專利名稱：一種血清蛋白濃度測(cè)定熒光傳感器及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于傳感器制備技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種血清蛋白濃度測(cè)定熒光傳感器及其制備方法。
背景技術(shù)：
在生物檢測(cè)領(lǐng)域，血清蛋白含量變化與血液稀釋、營(yíng)養(yǎng)不良、慢性消耗性疾病、肝蛋白合成功能障礙等各種病因引起的蛋白丟失相關(guān)，因此，高效快捷檢測(cè)血清蛋白濃度的手段是生物化學(xué)領(lǐng)域研究的熱門(mén)課題。目前應(yīng)用于蛋白檢測(cè)的常規(guī)方法主要包括以下三種:基于蛋白質(zhì)元素組成特點(diǎn)的凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法、BCA法、膠體金法；基于蛋白質(zhì)化學(xué)顯色反應(yīng)的考馬氏亮藍(lán)法、銀染法；基于蛋白質(zhì)的光吸收特性紫外分光光度法、熒光法。這些常規(guī)方法當(dāng)中，檢測(cè)速度最快的需要5-10分鐘(紫外吸收法)，檢測(cè)靈敏度最高為2μ g(考馬斯亮藍(lán)法)，而且?guī)追N方法對(duì)血清蛋白的檢測(cè)的選擇性均不高。根據(jù)醫(yī)療事業(yè)的發(fā)展需要，更為快速、高效、操作便捷的檢測(cè)蛋白濃度的方法是近年來(lái)醫(yī)療、分析領(lǐng)域研究的方向。熒光傳感器因其靈敏度高、可采集信號(hào)豐富及使用方便等優(yōu)點(diǎn)而倍受關(guān)注，近年來(lái)得到了迅速的發(fā)展。熒光傳感器主要分為兩類，一類是在溶液中使用的均相熒光傳感器，另一類是薄膜熒光傳感器。后者可以重復(fù)使用且能進(jìn)行氣相傳感，因而成為近年來(lái)的研究焦點(diǎn)。雙金屬?gòu)?fù)合氫氧化物又稱為水滑石(LayeredDoubleHydroxides,簡(jiǎn)寫(xiě)為L(zhǎng)DHs),是一種新型多功能無(wú)機(jī)層狀材料，有較強(qiáng)的抗熱性能，且化學(xué)穩(wěn)定性良好，在藥物的緩釋、催化、阻燃、光化學(xué)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。LDHs層板帶有正電荷，可作為超分子組裝的材料，應(yīng)用于熒光傳感器領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用超分子自組裝的方法制備熒光傳感器，并實(shí)現(xiàn)了對(duì)血清蛋白濃度很好的熒光響應(yīng)。本發(fā)明利用水滑石剝層后層板帶正電荷，客體分子赤蘚紅帶有負(fù)電荷，水滑石層板與客體分子赤蘚紅通過(guò)靜電引力層層自組裝形成超分子結(jié)構(gòu)體系后制備成膜，最后考察薄膜傳感器對(duì)不同濃度血清蛋白的快速(10-20s)熒光響應(yīng)。本發(fā)明所述的血清蛋白濃度測(cè)定熒光傳感器的制備方法為:I).制備水滑石前體，所述水滑石前體的化學(xué)式為Mgl_xAlx (OH) 2 (NO3) x.HiH2O，其中
0.2彡X彡0.33，m為結(jié)晶水?dāng)?shù)量，取值范圍為0.5-9 ；2).取步驟I)中制備的水滑石前體0.10-0.13g，加入裝有100_130ml甲酰胺的燒瓶中，在N2保護(hù)下攪拌反應(yīng)40-50h，離心后得到剝層后的水滑石層板膠體溶液；3).配制濃度為lX10-5-3 Xl(T5mol/L的赤蘚紅B鈉鹽的水溶液，用NaOH調(diào)節(jié)pH值為7-7.5后，避光保存在容量瓶中；
4).將石英片用體積比為7:3的濃H2SO4和H2O2的混合溶液清洗，再用乙醇超聲2-4次，每次15-25min，得到表面富含羥基的石英片，然后將其置于步驟2)制備的水滑石層板膠體溶液中浸泡18-22min進(jìn)行預(yù)組裝，取出后用去離子水沖洗并在室溫下吹干；5).將步驟4)得到的石英片放入步驟3)配置的赤蘚紅B鈉鹽的水溶液中浸泡
8-12min，取出后用去離子水清洗并在室溫下吹干；然后置于步驟2)制備的水滑石層板膠體溶液中浸泡8-12min，取出后去離子水清洗并在室溫下吹干；6).重復(fù)步驟5)，25_27次，得到組裝26-28層的復(fù)合薄膜，即為血清蛋白濃度測(cè)定突光傳感器。所述的水滑石前體采用共沉淀法、成核/晶化隔離法、非平衡晶化法、離子交換法或水熱合成法制備。將上述制備的血清蛋白濃度測(cè)定熒光傳感器應(yīng)用于血清蛋白濃度的測(cè)定，檢測(cè)范圍為5-90 μ g/ml,檢測(cè)限為2.51 μ g/ml,檢測(cè)時(shí)間為10_20s ;檢測(cè)完成后,將其靜置在濃度為250-320 μ g/ml的油酸鈉的水溶液中80_100s，實(shí)現(xiàn)血清蛋白濃度測(cè)定熒光傳感器的再生，可重復(fù)用于血清蛋白濃度的檢測(cè)。上述血清蛋白濃度測(cè)定熒光傳感器可重復(fù)使用6-10次。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明所制備的血清蛋白濃度測(cè)定熒光傳感器檢測(cè)范圍為5-90 μ g/ml，檢測(cè)限為2.51 μ g/ml，檢測(cè)時(shí)間為10_20s ;與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，該傳感器在血清物質(zhì)中對(duì)血清蛋白的選擇性高，并在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)出線性關(guān)系，檢測(cè)時(shí)間短，檢測(cè)范圍寬，適用范圍廣，成本低廉，簡(jiǎn)捷實(shí)用，易實(shí)現(xiàn)量產(chǎn)。組成該傳感器的水滑石層板穩(wěn)定、無(wú)毒，生物相容性良好，與聚合物載體相比不易老化，保存時(shí)間長(zhǎng)；而且水滑石層板可以保持客體赤蘚紅分子最大程度的分散，有效阻止因客體分子團(tuán)聚導(dǎo)致的熒光淬滅現(xiàn)象，從而保持赤蘚紅分子的光學(xué)穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，并顯著提高其PH適用范圍；檢測(cè)過(guò)程中該傳感器不污染待測(cè)體系，且無(wú)試劑損耗；檢測(cè)完成后，通過(guò)油酸鈉競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合大分子蛋白，實(shí)現(xiàn)傳感器對(duì)大分子蛋白的解吸附，從而實(shí)現(xiàn)傳感器的再生和重復(fù)使用。


圖1 為實(shí)施例1 中 Mg2Al (OH) 6 (CO3).6H20 水滑石和 Mg2Al (OH) 6 (NO3).6H20 水滑石前體的X射線粉末衍射圖；其中橫坐標(biāo)為2 Θ值，單位:度；縱坐標(biāo)為強(qiáng)度'K為Mg2Al (OH) 6 (CO3).6H20 水滑石，B 為 Mg2Al (OH) 6 (NO3).6H20 水滑石前體。圖2為實(shí)施例1步驟6中得到的復(fù)合薄膜的紫外-可見(jiàn)光吸收?qǐng)D譜；其中橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)，單位:nm，縱坐標(biāo)為吸收強(qiáng)度；內(nèi)部小圖為不同組裝層數(shù)的薄膜在545nm吸收強(qiáng)度值的線性圖，橫坐標(biāo)為復(fù)合薄膜的組裝層數(shù)，縱坐標(biāo)為545nm處的吸收強(qiáng)度。圖3為實(shí)施例1制備的血清蛋白濃度測(cè)定熒光傳感器對(duì)不同濃度的牛血清蛋白溶液熒光響應(yīng)值圖；其中橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)，單位:nm ;縱坐標(biāo)為熒光值；從上至下牛血清蛋白濃度依次為 0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140μ g/ml 的溶液的熒光響應(yīng)值圖。圖4為實(shí)施例1制備的血清蛋白濃度測(cè)定熒光傳感器對(duì)不同濃度的牛血清蛋白溶液熒光響應(yīng)值線性圖；其中橫坐標(biāo)為濃度，單位:μ g/ml,縱坐標(biāo)為熒光值。圖5為實(shí)施例1中吸附有血清蛋白的血清蛋白濃度測(cè)定熒光傳感器在油酸鈉溶液中不同時(shí)間的熒光值；其中橫坐標(biāo)為波長(zhǎng)，單位:nm;縱坐標(biāo)為熒光值，從下至上分別為靜置5s、30s、60s、90s的熒光響應(yīng)曲線。圖6為實(shí)施例1制備的血清蛋白濃度測(cè)定熒光傳感器重復(fù)檢測(cè)牛血清蛋白溶液濃度的熒光值圖，BSA濃度為70 μ g/ml，油酸鈉的水溶液濃度為300 μ g/ml，橫坐標(biāo)為重復(fù)次數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光強(qiáng)度。圖7為實(shí)施例1制備的血清蛋白濃度測(cè)定熒光傳感器對(duì)不同血清物質(zhì)溶液的熒光響應(yīng)相對(duì)變化值的柱狀圖；其中橫坐標(biāo)為溶液類型，從左到右依次為30 μ g/ml的BSA、葡萄糖、鎂離子、半胱氨酸、鈣離子、亮氨酸、銅離子、絲氨酸的溶液；縱坐標(biāo)為熒光響應(yīng)相對(duì)變化值，即變化值與初始熒光值的比值。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例11.制備水滑石前體:稱取 5.128gMg (NO3)2.6Η20、3.7513gAl (NO3)3.9Η20 和 6.006g尿素溶于IOOml去離子水中配制成鹽溶液，然后轉(zhuǎn)入高壓反應(yīng)釜中，110°C反應(yīng)12h，將產(chǎn)物離心、洗滌，得化學(xué)式為Mg2Al(OH)6(CO3).6H20的水滑石；取所得水滑石Ig加入200ml除去CO2的水中，攪拌Ih溶脹，然后加入硝酸鈉溶液攪拌0.5h，所述硝酸鈉溶液為127gNaN03溶于300ml去CO2的水中配制而成；然后用移液槍緩慢加入350 μ I濃硝酸，攪拌48h后，用乙醇離心兩次，得Mg2Al (OH) 6 (NO3).6H20水滑石前體；2.取步驟I中制備的Mg2Al (OH)6(NO3).6H20水滑石前體0.10g，加入裝有IOOml甲酰胺的燒瓶中，在N2保護(hù)下攪拌反應(yīng)40h，離心后得到剝層后的水滑石層板膠體溶液；3.配制濃度為10_5mOl/L的赤蘚紅B鈉鹽的水溶液，用NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.2后，
避光保存在容量瓶中；4.取3cmX Icm大小的石英片，用體積比為7:3的濃H2SO4和H2O2的混合溶液清洗，再用乙醇超聲2次，每次15min，得到表面富含羥基的石英片，然后將其置于步驟2制備的水滑石層板膠體溶液中浸泡ISmin進(jìn)行預(yù)組裝，取出后用去離子水沖洗并在室溫下吹干；5.將步驟4得到的石英片放入步驟3配置的赤蘚紅B鈉鹽的水溶液中浸泡8min，取出后用去離子水清洗并在室溫下吹干；然后置于步驟2制備的水滑石層板膠體溶液中浸泡8min，取出后去離子水清洗并在室溫下吹干；6.重復(fù)步驟5，25次，得到組裝26層的復(fù)合薄膜，即為血清蛋白濃度測(cè)定熒光傳感器。由UV_vis、XRD、熒光譜圖可知，成功組裝成規(guī)則有序的復(fù)合薄膜。血清蛋白濃度測(cè)定熒光傳感器性能測(cè)試:( I)對(duì)不同濃度牛血清蛋白溶液的熒光響應(yīng)值變化:將所制得血清蛋白濃度測(cè)定熒光傳感器置于液體池中，加入1.990ml蛋白緩沖溶液，檢測(cè)其初始熒光值；用微量進(jìn)樣器量取配置好的牛血清蛋白溶液(BSA) 10 μ I使液體池中BSA濃度達(dá)到5 μ g/ml，考察其熒光圖譜變化并記錄；然后依次測(cè)量BSA濃度為10 μ g/ml、20 μ g/ml、30 μ g/ml、40 μ g/ml、50 μ g/ml、60 μ g/ml、70 μ g/ml、80 μ g/ml、90 μ g/ml、100 μ g/ml、110 μ g/ml、120 μ g/ml、130 μ g/ml、140 μ g/ml 的溶液,考察其突光圖譜變化并記錄。由熒光圖譜可以看出，加入牛血清蛋白后，熒光值明顯減弱，并在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)出線性關(guān)系。(2)對(duì)不同血漿物質(zhì)的溶液的熒光值響應(yīng)值變化:將所制得血清蛋白濃度測(cè)定熒光傳感器置于液體池中，加入1.990ml去離子水溶液，檢測(cè)其初始熒光值。用微量進(jìn)樣器量取配置好的牛血清蛋白溶液10μ I使液體池中血清蛋白濃度達(dá)到30μ g/ml，考察其熒光圖譜變化并記錄。重復(fù)上述步驟，分別測(cè)量30 μ g/ml的葡萄糖、鎂離子、半胱氨酸、鈣離子、亮氨酸、銅離子和絲氨酸的溶液，考察其熒光圖譜變化并記錄。通過(guò)熒光圖譜的變化可以看出，該血清蛋白濃度測(cè)定熒光傳感器對(duì)牛血清蛋白有很好的選擇性，并在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)出線性關(guān)系。(3)傳感器的再生和重復(fù)使用:血清蛋白濃度測(cè)定熒光傳感器在檢測(cè)過(guò)牛血清蛋白溶液后，會(huì)導(dǎo)致薄膜表面吸附上大分子蛋白(吸附的BSA濃度為90 μ g/ml)，將其靜置在油酸鈉的水溶液(300 μ g/ml)中，考察其熒光信號(hào)隨浸泡時(shí)間的變化，由圖4可以看出，隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)(5s到90s)，薄膜的熒光信號(hào)增強(qiáng)，90s后恢復(fù)，表明吸附上BSA分子的薄膜在油酸鈉的水溶液中發(fā)生了解吸附，即油酸鈉分子在與傳感器薄膜競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合BSA的過(guò)程中占優(yōu)勢(shì)，因此使用油酸鈉實(shí)現(xiàn)了薄膜檢測(cè)血清蛋白濃度的再生。將上述再生的血清蛋白濃度測(cè)定熒光傳感器檢測(cè)BSA (70 μ g/ml)溶液濃度，其熒光值依然有明顯下降，且與第一次測(cè)量后熒光值相近，如此可循環(huán)使用6-7次。實(shí)施例21.同實(shí)施案例I ;2.取步驟I中制備的Mg2Al (OH)6(NO3).6H20水滑石前體0.llg，加入裝有IlOml甲酰胺的燒瓶中，在N2保護(hù)下攪拌反應(yīng)45h，離心后得到剝層后的水滑石層板膠體溶液；3.配制濃度為2 X 10_5mol/L的赤蘚紅B鈉鹽的水溶液，用NaOH調(diào)節(jié)pH值為7.5后，避光保存在各量瓶中；4.取3cmX Icm大小的石英片，用體積比為7:3的濃H2SO4和H2O2的混合溶液清洗，再用乙醇超聲3次，每次20min，得到表面富含羥基的石英片，然后將其置于步驟2制備的水滑石層板膠體溶液中浸泡20min進(jìn)行預(yù)組裝，取出后用去離子水沖洗并在室溫下吹干；5.將步驟4得到的石英片放入步驟3配置的赤蘚紅B鈉鹽的水溶液中浸泡lOmin，取出后用去離子水清洗并在室溫下吹干；然后置于步驟2制備的水滑石層板膠體溶液中浸泡lOmin，取出后去離子水清洗并在室溫下吹干；6.重復(fù)步驟5，26次，得到組裝27層的復(fù)合薄膜，即為血清蛋白濃度測(cè)定熒光傳感器。實(shí)施例31.同實(shí)施案例I ;2.取步驟I中制備的Mg2Al (OH)6(NO3).6H20水滑石前體0.13g，加入裝有130ml甲酰胺的燒瓶中，在N2保護(hù)下攪拌反應(yīng)50h，離心后得到剝層后的水滑石層板膠體溶液；3.配制濃度為3 X 10_5mOl/L的赤蘚紅B鈉鹽的水溶液，用NaOH調(diào)節(jié)pH值為7后，避光保存在容量瓶中；4.取3cmX Icm大小的石英片，用體積比為7:3的濃H2SO4和H2O2的混合溶液清洗，再用乙醇超聲4次，每次25min，得到表面富含羥基的石英片，然后將其置于步驟2制備的水滑石層板膠體溶液中浸泡22min進(jìn)行預(yù)組裝，取出后用去離子水沖洗并在室溫下吹干；5.將步驟4得到的石英片放入步驟3配置的赤蘚紅B鈉鹽的水溶液中浸泡12min，取出后用去離子水清洗并在室溫下吹干；然后置于步驟2制備的水滑石層板膠體溶液中浸泡12min，取出后去離子水清洗并在室溫下吹干；6.重復(fù)步驟5，27次，得到組裝28層的復(fù)合薄膜，即為血清蛋白濃度測(cè)定熒光傳感器。
權(quán)利要求
1.一種血清蛋白濃度測(cè)定熒光傳感器的制備方法，其特征在于，其具體制備步驟為: 1).制備水滑石前體，所述水滑石前體的化學(xué)式為MghAlx(OH) 2 (NO3) x.mH20,其中0.2彡X彡0.33，m為結(jié)晶水?dāng)?shù)量，取值范圍為0.5-9 ； 2).取步驟I)中制備的水滑石前體0.10-0.13g，加入裝有100-130ml甲酰胺的燒瓶中，在N2保護(hù)下攪拌反應(yīng)40-50h，離心后得到剝層后的水滑石層板膠體溶液； 3).配制濃度為IX 10_5-3 X 10_5mOl/L的赤蘚紅B鈉鹽的水溶液，用NaOH調(diào)節(jié)pH值為7-7.5后，避光保存在容量瓶中； 4).將石英片用體積比為7:3的濃H2SO4和H2O2的混合溶液清洗，再用乙醇超聲2-4次，每次15-25min，得到表面富含羥基的石英片，然后將其置于步驟2)制備的水滑石層板膠體溶液中浸泡18-22min進(jìn)行預(yù)組裝，取出后用去離子水沖洗并在室溫下吹干； 5).將步驟4)得到的石英片放入步驟3)配置的赤蘚紅B鈉鹽的水溶液中浸泡8-12min，取出后用去離子水清洗并在室溫下吹干；然后置于步驟2)制備的水滑石層板膠體溶液中浸泡8-12min，取出后去離子水清洗并在室溫下吹干； 6).重復(fù)步驟5)，25-27次，得到組裝26-28層的復(fù)合薄膜，即為血清蛋白濃度測(cè)定熒光傳感器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的水滑石前體采用共沉淀法、成核/晶化隔離法、非平衡晶化法、離子交換法或水熱合成法制備。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備方法制備得到的血清蛋白濃度測(cè)定熒光傳感器測(cè)定血清蛋白濃度的應(yīng)用，其特征在于，該血清蛋白濃度測(cè)定熒光傳感器的檢測(cè)范圍為5-90 μ g/ml,檢測(cè)限為2.51 `μ g/ml,檢測(cè)時(shí)間為10_20s ;檢測(cè)完成后，將其靜置在濃度為250-320 μ g/ml的油酸鈉的水溶液中80_100s，實(shí)現(xiàn)血清蛋白濃度測(cè)定熒光傳感器的再生，可重復(fù)用于血清蛋白濃度的檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明屬于傳感器制備技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種血清蛋白濃度測(cè)定熒光傳感器及其制備方法。本發(fā)明采用超分子層層組裝的方法，利用靜電引力將帶正電的納米水滑石層板和帶負(fù)電的赤蘚紅客體分子復(fù)合成為薄膜，將其用于血清蛋白濃度測(cè)定，其檢測(cè)范圍為5-90μg/ml，檢測(cè)限為2.51μg/ml，檢測(cè)時(shí)間為10-20s。與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，本發(fā)明制備的傳感器在血清物質(zhì)中對(duì)血清蛋白的選擇性高，并在一定范圍內(nèi)呈現(xiàn)出線性關(guān)系，檢測(cè)時(shí)間短，檢測(cè)范圍寬，適用范圍廣，成本低廉，簡(jiǎn)捷實(shí)用，易實(shí)現(xiàn)量產(chǎn)。檢測(cè)過(guò)程中該傳感器不污染待測(cè)體系，且無(wú)試劑損耗；檢測(cè)完成后，通過(guò)油酸鈉競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合大分子蛋白，實(shí)現(xiàn)傳感器對(duì)大分子蛋白的解吸附，從而實(shí)現(xiàn)傳感器的再生和重復(fù)使用。
文檔編號(hào)G01N21/64GK103163114SQ20131010140
公開(kāi)日2013年6月19日 申請(qǐng)日期2013年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月27日
發(fā)明者靳蘭, 王騰利, 衛(wèi)敏 申請(qǐng)人:北京化工大學(xué)