一種肌酸酐含量檢測試劑盒的使用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種肌酸酐含量檢測試劑盒的使用方法，在含有100mMHEPES，150mM氯化鈉，5mM氯化鉀，1.3mM氯化鈣的緩沖液中，pH7.3，加入不同濃度肌酸酐，用毛細管兩驅(qū)150μL的樣品溶液并安插在試劑盒上并用熒光儀開始測量。本發(fā)明所使用的方法具有高度的選擇性，作為蛋白質(zhì)酶，其對反應(yīng)物具有高度的特異性，肌酸酐酶只能催化肌酸酐的水解反應(yīng)，對其他的反應(yīng)底物都沒有催化活性，由于檢測過程中涉及到三種高度特異性的酶，本方法的選擇性更是呈指數(shù)增加，試劑盒最后給出的響應(yīng)是熒光響應(yīng)，相與某些檢測顏色變化的方法相比，熒光響應(yīng)的固有特性賦予本發(fā)明更高的靈敏度以及抗干擾的能力。
【專利說明】一種肌酸酐含量檢測試劑盒的使用方法
[0001]本申請是一種肌酸酐含量檢測試劑和試劑盒，及試劑盒的制作和使用方法的分案申請，原申請申請日2011年9月20日，原申請?zhí)?2011102799693，發(fā)明創(chuàng)造名稱:一種肌酸酐含量檢測試劑和試劑盒，及試劑盒的制作和使用方法。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于肌酸酐檢測領(lǐng)域，尤其是一種肌酸酐含量檢測試劑和試劑盒，及試劑盒的制作和使用方法。
【背景技術(shù)】
[0003]肌酸酐是磷酸肌酸代謝的產(chǎn)物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)是肌酸通過脫水縮合形成的內(nèi)酰胺。肌酸酐一般存在于血液中，通過血液循環(huán)到達腎臟并被過濾掉。對于腎功能正常的人群來說，血液中的肌酸酐濃度因人因地而異。一般而言，在無大體力負擔的情況下，女性的血液中的肌酸酐濃度在45-60 μ M ;男性的血液肌酸酐濃度在60-110 μ M的范圍內(nèi)浮動。當腎功能出現(xiàn)問題時，腎臟過濾清除肌酸酐的能力就會降低，導(dǎo)致血液中肌酸酐的濃度異常升高而尿液中肌酸酐濃度降低，因此通過測量血液和尿液中肌酸酐的濃度，就可以測量肌酸酐清除率甚至腎小球率過濾，這兩個參數(shù)對于衡量腎功能具有重要的意義，因此，可以快捷的測量血液和尿液中的肌酸酐濃度，對于臨床和科研，都具有十分重大的應(yīng)用前景。
[0004]肌酸酐的測量比較困難。目前常用的方法是質(zhì)譜法(同位素稀釋質(zhì)譜法)、高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜連用法以及抗體檢測(ELISA)，這些方法一般都需要昂貴的儀器，如質(zhì)譜儀、液相色譜儀或酶標儀等，以及受過系統(tǒng)訓(xùn)練的分析化學(xué)操作人員的操作，極大地提高肌酸酐測量的經(jīng)濟成本和時間成本，以及肌酸酐測量在邊遠地區(qū)的應(yīng)用。
[0005]質(zhì)譜法通過在樣品中人為加入含有某種同位素(如0-18)的肌酸酐并對此樣品進行質(zhì)譜分析。比對質(zhì)譜結(jié)果中0-18的豐度和0-18在自然界中的豐度即可計算出肌酸酐的濃度。人為加入的肌酸酐可以嚴格控制，作為一種內(nèi)標準(internal calibration),這種方法可以有效的降低誤差。根據(jù)最新研究，用質(zhì)譜法得到的肌酸酐濃度偏低，這將在臨床上引起一系列問題，美國FDA也開始考慮新的肌酸酐檢測手段。
[0006]液相色譜法是在質(zhì)譜的基礎(chǔ)上使用高效液相色譜對樣品進行純化并用質(zhì)譜進行檢測。質(zhì)譜法和液相色譜法無法自動化、操作復(fù)雜，并且需要分析團隊對儀器進行操作和維護，而ELISA法需要使用價格昂貴的酶標儀，雖然其靈敏度極高，但是選擇性較差，經(jīng)常會高估肌酸酐的濃度，導(dǎo)致臨床用藥的過量或不足。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種選擇性高、靈敏度高和使用方便的肌酸酐含量檢測試劑和試劑盒，及試劑盒的制作和使用方法。
[0008]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的:
[0009]一種肌酸酐含量檢測試劑，包括肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根過氧化物酶，熒光染料5 (6)-羧基-2，7- 二氯二氫熒光素二特戊酸酯，肌酸酐在肌酸酐酶的催化下被水解成為肌酸，肌酸在肌酸酶的催化下被水解成肌氨酸，肌氨酸隨之在肌氨酸氧化酶的催化下生成甘氨酸以及少量的過氧化氫，在辣根氧化物酶的催化下，過氧化氫催化氧化了 5
(6)-羧基-2，7- 二氯二氫熒光素二特戊酸酯并生成具有熒光響應(yīng)的產(chǎn)物，通過監(jiān)測熒光增強的速率以及標準曲線，獲得肌酸酐濃度，其中所述肌酸酐酶:肌酸酶:肌氨酸氧化酶:辣根過氧化物酶:熒光染料的重量比為:1: 50: 60: 5。
[0010]而且，包括如下三層結(jié)構(gòu):
[0011]⑴染料底層:將熒光染料修飾過的纖維素和D4水凝膠混合并攪拌，在一張干凈的塑料薄膜上用刮刀涂膜機涂上一層D4水凝膠的薄膜并使之自然風干；
[0012]⑵蛋白酶固定層:在PVA-Sbq (聚丙烯醇-苯基吡啶乙烯絡(luò)合物)的水溶液中加入10%的牛血清蛋白以及反應(yīng)所需的肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根過氧化物酶，攪拌25-40分鐘以上，用刮刀涂膜機涂上一層酶的PVA-Sbq溶液，將紫外燈置于膜層的上方30分鐘，使苯基吡啶乙烯交聯(lián)并使膜層變干；
[0013]⑶頂層保護層:最后在上面用刮刀涂膜機涂上一層含有10%炭黑的D6水凝膠，并使膜層自然風干。
[0014]而且，三層結(jié)構(gòu)的具體制備步驟如下:
[0015]⑴將176mg纖維素固定的5 (6)-羧基_2，7_ 二氯二氫突光素二特戍酸酯和2.6g的4%D4水凝膠溶液混合并攪拌均勻，使纖維素粉末在溶液中均勻分散；
[0016]⑵將步驟⑴中所制備的溶液均勻在塑料薄膜上使之形成一層厚度為IOOuM的薄月旲并晚干；
[0017]⑶將30mg肌酸酶、35mg辣根過氧化物酶、0.63mg肌酸酐酶、2.6mg肌氨酸氧化酶、340mg水和1.33g濃度為10%并含有10%牛血清蛋白的PVA-Sbq溶液混合，并在冰上攪拌均勻；
[0018]⑷在步驟⑵中制備的薄膜上涂上步驟⑶中所制備的PVA-Sbq/酶溶液，膜層的厚度為100 μ m,將薄膜置于紫外燈下30分鐘；
[0019](5)在步驟⑷中所制備的薄膜上涂上一層含有6%炭黑和1.8%D6的溶液并自然風干。
[0020]一種肌酸酐含量檢測試劑盒，包括上述的檢測試劑。
[0021]一種肌酸酐含量檢測試劑盒的制備方法，其特征在于:步驟如下:
[0022]⑴將176mg纖維素固定的5 (6)-羧基_2，7_ 二氯二氫突光素二特戍酸酯和2.6g的4%D4水凝膠溶液混合并攪拌均勻，使纖維素粉末在溶液中均勻分散；
[0023]⑵將步驟⑴中所制備的溶液均勻在塑料薄膜上使之形成一層厚度為IOOuM的薄月旲并晚干；
[0024]⑶將30mg肌酸酶、35mg辣根過氧化物酶、0.63mg肌酸酐酶、2.6mg肌氨酸氧化酶、340mg水和1.33g濃度為10%并含有10%牛血清蛋白的PVA-Sbq溶液混合，并在冰上攪拌均勻；
[0025]⑷在步驟⑵中制備的薄膜上涂上步驟⑶中所制備的PVA-Sbq/酶溶液，膜層的厚度為100 μ m,將薄膜置于紫外燈下30分鐘；
[0026](5)在步驟⑷中所制備的薄膜上涂上一層含有6%炭黑和1.8%D6的溶液并自然風干。
[0027]一種試劑盒的使用方法，其特征在于:在含有l(wèi)OOmMHEPES，150mM氯化鈉，5mM氯化鉀，1.3mM氯化鈣的緩沖液中，pH7.3，加入不同濃度肌酸酐，用毛細管兩驅(qū)150 μ L的樣品溶液并安插在試劑盒上并用熒光儀開始測量。
[0028]本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果為:
[0029]1、本發(fā)明所使用的方法具有高度的選擇性，作為蛋白質(zhì)酶，其對反應(yīng)物具有高度的特異性，肌酸酐酶只能催化肌酸酐的水解反應(yīng)，對其他的反應(yīng)底物都沒有催化活性，由于檢測過程中涉及到三種高度特異性的酶，本方法的選擇性更是呈指數(shù)增加，試劑盒最后給出的響應(yīng)是熒光響應(yīng)，相與某些檢測顏色變化的方法相比，熒光響應(yīng)的固有特性賦予本發(fā)明更高的靈敏度以及抗干擾的能力。
[0030]2、本申請?zhí)峁┝艘环N新型的用于檢測血液和尿液中肌酸酐含量的試劑盒，本試劑盒將對肌酸酐具有特異性的酶以及對過氧化物敏感的熒光染料固定在試劑盒上，并將酶催化的反應(yīng)轉(zhuǎn)化為熒光信號并得以檢測，本試劑盒可以檢測出ΙΟμΜ以上的肌酸酐，符合臨床上的使用要求。
[0031]3、本發(fā)明所使用的酶共有四種:肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根過氧化物酶，樣品中的肌酸酐通過前三種酶被降解為甘氨酸，同時生成少量的過氧化氫，在辣根過氧化物酶的催化下，過氧化氫可以氧化一種原本沒有熒光的分子，反應(yīng)產(chǎn)物是熒光素的衍生物，具有較強的熒光響應(yīng)，通過檢測熒光的增強速率，可以檢測到過氧化氫的生成速率，并間接計算出肌酸酐的濃度。
[0032]4、本發(fā)明對現(xiàn)有的肌酸酐檢測技術(shù)以及本申請所闡述的試劑盒進行了比較，作為腎功能的重要參數(shù)，肌酸酐清除率和腎小球率過濾的肌酸需要多次進行血液和尿液的肌酸酐測量，因此，本申請所提及的肌酸酐試劑盒所具有的使用簡單、價格低廉且具有高度選擇性的特點將具有十分重大的意義。
[0033]表1現(xiàn)有肌酸酐檢測方法的比較
[0034]
【權(quán)利要求】
1.一種肌酸酐含量檢測試劑盒的使用方法，其特征在于:步驟如下在含有100mMHEPES，150mM氯化鈉，5mM氯化鉀，1.3mM氯化鈣的緩沖液中，pH7.3，加入不同濃度肌酸酐，用毛細管兩驅(qū)150 μ L的樣品溶液并安插在試劑盒上并用熒光儀開始測量; 所述肌酸酐含量檢測試劑盒:包括肌酸酐酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶和辣根過氧化物酶，熒光染料5 (6)-羧基-2，7- 二氯二氫熒光素二特戊酸酯，肌酸酐在肌酸酐酶的催化下被水解成為肌酸，肌酸在肌酸酶的催化下被水解成肌氨酸，肌氨酸隨之在肌氨酸氧化酶的催化下生成甘氨酸以及少量的過氧化氫，在辣根氧化物酶的催化下，過氧化氫催化氧化了 5(6)-羧基-2，7- 二氯二氫熒光素二特戊酸酯并生成具有熒光響應(yīng)的產(chǎn)物，通過監(jiān)測熒光增強的速率以及標準曲線，獲得肌酸酐濃度，其中所述肌酸酐酶:肌酸酶:肌氨酸氧化酶:辣根過氧化物酶:熒光染料的重量比為:1: 50: 60: 5； 所述的肌酸酐含量檢測試劑盒的制備步驟如下: ⑴將176mg纖維素固定的5 (6)-羧基-2，7- 二氯二氫突光素二特戍酸酯和2.6g的4%D4水凝膠溶液混合并攪拌均勻，使纖維素粉末在溶液中均勻分散； ⑵將步驟⑴中所制備的溶液均勻在塑料薄膜上使之形成一層厚度為IOOuM的薄膜并晾干； ⑶將30mg肌酸酶、35mg辣根過氧化物酶、0.63mg肌酸酐酶、2.6mg肌氨酸氧化酶、340mg水和1.33g濃度為10%并含有10%牛血清蛋白的PVA-Sbq溶液混合，并在冰上攪拌均勻；⑷在步驟⑵中制備的薄膜上涂上步驟⑶中所制備的PVA-Sbq/酶溶液，膜層的厚度為100 μ m,將薄膜置于紫外燈下30分鐘； (5)在步驟⑷中所制備的薄膜上涂上一層含有6%炭黑和1.8%D6的溶液并自然風干。
【文檔編號】G01N21/64GK103472041SQ201310360937
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2011年9月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年9月20日
【發(fā)明者】徐維琛, 朱進清, 高玉蘭, 程志敬 申請人:天津希恩思生化科技有限公司