù)合物上，使免疫反應(yīng)的熒光信號大大放大，提高了熒光免疫檢測的靈敏度。
[0036]以多羧基大分子和聚賴氨酸用于免疫熒光探針的信號放大時:對苯二胺和均苯三甲酸可以縮合形成表面帶有大量羧基的多羧基大分子，在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)順序和加量比例下，多羧基大分子能連接抗體和聚賴氨酸，聚賴氨酸的大量氨基基團(tuán)可用于連接更多的熒光分子，從而形成一個以多羧基大分子為基礎(chǔ)，表面連接有一定抗體、大量聚賴氨酸和大量突光分子的復(fù)合物，與抗體、熒光分子直接連接相比，熒光信號大大放大。
[0037]以生物素-鏈霉親和素和聚賴氨酸用于免疫熒光探針的信號放大時:由于生物素和鏈霉未和素具有良好的配對關(guān)系，在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)順序和加量比例下，可以與抗體和聚賴氨酸相連接形成一個以抗體為起點，鏈霉親和素、生物素和聚賴氨酸相互頭尾相連的復(fù)合物，使免疫熒光信號放大倍數(shù)大大提高。
[0038]采用本發(fā)明，具有如下有益效果:
[0039](I)定量檢測、靈敏度高:膠體金免疫層析也具有操作方便、快捷的優(yōu)點，但其更適用于定性檢測；而ELISA則適用于大量標(biāo)本數(shù)目的檢測，所需的實驗設(shè)備要求高；而熒光免疫層析不僅具有定量檢測功能，而且具有所需設(shè)備簡單、操作方便等優(yōu)點；而經(jīng)過信號放大的熒光免疫層析的定量檢測，其檢測靈敏度更高，可用于極微量物質(zhì)的檢測。
[0040](2)檢測時間短，成本低:由于信號放大的熒光免疫檢測靈敏度更高，可直接應(yīng)用于熒光免疫層析和斑點熒光免疫滲透試驗，相較于ELISA檢測，大大縮短了檢測時間，一般一個標(biāo)本的檢測時間為10-15min，可以在I小時內(nèi)檢測50-60個標(biāo)本；特別適合少量標(biāo)本數(shù)的定量檢測，相對于ELISA檢測，成本更低。
[0041](3)探針結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，易保藏:本發(fā)明的信號放大型免疫熒光探針分子間結(jié)合力強(qiáng)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，在4°C無菌環(huán)境下可以穩(wěn)定保存一年以上。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0042]圖1為本發(fā)明實施例1信號放大型免疫熒光探針制備過程的示意圖，其中，I為多羧基大分子，2為抗體，3為聚賴氨酸，4為熒光標(biāo)記物；NMP為N-甲基-2-吡咯烷酮，TPP為三苯基亞磷酸鹽，Py為吡啶，DMSO為二甲基亞砜，PBS為磷酸鹽緩沖液，EDAC為1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亞胺；
[0043]圖2為本發(fā)明實施例4信號放大型免疫熒光探針制備過程的示意圖，其中，5為抗體，6為生物素,7為熒光標(biāo)記物,8為鏈霉親和素,9為聚賴氨酸?！揪唧w實施方式】
[0044]實施例1信號放大型免疫熒光探針的制備
[0045](I)在三頸瓶中，將單體1.08g (IOmmol)對苯二胺和2.1Og(IOmmol)均苯三甲酸在攪拌下溶于80ml N-甲基-2-吡咯烷酮中，再加入縮合劑7.5ml吡啶和20mmol三苯基亞磷酸鹽，不斷攪拌加熱至80°C，混合物互溶成均相后，繼續(xù)攪拌反應(yīng)3h ;停止反應(yīng)后，將反應(yīng)混合物溶于500ml含有鹽酸的甲醇中(鹽酸濃度為12mol/L)，過濾得到沉淀產(chǎn)物；粗產(chǎn)品用N-甲基-2-吡咯烷酮/甲醇進(jìn)行重結(jié)晶，最后產(chǎn)物用熱的甲醇進(jìn)行洗滌，并在100°C烘箱中烘干12h ;獲得多羧基大分子，命名為PT大分子。
[0046](2)將步驟(I)中 PT 大分子 5mg 溶于 IOml PBS(IOmM pH7_8)和 Iml DMSO 的溶液中；取30ul PT大分子溶液，向其中加入5ul EDAC (10mg/ml)和3ul NHS (5mg/ml)，室溫活化IOmin后，分別先后加入3ug抗體和5ug聚賴氨酸，室溫各反應(yīng)lh。將上述反應(yīng)溶液上凝膠色譜柱Superdex分離多余的EDAC、NHS和未連接的抗體、聚賴氨酸,并用0.22 μ m濾孔膜除菌，4 °C保存。
[0047](3)將上述純化后的溶液IOOul中加入10%的NaHCO3,調(diào)節(jié)pH值至約為8_9，并加入5ul熒光標(biāo)記物，室溫反應(yīng)lh，并每隔10-15min，混勻一次。再將以上混合物用純化樹脂(Thermo Scientific Zeba)除去多余的突光標(biāo)記物，IlOOg離心5min,收集離心后的溶液，獲得抗體-多羧基大分子-聚賴氨酸-熒光標(biāo)記復(fù)合物，即為信號放大型免疫熒光探針。
[0048]實施例2斑點熒光免疫滲透試驗檢測盒的制備
[0049](I)將10ug/ml濃度的抗體包被在硝酸纖維素膜(NC膜)上，并用IOmM PBS(pH7_8)清洗3-5遍，37 °C烘干備用。
[0050](2)將塑料小盒打開，分為底和蓋。安裝次序從下到上依次為:底、吸水材料、硝酸
纖維素膜、蓋。
[0051]實施例3斑點熒光免疫滲透試驗檢測AFP (夾心法)
[0052](I)先用將AFP標(biāo)準(zhǔn)品分別配置成濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)品Oppb，lppb，5ppb，20ppb，50ppb,IOOppb,200ppb,400ppbo
[0053](2)取實施例2制得的檢測盒，將40ul封閉液(IOmM PBS, pH7_8，含0.2%BSA和
0.05%Tween-20)滴在檢測盒的NC膜上，封閉NC膜，待其滲入盒內(nèi)。
[0054](3)在NC膜上滴加IOul標(biāo)準(zhǔn)濃度的AFP溶液，并滴加30ul洗滌液(50mM PBS,PH7-8);待溶液略干后，再滴加IOul稀釋1000倍的實施例1制得的信號放大型免疫熒光探針溶液(稀釋液為含1%BSA和1%蔗糖的IOmM PBS溶液，pH7.2)，并滴加30ul洗滌液；待溶液略干后，利用熒光定量分析儀進(jìn)行檢測，讀取熒光信號(每個樣品分別檢測3次，取平均值);以AFP濃度為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。該熒光免疫試紙條的AFP最低檢測線為2ppb。
[0055](4)在NC膜上滴加IOul待測AFP溶液，并滴加30ul洗滌液；待溶液略干后，再滴加IOul稀釋1000倍的實施例1制得的信號放大型免疫熒光探針溶液(稀釋液為含1%BSA和1%蔗糖的IOmM PBS溶液，pH7.2)，并滴加30ul洗滌液；待溶液略干后，利用熒光定量分析儀進(jìn)行檢測，讀取熒光信號；將熒光信號值代入步驟(3)制得的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出待測標(biāo)本的AFP濃度。
[0056](5)重復(fù)性實驗:將3份陽性標(biāo)本在同一時間段測定20次，計算批內(nèi)變異系數(shù):將同樣的3份陽性標(biāo)本連續(xù)測定10次，每天一次，計算批間變異系數(shù)。由結(jié)果知，批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均小于10%，表明該信號放大型免疫熒光探針用于斑點熒光免疫滲透試驗，重復(fù)性較好。
[0057](6)穩(wěn)定性實驗:1)將試劑(實施例1制得的信號放大型免疫熒光探針)于37°C溫箱放置12天，與放置在4°C冰箱的試劑平行檢測3份陽性和1份陰性標(biāo)本，進(jìn)行熱穩(wěn)定性試驗。結(jié)果顯示，該試劑至少可以穩(wěn)定存放I年以上。2)將檢測盒中的試紙條密封分別存放于37°C、25°C和4°C，觀察不同溫度對試紙條的影響。保存于37°C的試紙條每個月取出70條分別檢測標(biāo)準(zhǔn)品；保存于25°C的試紙條每一個月取出70條分別檢測標(biāo)準(zhǔn)品。結(jié)果顯示，試紙條分別在25°C下保存12個月以及37°C保存6個月，檢測結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)改變。
[0058]實施例4信號放大型免疫突光探針的制備
[0059](I)將20mmol活化的生物素分別與IOmmol抗體和IOmmol聚賴氨酸進(jìn)行反應(yīng),室溫攪拌Ih ;然后裝于透析袋中置于PBS緩沖溶液(IOmM, pH7.4)中透析48h，制得生物素-抗體、生物素-聚賴氨復(fù)合物；再用0.22 μ m濾孔膜除菌，4°C保存。
[0060](2)取20ul生物素-抗體和生物素-聚賴氨酸溶液(蛋白濃度≥1mg/ml)，分別用10%的NaHCO3,調(diào)節(jié)pH值至約為8_9，加入熒光標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，并輕柔攪拌均勻。室溫反應(yīng)Ih,并每隔10-15min,混勻一次。反應(yīng)結(jié)束后,用純化樹脂(Thermo Scientific Zeba)除去未反應(yīng)的熒光標(biāo)記物，IlOOg離心5min，收集離心后的溶液，獲得熒光標(biāo)記的生物素_抗體、生物素-聚賴氨復(fù)合物。
[0061](3)將步驟(2)制得的熒光標(biāo)記生物素-抗體復(fù)合物與鏈霉親和素溶液混合，室溫下反應(yīng)Ih ;再加入步驟(2)制得的熒光標(biāo)記生物素-聚賴氨復(fù)合物，室溫下繼續(xù)反應(yīng)lh，其中，熒光標(biāo)記生物素-抗體復(fù)合物、鏈霉親和素、熒光標(biāo)記生物素-聚賴氨復(fù)合物的摩爾比為1:5:5 ;反應(yīng)結(jié)束后獲得抗體-生物素-鏈霉親和素-聚賴氨酸-熒光標(biāo)記復(fù)合物，即為信號放大型免疫熒光探針。
[0062]實施例5熒光免疫層析試紙條的制備
[0063](I)樣品墊制備:將樣品墊裁成1.5X30cm,將其放入處理液(3%BSA+l%TritonX-100 )中，浸泡30min后，37°C烘干3h備用。
[0064](2)結(jié)合墊制備:將結(jié)合墊裁成1.0X30cm，將實施例4制得的信號放大型免疫熒光探針用稀釋液(含1%BSA和1%蔗糖的PBS，IOmM, pH7_8)稀釋3000倍后，噴于結(jié)合墊上，37°C 烘干 30min。
[0065](3)NC膜制備:將NC膜裁成2.5 X 30cm，用點樣儀在NC膜不同位置上按照lul/cm的量噴上羊抗鼠IgG和抗原，分別作為質(zhì)控線和檢測限，37°C烘干30min。
[0066](4)熒光免疫試紙條組裝:將樣品墊、結(jié)合墊、NC膜和吸水墊分別粘在底板上，并裁成4cm寬的試紙條。
[0067]實施例6熒光免疫層析試紙條檢測瘦肉精(競爭法)
[0068](I)將瘦肉精標(biāo)準(zhǔn)品配制成不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)品0ppb，0.lppb, 0.3ppb, 0.9ppb，
2.7ppb，8.lppb。
[0069](2)將上述系列標(biāo)準(zhǔn)品各取80ul，加入到含有實施例4制得的信號放大型免疫熒光探針的試管中，混勻后 2min，取70ul上樣，層析持續(xù)8min，用熒光檢測儀讀取數(shù)據(jù)。利用熒光定量分析儀分別檢測T線和C線的熒光強(qiáng)度(每個樣品分別檢測3次，取平均值)，制作抗原濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線；該熒光免疫試紙條的克倫特羅最低檢測線為0.05ppb。
[0070](3)待測抗原用實施例5制得的試紙條進(jìn)行檢測，利用T/C的比值代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線求得待測抗原濃度。
[0071](4)重復(fù)性實驗:將3份陽性標(biāo)本在同一時間段測定20次，計算批內(nèi)變異系數(shù):將同樣的3份陽性標(biāo)本連續(xù)測定10次，每天一次，計算批間變異系數(shù)。由結(jié)果知，批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)均小于10%，表明該信號放大型免疫熒光探針用于熒光免疫層析，重復(fù)性較好。
[0072](5)穩(wěn)定性實驗:1)將試劑(實施例4制得的信號放大型免疫熒光探針)于37°C溫箱放置12天，與放置在4°C冰箱的試劑平行檢測3份陽性和I份陰性標(biāo)本，進(jìn)行熱穩(wěn)定性試驗。結(jié)果顯示，該試劑至少可以穩(wěn)定存放18個月以上。2)將試紙條密封分別存放于37°C、25°C和4°C，觀察不同溫度對試紙條的影響。保存于37°C和25°C的試紙條每個月取出70條分別檢測標(biāo)準(zhǔn)品 Oppb, 0.05ppb，0.lppb, 0.3ppb,0.9ppb, 2.7ppb,8.lppb。結(jié)果顯示,試紙條分別在25°C下保存12個月以及37°C保存6個月，檢測結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)改變。
【權(quán)利要求】
1.一種信號放大型免疫熒光探針的制備方法，包括: (1)將抗體加入生物素溶液中，攪拌反應(yīng)l-2h,然后加入熒光標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記,制得熒光標(biāo)記的抗體-生物素復(fù)合物； (2)將聚賴氨酸加入生物素溶液中，攪拌反應(yīng)l_2h，然后加入熒光標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記，制得熒光標(biāo)記的聚賴氨酸-生物素復(fù)合物； (3)將步驟(I)制得的熒光標(biāo)記的抗體-生物素復(fù)合物與鏈霉親和素溶液混合，反應(yīng)0.5-lh ;然后加入步驟(2)制得的熒光標(biāo)記的聚賴氨酸-生物素復(fù)合物，繼續(xù)反應(yīng)0.5-lh，制得信號放大型免疫熒光探針。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(I)中，所述抗體與生物素的摩爾比為1:2-1:4。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述聚賴氨酸與生物素的摩爾比為1:1-1:2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述熒光標(biāo)記的抗體-生物素復(fù)合物、鏈霉親和素與熒光標(biāo)記的聚賴氨酸-生物素復(fù)合物的摩爾比為1:3:10-1:5:15。
5.一種米用如權(quán)利要求1-4任一所述的制備方法制得的信號放大型免疫突光探針。
6.如權(quán)利要求5所述的信號放大型免疫熒光探針在熒光免疫檢測中的應(yīng)用。
【文檔編號】G01N21/64GK103513026SQ201310470907
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2011年12月30日
【發(fā)明者】吳堅, 陳春香 申請人:吳堅