一種從城市富營(yíng)養(yǎng)化藍(lán)藻水華水體中提取藍(lán)藻毒素的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種從水體中提取藍(lán)藻毒素的方法。該方法包括如下步驟：1）向待提取水體中加入甲醇和冰醋酸，使甲醇的終體積含量為40%，使冰醋酸的終體積含量為3-5%，300赫茲連續(xù)超聲15-20min；2）將步驟1）超聲處理后的水樣調(diào)節(jié)pH為3，用0.45μm濾膜過(guò)濾，濾液于6500g離心5-10min，取上清；3）將步驟2）所得上清過(guò)固相萃取柱，用體積含量為40%的甲醇水溶液淋洗，再用體積含量為95%的甲醇水溶液洗脫，得到含有藍(lán)藻毒素的洗脫液；4）從步驟3）洗脫液中獲得藍(lán)藻毒素。本發(fā)明采用固相萃取技術(shù)，連續(xù)富集、純化、提取城市湖泊水體中的兩種藍(lán)藻毒素主要異構(gòu)體MC-LR和MC-RR，具有所得產(chǎn)品純度高，易于操作，成本低廉等特點(diǎn)。
【專利說(shuō)明】一種從城市富營(yíng)養(yǎng)化藍(lán)藻水華水體中提取藍(lán)藻毒素的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域，涉及一種從水體中提取藍(lán)藻毒素的方法，特別涉及一種從城市富營(yíng)養(yǎng)化藍(lán)藻水華水體中提取兩種主要藍(lán)藻毒素類型RR和LR的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]我國(guó)城市水體包括城市周邊濕地湖泊、公園景觀湖泊、城市河道等。然而最近20年來(lái)，隨著城市化進(jìn)程的快速推進(jìn)，工農(nóng)業(yè)以及生活污水?dāng)y帶著大量的營(yíng)養(yǎng)鹽排入城市湖泊水體中，導(dǎo)致城市水體營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象日益嚴(yán)重。水體的富營(yíng)養(yǎng)化危害最大的一個(gè)表征現(xiàn)象就是藍(lán)藻水華的出現(xiàn)，更嚴(yán)重的后果是藍(lán)藻水華能釋放藍(lán)藻毒素危害人類和其他生物的安全。研究發(fā)現(xiàn)LR型藍(lán)藻毒素(MC-LR)和RR型藍(lán)藻毒素(MC-RR)是毒性最強(qiáng)，分布最廣，最為常見(jiàn)的兩種藻毒素類型。藻毒素不僅可以通過(guò)飲用水威脅動(dòng)植物健康，而且可以在動(dòng)植物體內(nèi)富集，通過(guò)食物鏈的作用威脅人類健康。研究表明藍(lán)藻毒素具有強(qiáng)烈的肝毒性和腫瘤促進(jìn)作用，可打破生命體的磷酸化和脫磷酸化的過(guò)程，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。其危害性越來(lái)越得到世界范圍內(nèi)的關(guān)注。盡管目前有關(guān)藻毒素形成及其生理生化方面的研究報(bào)道越來(lái)越多，但國(guó)際上藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品價(jià)格仍非常昂貴，這也極大的限制了藻毒素相關(guān)研究的發(fā)展。
[0003]我國(guó)富營(yíng)養(yǎng)化城市湖泊眾多，尤其夏秋季藍(lán)藻水華現(xiàn)象頻繁發(fā)生，藻毒素含量較大，這也為藻毒素提取制備提供了天然的物質(zhì)基礎(chǔ)。然而令人遺憾的是目前有關(guān)城市湖泊藻毒素污染并未得到重視，每逢藍(lán)藻發(fā)生，通常打撈到岸邊或用化學(xué)試劑殺滅，這不僅嚴(yán)重污染了土壤和水質(zhì)，也造成藻毒素資源的浪費(fèi)。當(dāng)前傳統(tǒng)的藻毒素提取方法通常為從制備的藻粉中提取。然而藻粉制備一為將打撈上來(lái)的藍(lán)藻在岸邊曝曬陰干，然后將其收集粉碎，這種方法在陰干過(guò)程中使得大量的藻細(xì)胞死亡腐敗，極大的危害了岸邊附近的土壤，而且其腐敗散發(fā)的揮發(fā)性氣體也污染了周圍的空氣，且不利于藻毒素的提取和純化。二為實(shí)驗(yàn)室用冷凍干燥設(shè)備進(jìn)行藻粉制備，雖然這種方法較好的控制了藻粉制備污染問(wèn)題，但其制備量有限，且提取成本較高，不適合大量藻毒素提取。此外，目前藻毒素提取多針對(duì)MC-LR類型，MC-RR類型較少，這也是為何市場(chǎng)上MC-RR類型藻毒素價(jià)格更高的原因之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種從水體中提取藍(lán)藻毒素的方法，特別是從城市藍(lán)藻水華水體中提取主要藍(lán)藻毒素類型LR和RR的方法。
[0005]本發(fā)明所提供的從水體中提取藍(lán)藻毒素的方法，具體可包括如下步驟:
[0006](I)取待提取水體，向其中加入甲醇和冰醋酸，使甲醇的終體積含量為40%，使冰醋酸的終體積含量為3-5%，300赫茲連續(xù)超聲15-20min ；
[0007](2)將步驟(1)超聲處理后的水樣調(diào)節(jié)pH為3，用0.45 4 111濾膜(如6?/(:玻璃纖維濾膜)過(guò)濾，濾液于6500g離心5-10min (如5min或IOmin),取上清；
[0008](3)將步驟(2)所得上清過(guò)固相萃取柱(SPE柱)，使藍(lán)藻毒素富集到柱子上，用體積含量為40%的甲醇水溶液淋洗，再用體積含量為95%的甲醇水溶液洗脫，得到含有藍(lán)藻毒素的洗脫液；
[0009](4)從步驟(3)的洗脫液中獲得藍(lán)藻毒素。
[0010]在上述方法中，若要步驟(4)中獲得的藍(lán)藻毒素最大產(chǎn)量RR型藍(lán)藻毒素(MC-RR)，則所述方法的步驟(I)為:向待提取水體中加入甲醇和冰醋酸，使甲醇的終體積含量為40%，使冰醋酸的終體積含量為3%，300赫茲連續(xù)超聲15min ;若要步驟(4)中獲得最大產(chǎn)量LR藍(lán)藻毒素，則所述方法的步驟(I)為:向待提取水體中加入甲醇和冰醋酸，使甲醇的終體積含量為40%，使冰醋酸的終體積含量為5%，300赫茲連續(xù)超聲20min。
[0011]在上述方法的步驟(I)中，在所述向待提取水體中加入甲醇和冰醋酸之前，還可包括如下步驟:將所述待提取水體過(guò)100目網(wǎng)篩(去除水體中的大部分懸浮物)，將過(guò)篩后水樣用500g離心去沉淀(去除較小顆粒懸浮物)。
[0012]在上述方法的步驟(3)中，所述固相萃取柱可為C18固相萃取柱。在發(fā)明中，所述C18固相萃取柱具體為Cleanert C18-SPE層析柱(天津博納艾杰爾科技有限公司產(chǎn)品)。
[0013]步驟(3)中，在將步驟(2)所得上清過(guò)固相萃取柱之前，需先用I倍柱體積的甲醇和2倍柱體積的水(Mill1-Q水)先后沖洗所述固相萃取柱，使之活化。將步驟(2)所得上清過(guò)所述固相萃取柱時(shí)的流速可為5-10ml.mirT1 (如5ml.mirT1)。
[0014]在上述方法的步驟(4)中，所述從步驟(3)的洗脫液中獲得藍(lán)藻毒素的方法具體可包括如下(a)和(b)的步驟:
[0015](a)將所述洗脫液濃縮，得到藍(lán)藻毒素的濃縮液，溶劑為甲醇；
[0016](b)用高效液相色譜儀串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)步驟(a)所得濃縮液進(jìn)行鑒定與分離，從所述濃縮液中分別得到所述RR型藍(lán)藻毒素和所述LR型藍(lán)藻毒素。
[0017]在上述方法中，進(jìn)行所述步驟(b)時(shí)，采用的高效液相色譜條件具體如下:色譜柱為C18色譜柱，具體如Welch Ultimate XB-C18色譜柱(4.6mmX 150mm,粒徑5 μ m);流動(dòng)相為如下流動(dòng)相A和流動(dòng)相B，采用所述流動(dòng)相A和所述流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫；流動(dòng)相A:甲醇；流動(dòng)相B:體積百分含量為0.1%的甲酸水溶液；所述梯度洗脫為:0?3min，所述流動(dòng)相中所述流動(dòng)相A和所述流動(dòng)相B的體積比從30:70線性變化到75:25 ；4?8min，所述流動(dòng)相中所述流動(dòng)相A和所述流動(dòng)相B的體積比為75:25 ；9?12min，所述流動(dòng)相中所述流動(dòng)相A和所述流動(dòng)相B的體積比從75:25線性變化到30:70 ;采用的質(zhì)譜條件如下:正離子電離方式；噴霧電壓(IS)為5kV ;離子化溫度(TEM)為500°C;源內(nèi)氣體I (GS1，N2)壓力為55kPa，源內(nèi)氣體2 (GS2，N2)壓力為55kPa ;掃描方式為選擇離子模式，選擇質(zhì)荷比為519.8或995.6 (MC-RR的質(zhì)荷比為519.8，MC-LR的質(zhì)荷比為995.6);碰撞氣壓力為Medium級(jí);碰撞電壓為35V或50V (MC-LR碰撞電壓50V，MC-RR碰撞電壓35V)。
[0018]在以上所述的高效液相色譜條件中，流速可為0.8ml/min，上樣體積可為5_10 μ L(如5 μ L)，柱溫可為30。。。
[0019]在上述方法中，所述高效液相色譜儀為Ultimate3000型高效液相色譜儀(Dionex, USA);所述質(zhì)譜儀為3200Q TRAP型串聯(lián)質(zhì)譜儀(Aglient，USA)。
[0020]在上述方法中，所述步驟(b)具體為:采用以上所述的色譜條件和質(zhì)譜條件對(duì)所述濃縮液進(jìn)行鑒定與分離，收集與RR型藍(lán)藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間(5.14min)—致的洗脫峰，從而實(shí)現(xiàn)從所述濃縮液中分離得到所述RR型藍(lán)藻毒素(如將洗脫峰液體減壓蒸干獲得RR型藍(lán)藻毒素干粉);收集與LR型藍(lán)藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間(5.76min)—致的洗脫峰，從而實(shí)現(xiàn)從所述濃縮液中分離得到所述LR型藍(lán)藻毒素(如將洗脫峰液體減壓蒸干獲得LR型藍(lán)藻毒素干粉)。
[0021 ] 所述RR型藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品和所述LR型藍(lán)藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)于sigma公司。
[0022]以上本發(fā)明所提供的從水體中提取藍(lán)藻毒素的方法，適用于城市藍(lán)藻水華水體中提取兩種藍(lán)藻毒素主要類型。
[0023]所述水體為藍(lán)藻水華水體，如城市藍(lán)藻水華水體。
[0024]本發(fā)明針對(duì)目前城市湖泊富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題嚴(yán)重，藍(lán)藻水華引起的藍(lán)藻毒素污染問(wèn)題嚴(yán)重且藻毒素資源未加利用這一情況，根據(jù)藻毒素不同類型，建立從城市富營(yíng)養(yǎng)化藍(lán)藻水華水體中提取藍(lán)藻毒素方法。該方法采用固相萃取技術(shù)，連續(xù)富集、純化、提取城市藍(lán)藻水華水體中的藍(lán)藻毒素兩種藍(lán)藻毒素主要異構(gòu)體MC-LR和MC-RR，具有所得產(chǎn)品純度高，易于操作，成本低廉等特點(diǎn)。并采用液質(zhì)聯(lián)用新方法進(jìn)行藍(lán)藻毒素提取與分離，其具有快速，精確定性等優(yōu)點(diǎn)，且此方法能夠極大的克服目前常用ELISA酶聯(lián)反應(yīng)不能有效區(qū)分藻毒素類型和高效液相色譜無(wú)法鑒別出現(xiàn)的假陽(yáng)性峰，且無(wú)法準(zhǔn)確定量的不足，是目前最新鑒定與分離的檢測(cè)技術(shù)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1為本發(fā)明快速提取城市藍(lán)藻水華水體中藍(lán)藻毒素主要類型MC-RR和MC-LR的流程圖。
[0026]圖2為藍(lán)藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線和液質(zhì)圖譜。其中，A為RR型藍(lán)藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為L(zhǎng)R型藍(lán)藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。C為RR型藍(lán)藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品的液質(zhì)圖譜；D為L(zhǎng)R型藍(lán)藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品的液質(zhì)圖譜。
[0027]圖3為提取的藍(lán)藻毒素的液質(zhì)圖譜。其中，A為提取的RR型藍(lán)藻毒素(MC-RR)液質(zhì)圖譜；B為提取的LR型藍(lán)藻毒素(MC-LR)液質(zhì)圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
[0029]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0030]下述實(shí)施例均按照如下方法從水樣中提取藍(lán)藻毒素:
[0031]Cleanert C18-SPE層析柱:天津博納艾杰爾科技有限公司。
[0032]GF/C玻璃纖維濾膜:北京京騰盛景科技有限公司。
[0033]高效液相色譜儀:Ultimate3000型高效液相色譜儀(Dionex, USA)。
[0034]質(zhì)譜儀:3200QTRAP 型串聯(lián)質(zhì)譜儀(Aglient, USA)。
[0035]RR型藍(lán)藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品和LR型藍(lán)藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品:sigma公司。
[0036]實(shí)施例1、城市藍(lán)藻水華水體藍(lán)藻毒素的提取條件優(yōu)化
[0037]本實(shí)施例中的水樣為取自某公園的藍(lán)藻水華水體。
[0038]一、藍(lán)藻毒素粗提取中提取溶劑優(yōu)化實(shí)驗(yàn)
[0039]1、實(shí)驗(yàn)方法
[0040]按照如下方法進(jìn)行水體藍(lán)藻毒素的提取，期間對(duì)“藍(lán)藻毒素粗提取”步驟中的提取溶劑進(jìn)行優(yōu)化。具體如下:[0041](I)去除雜質(zhì)處理:水樣首先經(jīng)100目網(wǎng)篩去除里面的大部分懸浮物，然后經(jīng)500g離心，去除較小顆粒懸浮物，定容到1L，得到過(guò)濾水樣。
[0042](2)藍(lán)藻毒素的粗提取:向過(guò)濾水樣中加入甲醇和冰醋酸，設(shè)置不同甲醇和冰醋酸混合提取溶劑組，使之提取溶劑終體積分?jǐn)?shù)為(如表I所示):10%?70%甲醇+3%冰醋酸、10%?70%甲醇+5%冰醋酸、10%?70%甲醇+7%冰醋酸(每一實(shí)驗(yàn)組均設(shè)置兩個(gè)平行)。將各平行的混合溶液分別于4°C 300赫茲條件下連續(xù)超聲5min提取藍(lán)藻毒素，超聲處理后的水樣PH調(diào)為7，用GF/C玻璃纖維濾膜(0.45 μ m)過(guò)濾，將濾液于6500g離心5分鐘，以除去溶液中破碎的藍(lán)藻細(xì)胞碎片；
[0043](3)用I倍柱體積的甲醇和2倍柱體積的Mill1-Q水先后沖洗Cleanert C18-SPE層析柱，使之活化；將步驟(2)所得上清過(guò)Cleanert C18-SPE層析柱,流速為5ml.mirT1,進(jìn)行固相萃取(使藍(lán)藻毒素富集到柱子上)；用IOml體積含量為40%的甲醇水溶液淋洗；用20ml體積含量為95%的甲醇水溶液洗脫，得到含有藍(lán)藻毒素的洗脫液；
[0044](4)藍(lán)藻毒素的濃縮與保存:將含有藍(lán)藻毒素的洗脫液進(jìn)行減壓蒸干后用甲醇溶液定容到1ml，得到藍(lán)藻毒素濃縮液，放置_20°C冰箱內(nèi)。
[0045](5) RR/LR型藍(lán)藻毒素的分離及定性定量分析:利用高效液相色譜儀串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)藍(lán)藻毒素濃縮液中的RR/LR型藍(lán)藻毒素的進(jìn)行分離，同時(shí)對(duì)其含量進(jìn)行測(cè)定。其中，高效液相色譜儀為Ultimate3000型高效液相色譜儀(Dionex, USA)，質(zhì)譜儀為3200Q TRAP型串聯(lián)質(zhì)譜儀(Aglient, USA)。
[0046]A.色譜條件和質(zhì)譜條件
[0047]色譜條件:色譜柱為Welch Ultimate XB-C18 色譜柱(4.6_X 150mm,粒徑 5 μ m);流動(dòng)相為如下流動(dòng)相A和流動(dòng)相B，采用所述流動(dòng)相A和所述流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫；流動(dòng)相A:甲醇；流動(dòng)相B:體積百分含量為0.1%的甲酸水溶液；所述梯度洗脫為:0?3min，所述流動(dòng)相中所述流動(dòng)相A和所述流動(dòng)相B的體積比從30:70線性變化到75:25 ；4?8min，所述流動(dòng)相中所述流動(dòng)相A和所述流動(dòng)相B的體積比為75:25 ;9?12min,所述流動(dòng)相中所述流動(dòng)相A和所述流動(dòng)相B的體積比從75:25線性變化到30:70 ;柱溫30°C，流速0.8ml/min,進(jìn)樣體積5 μ L。
[0048]質(zhì)譜條件:正離子電離方式；噴霧電壓(IS)為5kV ;離子化溫度(TEM)為500°C;源內(nèi)氣體I (GS1，N2)壓力為55kPa，源內(nèi)氣體2 (GS2，N2)壓力為55kPa ;掃描方式為選擇離子模式，選擇質(zhì)荷比為519.8或995.6 (MC-RR的質(zhì)荷比為519.8，MC-LR的質(zhì)荷比為995.6)；碰撞氣壓力為Medium級(jí)；碰撞電壓為35V或50V (提取MC-LR時(shí)碰撞電壓50V，提取MC-RR時(shí)碰撞電壓35V)。
[0049]B.待測(cè)樣品中藍(lán)藻毒素含量的定量分析
[0050]在對(duì)步驟(4)中得到的藍(lán)藻毒素濃縮液，以及不同濃度的RR型藍(lán)藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品(或LR型藍(lán)藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品)(溶劑為甲醇)進(jìn)行以上液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)過(guò)程中，質(zhì)譜儀分析軟件根據(jù)檢測(cè)結(jié)果自動(dòng)提取待測(cè)樣品(藍(lán)藻毒素濃縮液)中與RR型藍(lán)藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品(或LR型藍(lán)藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品)保留時(shí)間一致的物質(zhì)的面積計(jì)數(shù)(Area counts)，一方面以RR型藍(lán)藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品(或LR型藍(lán)藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品)溶液的濃度(ng/mL)為橫坐標(biāo)，以RR型藍(lán)藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品(或LR型藍(lán)藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品)溶液的面積計(jì)數(shù)(Area counts)為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到RR型藍(lán)藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品(或LR型藍(lán)藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程；另一方面將待測(cè)樣品(藍(lán)藻毒素濃縮液)的面積計(jì)數(shù)(Area counts)自動(dòng)代入RR型藍(lán)藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品(或LR型藍(lán)藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出待測(cè)樣品(藍(lán)藻毒素濃縮液)中的RR型藍(lán)藻毒素(或LR型
藍(lán)藻毒素)的含量。
[0051](6)藍(lán)藻毒素精提取物質(zhì)保存:分別收集與RR型藍(lán)藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間(5.14min) 一致的洗脫峰和與LR型藍(lán)藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間(5.76min) 一致的洗脫峰，減壓蒸干后，放置在_80°C冰箱中保存。從而成功從藍(lán)藻毒素濃縮液中同時(shí)分離得到RR型藍(lán)藻毒素(MC-RR)和LR型藍(lán)藻毒素(MC-LR)。
[0052]2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果 [0053]根據(jù)以上步驟I (5)的檢測(cè)，分別得到待測(cè)樣品(藍(lán)藻毒素濃縮液)中RR型藍(lán)藻毒素(MC-RR)和LR型藍(lán)藻毒素(MC-LR)的含量。具體結(jié)果如表1所示。
[0054]表1藍(lán)藻毒素粗提取中不同用量的甲醇和冰醋酸處理提取效果比較
[0055]
【權(quán)利要求】
1.一種從水體中提取藍(lán)藻毒素的方法，包括如下步驟: (1)取待提取水體，向其中加入甲醇和冰醋酸，使甲醇的終體積含量為40%，使冰醋酸的終體積含量為3-5%，300赫茲連續(xù)超聲15-20min ； (2)將步驟(1)超聲處理后的水樣調(diào)節(jié)pH為3，用0.45 μ m濾膜過(guò)濾，濾液于6500g離心5-10min,取上清； (3)將步驟(2)所得上清過(guò)固相萃取柱，用體積含量為40%的甲醇水溶液淋洗，再用體積含量為95%的甲醇水溶液洗脫，得到含有藍(lán)藻毒素的洗脫液； (4)從步驟(3)的洗脫液中獲得藍(lán)藻毒素。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:在上述方法中，步驟(1)為如下(I)或(II): (I)向待提取水體中加入甲醇和冰醋酸，使甲醇的終體積含量為40%，使冰醋酸的終體積含量為3%，300赫茲連續(xù)超聲15min ； (II)向待提取水體中加入甲醇和冰醋酸，使甲醇的終體積含量為40%，使冰醋酸的終體積含量為5%，300赫 茲連續(xù)超聲20min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:步驟(1)中，在所述向待提取水體中加入甲醇和冰醋酸之前，還包括如下步驟:將所述待提取水體過(guò)100目網(wǎng)篩，將過(guò)篩后水樣用500g離心去沉淀。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:步驟(3)中，所述固相萃取柱為C18固相萃取柱。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于:所述C18固相萃取柱為CleanertC18-SPE層析柱。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:在步驟(4)中，所述從步驟(3)的洗脫液中獲得藍(lán)藻毒素的方法包括如下(a)和(b)的步驟: Ca)將所述洗脫液濃縮，得到藍(lán)藻毒素的濃縮液，所述濃縮液中的溶劑為甲醇； (b )用高效液相色譜儀串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)步驟(a)所得濃縮液進(jìn)行鑒定與分離，從所述濃縮液中分別得到所述RR型藍(lán)藻毒素和所述LR型藍(lán)藻毒素。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于:進(jìn)行所述步驟(b)時(shí)，采用的高效液相色譜條件如下:色譜柱為C18色譜柱；流動(dòng)相為如下流動(dòng)相A和流動(dòng)相B，采用所述流動(dòng)相A和所述流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫；流動(dòng)相A:甲醇；流動(dòng)相B:體積百分含量為0.1%的甲酸水溶液；所述梯度洗脫為:0~3min，所述流動(dòng)相中所述流動(dòng)相A和所述流動(dòng)相B的體積比從30:70線性變化到75:25 ；4~8min，所述流動(dòng)相中所述流動(dòng)相A和所述流動(dòng)相B的體積比為75:25 ；9~12min，所述流動(dòng)相中所述流動(dòng)相A和所述流動(dòng)相B的體積比從75:25線性變化到30:70 ； 進(jìn)行所述步驟(b)時(shí)，采用的質(zhì)譜條件如下:正離子電離方式；噴霧電壓為5kV ;離子化溫度為500°C;源內(nèi)氣體I為N2、壓力為55kPa ;源內(nèi)氣體2為N2、壓力為55kPa ;掃描方式為選擇離子模式，選擇質(zhì)荷比為519.8或995.6 ;碰撞氣壓力為Medium級(jí)；碰撞電壓為35V或50V。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:所述高效液相色譜條件中，流速為0.8ml/min,上樣體積為5-10 μ L,柱溫為30°C。
9.根據(jù)權(quán)利要求6-8中任一所述的方法，其特征在于:所述步驟(b)為:采用權(quán)利要求7或8中所述的色譜條件和質(zhì)譜條件對(duì)所述濃縮液進(jìn)行檢測(cè)，收集保留時(shí)間為5.14min的洗脫峰，從而實(shí)現(xiàn)從所述濃縮液中分離得到所述RR型藍(lán)藻毒素；收集保留時(shí)間為5.76min的洗脫峰，從而實(shí)現(xiàn)從所述濃縮液中分離得到所述LR型藍(lán)藻毒素。
10.根據(jù)權(quán)利 要求1-9中任一所述的方法，其特征在于:所述待提取水體為藍(lán)藻水華水體。
【文檔編號(hào)】G01N30/06GK103543219SQ201310424925
【公開(kāi)日】2014年1月29日 申請(qǐng)日期:2013年9月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月17日
【發(fā)明者】曲疆奇, 張清靖, 辛知明, 朱華 申請(qǐng)人:北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所