成纖維樣滑膜細胞在制備類風濕關(guān)節(jié)炎診斷試劑中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了成纖維樣滑膜細胞在制備類風濕關(guān)節(jié)炎診斷試劑如試劑盒、細胞芯片中的應(yīng)用。證實了RA患者血清中存在能與成纖維樣滑膜細胞結(jié)合的特異性抗體。建立了以成纖維樣滑膜細胞為底物抗原的間接免疫熒光方法和細胞芯片檢測方法，對RA的診斷具有較高的敏感性和特異性，為RA的診斷提供了新的診斷試劑和方法。
【專利說明】成纖維樣滑膜細胞在制備類風濕關(guān)節(jié)炎診斷試劑中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及類風濕關(guān)節(jié)炎診斷試劑技術(shù)，具體地說，是成纖維樣滑膜細胞在制備 類風濕關(guān)節(jié)炎診斷試劑中的應(yīng)用，屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid art虹itis，RA)是一種系統(tǒng)性自身免疫性疾病，主要 累及周圍關(guān)節(jié)，表現(xiàn)為慢性、對稱性、進行性關(guān)節(jié)炎。RA的病理改變最初表現(xiàn)為關(guān)節(jié)滑膜增 生，并逐漸向軟骨、骨及周圍肌膊侵犯，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞、關(guān)節(jié)崎形及功能喪失。RA多發(fā) 于中年女性，患病率在我國為0. 32%?0. 36%，在歐美國家則高達1%。RA的病因目前尚不 清楚，主要與感染因素、遺傳因素及激素水平改變有關(guān)，其臨床表現(xiàn)主要W關(guān)節(jié)癥狀為主， 表現(xiàn)為晨僵、關(guān)節(jié)痛、關(guān)節(jié)腫脹及關(guān)節(jié)崎形。關(guān)節(jié)外表現(xiàn)主要包括類風濕結(jié)節(jié)、類風濕血管 炎及肺損壞、腎臟損壞和也臟損壞。RA的診斷主要依據(jù)美國風濕病學(xué)會1987年RA分類標 準；（1)晨僵持續(xù)1小時，病程至少6周；（2)有3個或3個W上的關(guān)節(jié)腫，至少6周；（3) 腕、掌指、近端關(guān)節(jié)腫，至少6周；（4)對稱性關(guān)節(jié)腫，至少6周；（5)有皮下結(jié)節(jié)；（6)手X 線改變；（7)血清類風濕因子（RF)升高；滿足4條或4條W上并排除其他關(guān)節(jié)炎即可診斷 為RA。2012年最新的美國風濕病學(xué)會RA分類標準中添加了抗環(huán)瓜氨酸膚抗體(抗CCP抗 體）作為RA診斷的檢測指標。從上述RA診斷標準看，該疾病的診斷主要依靠臨床表現(xiàn)結(jié) 合放射性檢查及實驗室檢測指標。在已知的RA相關(guān)的自身抗體當中，類風濕因子敏感性為 60%?70%，特異性為86% ;抗角蛋白抗體（AKA)敏感性為44%?73%，特異性為90% ;抗核周 因子抗體（APF)敏感性為48%?66%，特異性為92% ;抗聚角蛋白微絲蛋白抗體（AFA)敏感 性為47%?69%，特異性為93% ;抗CCP抗體敏感性為47%?82%，特異性為96%。雖然該些 RA實驗室檢測指標已經(jīng)達到相當高的敏感性和特異性，但據(jù)統(tǒng)計，在RA當中仍有20%左右 患者呈RF和CCP雙陰性，所W，尋求敏感性和特異性更高的RA檢測指標及方法，仍是該疾 病臨床研究的重點課題。
[0003] 上述的自身抗體檢測都是W特定蛋白或多膚為抗原底物，通過抗原抗體反應(yīng)的原 理設(shè)計檢測血清中針對該蛋白或多膚的抗體。該些抗原底物的來源主要通過分離提純、重 組表達或體外化學(xué)合成（多膚）獲得，通過上述方法獲得的抗原底物與體內(nèi)天然存在的抗原 在理化性質(zhì)、生物活性或空間構(gòu)象上存在一定差異，應(yīng)用該樣得到的抗原底物對其血清抗 體進行檢測會不可避免的造成誤差。為避免上述問題，研究者采用間接免疫英光的方法對 疾病進行定性診斷。該方法是將某種特定細胞為底物抗原固定在固相載體上，如載玻片，將 待測血清與其反應(yīng)，再通過帶英光的抗人IgG二抗與血清中能和細胞反應(yīng)的抗體結(jié)合，從 而在英光顯微鏡下觀察英光強度來判斷血清中含抗該細胞抗體多少，與標準陽性血清或陰 性血清比較，從而判斷待測血清的陰陽性。因為該方法操作簡便，判斷直觀，在臨床上得到 廣泛應(yīng)用。
[0004] 抗細胞抗體在臨床上應(yīng)用較多的有如下檢測；（1)抗內(nèi)皮細胞抗體檢測是W人廝 靜脈內(nèi)皮細胞為底物抗原，用于白色?。˙D)的輔助診斷；其在BD中的敏感性為54. 8%，特異 性為87. 2% ;而在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)、系統(tǒng)性硬化癥（SSc)及RA中陽性率分別為8%、9% 及10% ; (2)抗巨核細胞抗體檢測是W人巨核細胞為底物抗原，主要用于SLE的輔助診斷； (3)抗人腎臟集合管細胞抗體檢測主要用于腎臟疾病的輔助診斷；（4)抗壁細胞抗體檢測 主要用于惡性貧血的輔助診斷。
[0005] 蛋白芯片具有高通量、平行檢測、自動化等優(yōu)點，為簡便、快速、同時檢測多種自身 抗體問題的解決帶來了希望，在臨床疾病診斷等領(lǐng)域中發(fā)揮了重要的作用。既往的蛋白芯 片在制備過程中所點的樣都是特定的抗原(用其來檢測特異性抗體)，其來源大多數(shù)為通過 基因工程方法重組表達而成。重組表達的蛋白抗原，無論是原核或真核表達，其蛋白產(chǎn)物在 理化性質(zhì)、生物學(xué)活性或免疫學(xué)性質(zhì)上與天然存在的蛋白之間多少存在差異，該樣會導(dǎo)致 用該蛋白檢測人體特異性抗體的時候產(chǎn)生誤差。直接用原代培養(yǎng)的細胞作為底物，由于細 胞中表達的蛋白與體內(nèi)細胞比較相差最小，在針對檢測該細胞蛋白抗體時比重組表達的蛋 白更具優(yōu)勢?，F(xiàn)有技術(shù)中尚無采用一定數(shù)量的成纖維樣滑膜細胞點樣來檢測血清中相應(yīng)抗 體含量從而對RA進行實驗室診斷的報道。
[0006] RA發(fā)病機制至今尚不明確，據(jù)研究報道可能參與RA疾病發(fā)生的細胞多達十余種。 其中，目前得到公認的是CD4+T細胞，尤其是化17細胞被認為在RA發(fā)病中起主要作用。而 其他效應(yīng)細胞，如成纖維樣滑膜細胞、軟骨細胞、服大細胞、巨瞻細胞等在RA發(fā)病機制中也 扮演不同角色。然而就RA而言，現(xiàn)有技術(shù)中未公開哪種細胞蛋白能作為抗原底物通過檢測 患者血清中抗體達到輔助診斷的目的，且很多細胞參與RA疾病發(fā)生并非通過抗體發(fā)揮作 用。已知的人體內(nèi)細胞的種類不計其數(shù)，在RA中如何尋找一種細胞，針對其蛋白底物進行 自身抗體檢測W建立具有高度敏感性和特異性的輔助診斷方法仍是本領(lǐng)域的難點。
[0007] 正?；ひr里層細胞包括巨瞻細胞樣滑膜細胞、成纖維樣滑膜細胞 (fibroblast-1化e synovial cells,簡稱化S)和樹突狀滑膜細胞。在RA發(fā)病機制中，一 致認為成纖維樣滑膜細胞的過度增生和對軟骨的破壞是造成關(guān)節(jié)病理改變的根本原因，它 是參與RA滑膜炎癥反應(yīng)的效應(yīng)細胞，但就成纖維樣滑膜細胞在制備RA診斷試劑中的應(yīng)用 卻未見報道，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，成纖維樣滑膜細胞能用于診斷RA也是非顯而易見 的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供成纖維樣滑膜細胞在制備類風濕關(guān) 節(jié)炎診斷試劑中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明的再一的目的是，提供一種成纖維樣滑膜細胞在制備類風濕關(guān)節(jié)炎診斷試 劑盒中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的另一的目的是，提供一種成纖維樣滑膜細胞在制備類風濕關(guān)節(jié)炎診斷細 胞芯片中的應(yīng)用。
[0011] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是： 成纖維樣滑膜細胞在制備類風濕關(guān)節(jié)炎診斷試劑中的應(yīng)用。
[0012] 所述的成纖維樣滑膜細胞是體外培養(yǎng)的人成纖維樣滑膜細胞。
[0013] 為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是： 成纖維樣滑膜細胞在制備類風濕關(guān)節(jié)炎診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0014] 所述的診斷試劑盒中包括體外培養(yǎng)的人成纖維樣滑膜細胞及間接免疫英光檢測 法所用的其他試劑。
[0015] 所述的間接免疫英光檢測法的步驟為： (1) 將體外培養(yǎng)的人成纖維樣滑膜細胞固定； (2) 用含BSA的PBS封閉液封閉； (3) 取待測血清賠育固定的成纖維樣滑膜細胞； (4) 切3標記的羊抗人IgG二抗賠育； (5) DAPI溶液染核； (6) 英光顯微鏡觀察，類風濕關(guān)節(jié)炎患者血清賠育的成纖維樣滑膜細胞胞漿均勻著色， 其他患者及正常人血清賠育的成纖維樣滑膜細胞胞漿均不著色。
[0016] 所述的英光顯微鏡觀察條件為；使用鉛濾光片，激發(fā)波長554nm，發(fā)射波長570nm。
[0017] 為實現(xiàn)上述第H個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是： 成纖維樣滑膜細胞在制備類風濕關(guān)節(jié)炎診斷細胞芯片中的應(yīng)用。
[0018] 所述的細胞芯片中固定有體外培養(yǎng)的人成纖維樣滑膜細胞。
[0019] 所述的細胞芯片的制備方法為： (1) 應(yīng)用點樣儀軟件設(shè)計矩陣，確定點間距、點樣順序、點樣坐標，每個樣本設(shè)置3個復(fù) 孔； (2) 選擇經(jīng)預(yù)處理的玻片作為基片，將濃度為IX lOVmL的成纖維樣滑膜細胞息液應(yīng)用 點樣儀加到基片中，干燥過夜； (3) 將點樣后的基片放置到濕盒中，37。直溫水浴固定2小時； (4) 封閉并洗涂基片，置于4C保存?zhèn)溆谩?br> [0020] 所述的細胞芯片的使用方法為；取待測血清加入細胞芯片矩陣反應(yīng)，經(jīng)過洗涂，然 后與切3標記的抗人IgG二抗反應(yīng)，再次洗涂后，用激光共聚焦掃描儀進行掃描英光強度， 最后根據(jù)標準曲線用如ant Anlysis分析待測血清中抗成纖維樣滑膜細胞抗體濃度，再與 cutoff值比較，判斷待測血清是否為陽性。
[0021] 本發(fā)明優(yōu)點在于： 本發(fā)明提供了成纖維樣滑膜細胞在制備類風濕關(guān)節(jié)炎診斷試劑如試劑盒、細胞芯片中 的應(yīng)用；證實了 RA患者血清中存在能特異性與成纖維樣滑膜細胞結(jié)合的抗體；建立了 W成 纖維樣滑膜細胞為底物抗原的間接免疫英光方法和細胞芯片檢測方法，具備高通量、自動 化操作的特點，對RA的診斷具有較高的敏感性和特異性，為RA的診斷提供了新的診斷試劑 和方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 附圖1是用特異性標記CD55鑒定原代培養(yǎng)的成纖維樣滑膜細胞，圖A為CD55染 色，表現(xiàn)為細胞漿著色；圖B為DAPI染色顯示細胞核；圖C為A+B疊加后的圖片，同時顯示 細胞核和CD55顯色。
[0023] 附圖2是不同患者及正常人血清與成纖維樣滑膜細胞蛋白Western-Blot圖，分別 是RA患者血清（RA1-RA8)、SLE患者血清（SLE1-SLE2)、0A患者血清（0A1-0A2)及正常人血 清（NC1-NC4)。
[0024] 附圖3是RA患者、SLE患者、OA患者及正常人血清賠育成纖維樣滑膜細胞間接免 疫英光圖。
[0025] 附圖4是人IgG標準品濃度與英光強度之間的線性關(guān)系。
[0026] 附圖5是用特異性標記CII鑒定原代培養(yǎng)的軟骨細胞，圖A為CII染色，表現(xiàn)為細 胞胞漿著色；圖B為DAPI染色顯示細胞核；圖C為A+B疊加后的圖片，同時顯示細胞核和 CII顯色。
[0027] 附圖6是RA患者及正常人血清與軟骨細胞蛋白的Western-Blot圖，A圖表示RA 患者血清，B圖表示正常人血清。
[0028] 附圖7是RA患者血清和正常人血清賠育的軟骨細胞胞漿著色情況，A圖表示RA患 者血清，B圖表示正常人血清。
[0029] 附圖8是RA患者及正常人血清與化17細胞蛋白的Western-Blot圖，A圖表示RA 患者血清，B圖表示正常人血清。

【具體實施方式】
[0030] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[00引]實施例1 一、人成纖維樣滑膜細胞的分離鑒定及原代培養(yǎng) 1、滑膜來源 滑膜取自膝關(guān)節(jié)置換或滑膜切除術(shù)的RA患者，患者診斷符合1987年美國風濕病學(xué)會 分類標準。
[0032] 2、滑膜細胞分離培養(yǎng) 將術(shù)中取得的滑膜組織用無菌剪剪碎，用1.0 mg/mL I型膠原酶（GIBC0)在37C下消 化化，離也收集細胞，加入含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液（GIBC0)，置于37C、5%0)2賠箱 中貼壁生長。細胞生長到80%培養(yǎng)瓶底部時，用0. 25%膜酶（Sigma)進行消化，小牛血清終 止，0.01M PBS洗涂離也，收集細胞，傳代培養(yǎng)。經(jīng)傳代W后滑膜細胞迅速增殖，1代W后成 纖維樣滑膜細胞比例逐漸增加，至第3代可占視野內(nèi)細胞95% W上(張鵬，石關(guān)桐.膝骨關(guān) 節(jié)炎滑膜細胞體外培養(yǎng)及生物學(xué)特性觀察.中國骨傷，2006,19 (10:656-658)。本實驗均 采用第3代成纖維樣滑膜細胞。
[0033] 3、成纖維樣滑膜細胞的鑒定 培養(yǎng)皿吸去上清，用甲醇在一2(TC下固定10分鐘。用0.01M PBS洗涂3次，羊血清 封閉30分鐘，0.01M PBS洗涂3次，每次5分鐘。用成纖維樣滑膜細胞特異性標記CD55 (M D Smith, E Barg, H Weedon. Microarchitecture and protective mechanisms in synovial tissue from clinically and arthroscopically normal knee joints. Ann 化eumDis 2003，62: 303-307)單克隆抗體（Abeam)按照1:1000稀釋后室溫賠育1小時， 0. 01M PBS洗涂3次，每次5分鐘。用切3標記的抗小鼠IgG二抗按照1:2000稀釋，室溫賠 育30分鐘，0.01M PBS洗涂3次，每次5分鐘。最后用1:10000稀釋的DAPI染細胞核，洗涂 完成后加入防英光渾滅劑封片，在英光顯微鏡下觀察。結(jié)果見圖1，結(jié)果證實從滑膜分離培 養(yǎng)后獲得的細胞為成纖維樣滑膜細胞。
[0034] 二、證實人血清中存在抗成纖維樣滑膜細胞抗體 1、成纖維樣滑膜細胞蛋白提取 (1)倒掉培養(yǎng)液，培養(yǎng)瓶傾斜放置1?2分鐘，殘余培養(yǎng)液用移液管吸走。
[00巧](2)每瓶細胞加3血4°C預(yù)冷的0. 01M PBS。平放輕輕搖動1分鐘W洗涂細胞，然 后棄去洗液。共洗細胞H次，將PBS棄凈后把培養(yǎng)瓶置于冰上。
[0036] (3)每瓶細胞中加入200UL Pierce裂解液(預(yù)先加入蛋白酶抑制劑PMSF)，靜置20 分鐘；在10000g、4°C下離也20分鐘，保留上清。將離也后的上清測定濃度后，分裝，放于一 8(TC保存。
[0037] 2、上樣及電泳 (1)在成纖維樣滑膜細胞蛋白樣品中加入2XSDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，混勻后lOCrC 沸水浴加熱35分鐘，使蛋白充分變性。
[003引（2)變性后的蛋白冷卻到室溫后，把蛋白樣品直接上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)， 使用Bio-Rad的電泳裝置，恒壓設(shè)置100V，漠酷藍到達膠的底端處附近停止電泳。
[003引 3、轉(zhuǎn)膜 采用PVDF膜，將PVDF膜分別浸于甲醇15砂、純水3分鐘、轉(zhuǎn)移緩沖液15分鐘預(yù)處理； 凝膠浸泡于電泳緩沖液5分鐘；在Bio-Rad的標準濕式轉(zhuǎn)膜裝置，設(shè)定轉(zhuǎn)膜電流為300mA， 轉(zhuǎn)膜時間為60分鐘。轉(zhuǎn)完膜后，用麗春紅染色液對膜進行染色，W觀察實際的轉(zhuǎn)膜效果，同 時通過其顯示條帶將每份蛋白樣品剪開，W便于賠育不同血清。
[0040] 4、封閉 轉(zhuǎn)膜完畢后，用洗涂液將膜洗3次，每次3分鐘；洗涂完成后將膜加入脫脂奶粉配成的 封閉液中，4C封閉過夜。
[0041] 5、血清賠育 RA患者、骨關(guān)節(jié)炎（osteoart虹itis,簡稱0A)患者、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus eirthematosus,簡稱SLE)患者及正常人（NC)的血清按照1:200濃度稀釋后加入到濕轉(zhuǎn)后 的PVDF膜，室溫，在水平搖床上輕微震蕩賠育1小時。賠育結(jié)束后，用洗涂液洗涂6次，每 次10分鐘，W減輕背景。
[0042] 6、二抗賠育 采用辣根過氧化物酶（HRP)標記的抗人IgG二抗，按照1:10000濃度稀釋后，室溫，在 水平搖床上輕微震蕩賠育30分鐘。賠育結(jié)束后，用洗涂液洗涂6次，每次10分鐘，W減輕 3b曰 曰原。
[0043] 7、化學(xué)發(fā)光及X片顯影 在PVDF膜上加入化學(xué)發(fā)光底物（Thermo)后在暗盒中進行曝光，在自行配制的顯影液 和定影液進行手工洗片。結(jié)果見圖2,與RA患者血清賠育的PVDF膜上能顯示多條反應(yīng)條 帶，而與SLE、0A及正常人（NC)血清賠育的PVDF膜上在相同條件下不能顯示相應(yīng)條帶，該 結(jié)果說明RA患者血清中存在能特異性與成纖維樣滑膜細胞蛋白反應(yīng)的抗體。
[0044] H、抗成纖維樣滑膜細胞抗體檢測方法的建立一間接免疫英光法 1、成纖維樣滑膜細胞的固定 將獲得的第3代成纖維樣滑膜細胞在膜酶消化后，制得單細胞息液，鋪于96孔板上，每 孔lOOuL，37C培養(yǎng)過夜，吸去培養(yǎng)液，經(jīng)過PBS洗涂3次后，每孔加入95%己醇(或甲醇、5% 冰醋酸）200uL，4°C固定20分鐘。固定后的細胞去掉固定液后再經(jīng)PBS洗涂3次后，拍干， 置于一20°C保存?zhèn)溆谩?br> [004引 2、封閉 每孔用含3% BSA的0.01M PBS封閉液lOOuL在室溫下，封閉1小時。完成后，棄去封 閉液，洗涂液漂洗3次，每次5分鐘。
[0046] 3、血清賠育 分別取RA患者、SLE患者、0A患者及正常人血清按照1:100倍稀釋，在固定了成纖維樣 滑膜細胞的96孔板中，每孔加入上述稀釋后血清lOOuL，室溫賠育1小時。賠育完成后，吸 去血清，拍干，洗涂液洗涂6次，每次3分鐘。
[0047] 4、切3標記的羊抗人IgG二抗賠育 每孔加入lOOuL，1:1000稀釋濃度的切3標記的羊抗人IgG，室溫賠育30分鐘。完成 后，棄去封閉液，洗涂液漂洗6次，每次5分鐘。
[0048] 5、染核 將1:10000稀釋的DAPI溶液lOOuL加入各孔中，常溫反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后用洗 涂液漂洗3次，每次5分鐘。加蓋蓋玻片封片后英光顯微鏡下觀察。
[0049] 6、英光顯微鏡觀察 使用鉛濾光片，激發(fā)波長554nm、發(fā)射波長570nm條件下觀察切3英光強度。結(jié)果見圖 3,用RA患者血清賠育的成纖維樣滑膜細胞胞漿均勻著色(紅色)，而用SLE患者、0A患者及 正常人血清賠育的成纖維樣滑膜細胞胞漿均不著色。
[0050] 四、抗成纖維樣滑膜細胞抗體細胞芯片檢測方法的建立 1、細胞芯片的制備 (1)矩陣設(shè)計： 應(yīng)用點樣儀ProSys 5510軟件設(shè)計矩陣，確定點間距，點樣順序，點樣坐標等指標，每 個樣本設(shè)置3個復(fù)孔。
[0051] (2)點樣： 選擇經(jīng)預(yù)處理的玻片作為基片，將濃度為IX lOVmL的成纖維樣滑膜細胞息液應(yīng)用點 樣儀加到基片中，干燥過夜。
[005引 （3)固定： 將點樣后的基片放置到濕盒中，37C恒溫水浴固定2小時。
[0053] (4)封閉： 采用1%BSA溶液，每矩陣加入50uL，放置到濕盒中，37 C恒溫水浴封閉半小時； 0. 1%TBST洗涂3次，每次15分鐘；封閉洗涂后的基片置于4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0054] 2、標準曲線的建立 (1) 標準品點樣；按照 50ng/mL、5ng/mL、2. 5ng/mL、l. 25ng/mL、0. 625ng/mL 五個濃度梯 度的純化人IgG加入到矩陣相應(yīng)位置；37°C反應(yīng)30分鐘； (2) 洗涂；PBST洗涂3次，每次10分鐘； (3) 英光二抗；選擇濃度為0. 2ng/mL切3標記的抗人IgG二抗，37C反應(yīng)30分鐘； (4) 洗涂；PBST洗涂3次，每次10分鐘； (5) 掃描及繪制標準曲線：應(yīng)用美國Innopsys公司Innoscan 710激光共聚焦掃 描儀進行掃描，將掃描后得到的結(jié)果經(jīng)如ant Anlysis分析各個標準品英光強度，輸入 Excel軟件，進行線性回歸分析，得到標準曲線，結(jié)果見圖4,線性方程為y=l. 692X+11. 804， R2=0. 9925。
[0055] 3、待測血清抗成纖維樣滑膜細胞抗體濃度檢測 (1) 待測血清用1:200稀釋后，每份血清50uL加入矩陣，37°C反應(yīng)30分鐘； (2) 洗涂；PBST洗涂3次，每次10分鐘； (3) 英光二抗；選擇濃度為0. 2ng/mL切3標記的抗人IgG二抗，37C反應(yīng)30分鐘； (4) 洗涂；PBST洗涂3次，每次10分鐘； (5) 掃描及根據(jù)標準曲線計算待測樣本抗體含量：應(yīng)用美國Innopsys公司Innoscan 710激光共聚焦掃描儀進行掃描，將掃描后得到的結(jié)果經(jīng)如ant Anlysis分析各個待測血 清樣本英光強度，根據(jù)標準曲線計算待測血清樣本中抗體的含量。24例RA患者（RA1-RA24) 及24例正常人（NC1-NC24)血清英光強度檢測結(jié)果見表1，按照圖4得到的標準曲線公式進 行計算，定量得到待測血清抗成纖維樣滑膜細胞抗體濃度，結(jié)果見表2。
[0056] 表1 RA患者及正常人血清英光強度

【權(quán)利要求】
1. 成纖維樣滑膜細胞在制備類風濕關(guān)節(jié)炎診斷試劑中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的成纖維樣滑膜細胞是體外培養(yǎng)的 人成纖維樣滑膜細胞。
3. 成纖維樣滑膜細胞在制備類風濕關(guān)節(jié)炎診斷試劑盒中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的診斷試劑盒中包括體外培養(yǎng)的人 成纖維樣滑膜細胞及間接免疫熒光檢測法所用的其他試劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的間接免疫熒光檢測法的步驟為： (1) 將體外培養(yǎng)的人成纖維樣滑膜細胞固定； (2) 用含BSA的PBS封閉液封閉； (3) 取待測血清孵育固定的成纖維樣滑膜細胞； (4) Cy3標記的羊抗人IgG二抗孵育； (5) DAPI溶液染核； (6) 熒光顯微鏡觀察，類風濕關(guān)節(jié)炎患者血清孵育的成纖維樣滑膜細胞胞漿均勻著色， 其他患者及正常人血清孵育的成纖維樣滑膜細胞胞漿均不著色。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的熒光顯微鏡觀察條件為：使用鉻濾 光片，激發(fā)波長554nm，發(fā)射波長570nm。
7. 成纖維樣滑膜細胞在制備類風濕關(guān)節(jié)炎診斷細胞芯片中的應(yīng)用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的細胞芯片中固定有體外培養(yǎng)的人 成纖維樣滑膜細胞。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的細胞芯片的制備方法為： (1) 應(yīng)用點樣儀軟件設(shè)計矩陣，確定點間距、點樣順序、點樣坐標，每個樣本設(shè)置3個復(fù) 孔； (2) 選擇經(jīng)預(yù)處理的玻片作為基片，將濃度為IX 103/mL的成纖維樣滑膜細胞懸液應(yīng)用 點樣儀加到基片中，干燥過夜； (3) 將點樣后的基片放置到濕盒中，37°C恒溫水浴固定2小時； (4) 封閉并洗滌基片，置于4°C保存?zhèn)溆谩?br> 10. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的細胞芯片的使用方法為：取 待測血清加入細胞芯片矩陣反應(yīng)，經(jīng)過洗滌，然后與Cy3標記的抗人IgG二抗反應(yīng)，再次洗 滌后，用激光共聚焦掃描儀進行掃描熒光強度，最后根據(jù)標準曲線用Quant Anlysis分析待 測血清中抗成纖維樣滑膜細胞抗體濃度，再與cutoff值比較，判斷待測血清是否為陽性。
【文檔編號】G01N33/53GK104422761SQ201310405870
【公開日】2015年3月18日 申請日期:2013年9月9日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月9日
【發(fā)明者】李立 申請人:李立