專利名稱：利用血紅素辣根過氧化物酶催化比色檢測三價(jià)砷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種水體安全檢測技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種利用氯化血紅素辣根過氧化物酶的活性，并通過紫外-可見吸收光譜檢測三價(jià)砷的方法。
背景技術(shù)：
無機(jī)砷化合物是公認(rèn)的人類致癌物，廣泛分布于土壤、巖石和水體中，而水體中的砷化物極易通過消化道進(jìn)入人體內(nèi)。水砷中毒重災(zāi)區(qū)主要分布在中國、印度、孟加拉和越南部分地區(qū)，而我國是世界上砷中毒病類型最全和中毒危害最嚴(yán)重的國家之一，所以對水體中的砷進(jìn)行快速和準(zhǔn)確檢測是杜絕這類危害的有效手段之一。水體中的無機(jī)砷尤其以三價(jià)砷的毒性最高，是其它砷化合物毒性的60倍，所以開展三價(jià)砷的檢測具有更重要的意義。目前測定砷的通用方法主要有原子熒光光譜法、銀鹽法、砷斑法、硼氫化物還原比色法(新銀鹽法)四種。銀鹽法或新銀鹽法存在靈敏度不夠高，操作比較繁瑣，試劑消耗大等缺點(diǎn)。砷斑法為半定量方法，已不適于現(xiàn)代發(fā)展的需要。原子熒光法也存在熒光轉(zhuǎn)換效率低、散射光干擾的缺陷，同時(shí)需要價(jià)格昂貴的儀器。核酸適配體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)體外進(jìn)化(SELEX)技術(shù)，從大量寡聚核苷酸庫中篩選出對靶物質(zhì)具有高特異性和高結(jié)核性的核酸片段。但與蛋白質(zhì)類抗體和生物酶相t匕，核酸適配體具有更高的親和力、穩(wěn)定性和特異性，且易于標(biāo)記設(shè)計(jì)出傳感器，已經(jīng)用于核酸、蛋白、無機(jī)金屬離子及病毒顆粒和細(xì)胞的檢測。雖然Kim等人通過SELEX技術(shù)篩選到無機(jī)砷的核酸適配體，但由于其序列較長，不適宜進(jìn)行修飾，盡管適配體檢測傳感器的信號(hào)輸出方法有熒光比色等多種方式，但通過氯化血紅素過氧化物催化比色用于檢測還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提出一種利用血紅素辣根過氧化物酶催化比色檢測三價(jià)砷的方法，能夠克服長鏈核酸適配體難于標(biāo)記等缺陷，提供一種靈敏度高、選擇性好、成本低。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:本發(fā)明涉及一種三價(jià)砷光敏性的實(shí)現(xiàn)方法，通過將三價(jià)砷依次與砷核酸適配體母液和氯化血紅素混合，然后加入H2O2溶液和3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液進(jìn)行反應(yīng)生成聯(lián)苯醌，實(shí)現(xiàn)聯(lián)苯醌在442nm波長處的吸光度的變化量與三價(jià)砷濃度呈正向關(guān)系。所述的反應(yīng)中，三價(jià)砷含量維持在IO-1OOppb ;其中:IO-1OOppb是指終濃度，也就是直到進(jìn)行吸光度檢測時(shí)三價(jià)砷的濃度。所述的砷核酸適配體母液中的砷核酸適配體序列為:5，-GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATTTTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTCATCGAGATAGTAAGTGCAATCT-3’ ；其濃度為 500 μ M。所述的H2O2溶液的濃度為200mM ;所述的3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺的濃度為5mM。
本發(fā)明涉及一種利用血紅素辣根過氧化物酶催化比色檢測三價(jià)砷的方法，通過構(gòu)建含有已知三價(jià)砷濃度的檢測體系后，采用多功能酶標(biāo)儀計(jì)進(jìn)行吸收光譜掃描得到吸光度變化量標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將待測對象與超純水，即對照樣分別和氯化血紅素混合后加入三價(jià)砷溶液，然后通過加入H2O2溶液和3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液進(jìn)行反應(yīng)，最后對兩個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物在442nm波長處的吸光度的差值對照吸光度變化量標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測對象中的三價(jià)砷濃度。所述的檢測體系通過以下步驟制備得到:I)制備已知濃度的三價(jià)砷檢測體系:取5支包含5 μ L濃度為500 μ M三價(jià)砷核酸適配體和5 μ L不同濃度三價(jià)砷標(biāo)準(zhǔn)液的離心管，使得整個(gè)檢測體系中的三價(jià)砷含量維持在IO-1OOppb，在25°C條件下孵育30分鐘；然后分別加入100 μ L氯化血紅素并置于25°C條件下孵育IOmin ;在上述混合液中加入100 μ L200mM H2O2溶液和50 μ L 5mM3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺溶液充分混勻后再將離心管置于25°C條件下孵育15min作為標(biāo)準(zhǔn)溶液留作以下測定用。2)取一支離心管將三價(jià)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液用5 μ L超純水替代，其他按步驟I處理后作為空白對照體系溶液。所述的吸光度變化量標(biāo)準(zhǔn)曲線是指:采用多功能酶標(biāo)儀計(jì)進(jìn)行吸收光譜掃描得到442nm處的吸光度，將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白對照體系溶液的吸光度差值作為縱坐標(biāo)，三價(jià)砷混合液的濃度作為橫坐標(biāo)得到的回歸方程，即標(biāo)準(zhǔn)曲線。所述的掃描進(jìn)一步優(yōu)選為采用96孔酶標(biāo)板盛放檢測體系，吸光度測定波長為442nm的吸光度，全波長掃描范圍為400_800nm。本發(fā)明的原理在于:利用氯化血紅素(Hemin)具有過氧化氫酶的活性，在H2O2的存在下，Hemin可以催化3，3’，5，5’_四甲基聯(lián)苯胺(TMB)形成藍(lán)色陽離子根，最終生成黃色的聯(lián)苯醌。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，核酸適配體(aptamer)加入后,aptamer可以和Hemin通過j1- Ji堆積相互作用，抑制Hemin的催化活性，底物被催化后，停留在中間產(chǎn)物階段，呈藍(lán)色；但當(dāng)溶液中加入As (III)時(shí),As (III)可以特異性與aptamer結(jié)合形成復(fù)合結(jié)構(gòu),從而使Hemin釋放到溶液中，恢復(fù)了 Hemin的催化活性，進(jìn)一步催化TMB變?yōu)辄S色終產(chǎn)物，隨著As (III)的加入量的增多，溶液逐漸由藍(lán)色變?yōu)辄S色。體系在442nm處的紫外-可見吸光度與As(III)的加入量成正向關(guān)系，所以通過溶液顏色的變化，就可以實(shí)現(xiàn)水體中As(III)的檢測。
技術(shù)效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的檢測方法不需要大型儀器設(shè)備，檢測靈敏度高，選擇性好，操作簡單，可用于檢測飲用水中的三價(jià)砷含量是否超標(biāo)。


圖1為本方法示意圖。圖2為實(shí)施例中不同As(III)濃度下紫外-可見吸收光譜示意圖。圖3為實(shí)施例中不同As(III)濃度下吸光度變化曲線及溶液顏色變化示意圖。圖4為實(shí)施例中不同金屬離子加入檢測溶液后的吸光度信號(hào)變化量示意圖。
具體實(shí)施方式
下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1如圖1所示，本實(shí)施例包括以下步驟:I)制備已知三價(jià)砷濃度的檢測體系:取5支2mL刻度離心管，分別加入5 μ L濃度為500 μ M砷核酸適配體母液(砷核酸適配體序列為:5’ -GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATTTTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTCATCGAGATAGTAAGTGCAATCT-3’ )和5μ L不同濃度三價(jià)砷標(biāo)準(zhǔn)液，使得整個(gè)檢測體系中的三價(jià)砷含量維持在lO-lOOppb，充分混勻后將離心管置于25°C條件下孵育30min。將100 μ L Hemin加入到上述溶液中，置于25°C條件下孵育lOmin。隨后補(bǔ)加去離子水至350 μ L。最后,加入100 μ L200mM H2O2溶液和50 μ L5mM TMB溶液充分混勻后再將離心管置于25°C條件下孵育15min，留作以下測定用。2)另取I支按步驟I方法制備的檢測溶液，加入5 μ L超純水替代三價(jià)砷標(biāo)準(zhǔn)液，處理后作為空白對照體系溶液。3)分別取200 μ L步驟I和步驟2制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白對照液置于96孔酶標(biāo)板中，用多功能酶標(biāo)儀計(jì)進(jìn)行掃描測定信號(hào)。具體的掃描條件為:吸光度測定波長為442nm的吸光度，全波長掃描范圍為400-800nm，獲得其吸收光譜。三價(jià)砷和空白對照液的在442nm處吸光度分別為A和Atl,計(jì)算Λ A = k-k0。4)以不同濃度三價(jià)砷(Cas)與對應(yīng)的吸光度變化量ΛΑ作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為 y = 0.0016X+0.11643。5)制備樣品檢測體系:取5 μ L待測水樣，按步驟I方法制備的檢測溶液，充分混勻后取200 μ L置于96孔酶標(biāo)板中，按步驟3方法測定其吸光度變化量Λ Α。6)根據(jù)樣品測得的ΛΑ，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以求得樣品中三價(jià)砷含量。7)驗(yàn)證:用本方法測定4份含三價(jià)砷濃度分別為50ppb、200ppb、400ppb和600ppb的多離子混合液各一份，得到的回收率為93.5% -113%，證明了本方法的可靠性。8)本方法測定水體三價(jià)砷的濃度范圍為IO-1OOppb,最低檢測限為Ippb,即在低濃度10到IOOppb的范圍內(nèi)，As(III)濃度和吸光度呈良好的線性關(guān)系，擬合方程為y =
0.0016X+0.11643 (R2 = 0.99)，通過3 σ /k計(jì)算檢出限為lppb，其中:σ代表6次空白樣品溶液標(biāo)準(zhǔn)偏差、k代表直線擬合斜率。
權(quán)利要求
1.一種三價(jià)砷光敏性的實(shí)現(xiàn)方法，其特征在于，通過將三價(jià)砷依次與砷核酸適配體母液和氯化血紅素混合，然后加入H2O2溶液和3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺溶液進(jìn)行反應(yīng)生成聯(lián)苯醌，實(shí)現(xiàn)聯(lián)苯醌在442nm波長處的吸光度的變化量與三價(jià)砷濃度呈正向關(guān)系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的反應(yīng)中，三價(jià)砷含量維持在IO-1OOppbo
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的砷核酸適配體母液中的砷核酸適配體序列為:5’ -GGTAATACGACTCACTATAGGGAGATACCAGCTTATTCAATTTTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTCATCGAGATA GTAAGTGCAATCT-3’ ；其濃度為 500 μ M。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的H2O2溶液的濃度為200mM;所述的3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺的濃度為5mM。
5.一種利用血紅素辣根過氧化物酶催化比色檢測三價(jià)砷的方法，其特征在于，通過構(gòu)建含有已知三價(jià)砷濃度的檢測體系后，采用多功能酶標(biāo)儀計(jì)進(jìn)行吸收光譜掃描得到吸光度變化量標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將待測對象與超純水，即對照樣分別和氯化血紅素混合后加入三價(jià)砷溶液，然后通過加入H2O2溶液和3，3’，5，5’ -四甲基聯(lián)苯胺溶液進(jìn)行反應(yīng)，最后對兩個(gè)反應(yīng)產(chǎn)物在442nm波長處的吸光度的差值對照吸光度變化量標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測對象中的三價(jià)砷濃度。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征是，所述的檢測體系通過以下步驟制備得到: 1)制備已知濃度的三價(jià)砷檢測體系:取5支包含5μL濃度為500 μ M三價(jià)砷核酸適配體和5 μ L不同濃度三價(jià)砷標(biāo)準(zhǔn)液的離心管，使得整個(gè)檢測體系中的三價(jià)砷含量維持在IO-1OOppb，在25°C條件下孵育30分鐘；然后分別加入100 μ L氯化血紅素并置于25°C條件下孵育IOmin ;在上述混合液中加入100μ L200mM H2O2溶液和50 μ L5mM3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺溶液充分混勻后再將離心管置于25°C條件下孵育15min作為標(biāo)準(zhǔn)溶液留作以下測定用； 2)取一支離心管將三價(jià)砷標(biāo)準(zhǔn)溶液用5μ L超純水替代，其他按步驟I處理后作為空白對照體系溶液。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是，所述的吸光度變化量標(biāo)準(zhǔn)曲線是指:采用多功能酶標(biāo)儀計(jì)進(jìn)行吸收光譜掃描得到442nm處的吸光度，將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白對照體系溶液的吸光度差值作為縱坐標(biāo)，三價(jià)砷混合液的濃度作為橫坐標(biāo)得到的回歸方程，即標(biāo)準(zhǔn)曲線。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征是，所述的掃描為采用96孔酶標(biāo)板盛放檢測體系，吸光度測定波長為442nm的吸光度，全波長掃描范圍為400_800nm。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征是，所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y= 0.0016X+0.11643。
全文摘要
一種利用血紅素過氧化物酶催化活性，通過比色法檢測水體三價(jià)砷的方法，氯化血紅素具有辣根過氧化物酶的活性，在過氧化氫的存在下可以催化顯色底物3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)發(fā)生氧化還原反應(yīng)，使溶液發(fā)生肉眼可變的顏色變化，核酸適配體的加入可以抑制催化活性，當(dāng)向溶液中加入三價(jià)砷后，催化活性得到恢復(fù)，導(dǎo)致整個(gè)體系的顏色發(fā)生顯著變化，且在442nm處的吸光度與三價(jià)砷濃度呈現(xiàn)正向關(guān)系，因而該方法可用于水體三價(jià)砷的檢測。本方法提供的檢測方法靈敏度高選擇性好，最低檢測限為1ppb，操作簡便且不需要依賴大型儀器設(shè)備，可用于飲用水三價(jià)砷檢測。
文檔編號(hào)G01N21/33GK103163127SQ201310072069
公開日2013年6月19日 申請日期2013年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月6日
發(fā)明者周培, 吳遠(yuǎn)根, 王法澤, 詹深山, 劉樂, 徐魯榮 申請人:上海交通大學(xué)