專利名稱：基于納米金催化的共振散射光譜四環(huán)素檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種食品安全技術(shù)領(lǐng)域的方法，具體是一種利用被適配體包裹的納米金催化產(chǎn)生氧化亞銅增強(qiáng)共振散射光譜檢測(cè)牛奶中四環(huán)素濃度范圍為0.0095 -2.5 μ mol/L,最低檢測(cè)限為9.5nmol/L的四環(huán)素的方法。
背景技術(shù)：
四環(huán)素是一種常見(jiàn)的抗生素類藥物，但是隨著使用量的增加，其在動(dòng)物性食品和環(huán)境中的殘留問(wèn)題引起了廣泛的關(guān)注。環(huán)境中的四環(huán)素殘留可以增強(qiáng)微生物耐藥性甚至超級(jí)細(xì)菌的滋生，還可通過(guò)食物鏈在動(dòng)植物中富積；動(dòng)物性食品中四環(huán)素的殘留危害表現(xiàn)為慢性毒性危害，但是長(zhǎng)時(shí)間的攝取可能會(huì)導(dǎo)致各種器官的病變甚至某些過(guò)敏體質(zhì)會(huì)因此而產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)。所以，建立高靈敏度、高選擇性的四環(huán)素檢測(cè)方法顯得尤為重要。傳統(tǒng)的四環(huán)素檢測(cè)方法有儀器分析法如高效液相色譜、毛細(xì)管電泳、氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等；免疫分析法如酶聯(lián)免疫等；微生物抑制法等等。其中儀器分析方法雖然準(zhǔn)確可靠，但是實(shí)際應(yīng)用中需要昂貴精密的儀器以及專業(yè)的技術(shù)操作人員，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以滿足大規(guī)模應(yīng)用及實(shí)時(shí)原位檢測(cè)的需求。免疫分析方法和微生物抑制法雖然成本廉價(jià)但是卻容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，結(jié)果不可靠。最近研究發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素可以與特定核酸適配體(DNA序列)特異性結(jié)合。其相互間的高親和性可以使其形成穩(wěn)定的適配體-四環(huán)素復(fù)合物。同時(shí)，許多文獻(xiàn)報(bào)道DNA容易覆蓋在納米金表現(xiàn)，使納米金形成穩(wěn)定的分散體系，被DNA覆蓋后的納米金仍具有很強(qiáng)的催化活性；而裸露的納米金在高濃度NaCl的作用下會(huì)聚集，聚集后的納米金催化活性很低可以忽略。這為利用四環(huán)素適配體和納米金檢測(cè)四環(huán)素提供了理論依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提出一種基于納米金催化的共振散射光譜四環(huán)素檢測(cè)方法，克服核酸適配體需要修飾及檢測(cè)線不理想等缺陷，提供一種靈敏、選擇性好、成本低且高效的四環(huán)素檢測(cè)方法。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:本發(fā)明涉及一種四環(huán)素光敏性的實(shí)現(xiàn)方法，通過(guò)將四環(huán)素適配體和納米金混合后加入四環(huán)素溶液,然后通過(guò)加入氯化鈉溶液進(jìn)行聚集反應(yīng),最后與含有硫酸銅、氫氧化鈉和酒石酸鉀鈉的溶液混合，使得混合后得到的產(chǎn)物在620nm波長(zhǎng)處的共振散射信號(hào)的變化量與四環(huán)素濃度呈反比例關(guān)系。上述加入四環(huán)素溶液后混合液中四環(huán)素的濃度范圍為:0.0095 - 2.5 μ mol/L ；所述的四環(huán)素適配體溶液通過(guò)以下方式制備得到:將定制合成好的含有
1.29nmol四環(huán)素適配體的離心管在10000轉(zhuǎn)每分鐘的離心機(jī)下離心2分鐘，然后向離心管中加入258 μ L超純水溶解混合均勻，制成5 μ mol/L的四環(huán)素適配體，置于4° C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 所述的納米金溶液是指:向IOOmL沸騰的0.01wt%的氯金酸中加入3.5mLl.0%的檸檬酸酸三鈉溶液，加熱煮沸攪拌30分鐘，溶液顏色由灰色變?yōu)榱良t色，停止加熱并繼續(xù)攪拌至冷卻，然后用0.2μπι超濾膜過(guò)濾。所得溶液即為納米粒徑為15nm的納米金，并置于4° C冰箱保存?zhèn)溆?。所述的氯化鈉溶液為500mmol/L，檢測(cè)時(shí)體系添加7 μ L。所述的硫酸銅為0.028mol/L,檢測(cè)時(shí)體系添加10 μ L ;氫氧化鈉為6.25mol/L檢測(cè)時(shí)體系添加100 μ L ;酒石酸鉀鈉為1.23mol/L，檢測(cè)時(shí)體系添加200 μ L ;葡萄糖為IOmg/mL,檢測(cè)時(shí)體系添加50 μ L0本發(fā)明涉及一種基于納米金催化的共振散射光譜四環(huán)素檢測(cè)方法，通過(guò)構(gòu)建含有已知四環(huán)素濃度的檢測(cè)體系后，熒光光度計(jì)進(jìn)行共振散射光譜信號(hào)掃描得到共振散射信號(hào)變化量標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將待測(cè)對(duì)象與超純水，即對(duì)照樣分別加入含有四環(huán)素適配體和納米金的混合液，并通過(guò)加入氯化鈉溶液進(jìn)行聚集反應(yīng)，最后與含有硫酸銅、氫氧化鈉和酒石酸鉀鈉的溶液混合，最后經(jīng)熒光光度計(jì)進(jìn)行共振散射光譜信號(hào)掃描得到共振散射信號(hào)變化量標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)對(duì)象中的四環(huán)素濃度。所述的檢測(cè)體系通過(guò)以下步驟制備得到:I)制備已知濃度的四環(huán)素檢測(cè)體系:取11支包含四環(huán)素核酸適配體與納米金混合液的離心管，在25°C條件下孵育15分鐘；然后分別加入5μ L不同濃度四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)液，使得整個(gè)檢測(cè)體系中的四環(huán)素含量維持在0.0095-2.5 μ mol/L，充分混勻后再將離心管置于25° C條件下孵育15min ;在上述混合液中加入7 μ L 500mmol/L NaCl溶液充分混合均勻并定容至500 μ L，留作以下測(cè)定用。2)取一支離心管將四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液用5 μ L超純水替代，其他按步驟I處理后作為空白對(duì)照體系溶液。3)制備菲林試劑-葡萄糖還原體系:取11支試管，在每支試管中加入IOyL0.028mo VLCuSO4，100 μ L6.25mol/L NaOH, 200 μ L 1.23mol/L KNaC4H4O6 混合均勻，取 50 μ L10mg/mL葡萄糖加入以上試管中混合均勻；分別將步驟I和步驟2中的標(biāo)準(zhǔn)溶液體系和空白體系轉(zhuǎn)移到以上11支試管中，混合均勻后定容到1000 μ L，置于60°C恒溫孵育器里孵育6分鐘。取出后用自來(lái)水冷卻至室溫待用。所述的共振散射信號(hào)變化量標(biāo)準(zhǔn)曲線是指:用熒光光度計(jì)對(duì)檢測(cè)體系以620nm條件下同步掃描獲得其共振散射信號(hào)光譜，將不同濃度的四環(huán)素混合液和空白對(duì)照液的共振散射光譜信號(hào)差值作為縱坐標(biāo)，四環(huán)素混合液的濃度作為橫坐標(biāo)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。所述的同步掃描進(jìn)一步優(yōu)選為采用石英熒光用比色皿盛放檢測(cè)體系，用熒光光度計(jì)以激發(fā)光狹縫為5nm，發(fā)射光狹縫為2.5nm，激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)均為620nm條件下同步掃描。本發(fā)明的原理在于:被四環(huán)素適配體(ssDNA)覆蓋的納米金能均勻分散在溶液中，并具有很強(qiáng)的催化活性；但是當(dāng)靶物質(zhì)四環(huán)素加入后，適配體由于與四環(huán)素具有更強(qiáng)親和性而使納米金裸露，形成單個(gè)納米金顆粒，裸露的納米金顆粒在高濃度NaCl存在時(shí)發(fā)生聚集；菲林試劑與葡萄糖還原反應(yīng)在60°C時(shí)很能進(jìn)行，而當(dāng)加入被四環(huán)素覆蓋的納米金后，該反應(yīng)能迅速形成Cu2O沉淀，該產(chǎn)物能使共振散射信號(hào)在620nm處發(fā)生顯著變化，且共振散射信號(hào)變化與四環(huán)素濃度呈現(xiàn)反向關(guān)系，所以通過(guò)分析共振散射信號(hào)變化，就可以實(shí)現(xiàn)樣品中四環(huán)素的檢測(cè)。
技術(shù)效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法不需要大型儀器設(shè)備，檢測(cè)靈敏度高，選擇性好，操作簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉，可用于檢測(cè)牛奶中的四環(huán)素含量是否超標(biāo)。


圖1為本發(fā)明檢測(cè)示意圖。圖2為不同濃度四環(huán)素加入溶液后形成的共振散射光譜圖。圖3為檢測(cè)體系的共振散射信號(hào)變化與不同濃度四環(huán)素關(guān)系。圖4為不同其他物質(zhì)加入該檢測(cè)體系后的共振散射信號(hào)變化量。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
實(shí)施例1如圖1所示，本實(shí)施例包括以下步驟:I)制備已知濃度的四環(huán)素檢測(cè)體系:取11支包含四環(huán)素核酸適配體與納米金混合液的離心管，在25°C條件下孵育15分鐘；然后分別加入5 μ L不同濃度四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)液，使得整個(gè)檢測(cè)體系中的四環(huán)素含量維持在0.0095-2.5 μ mol/L，充分混勻后再將離心管置于
25。C條件下孵育15min ;在上述混合液中加入7 μ L500mmol/L NaCl溶液充分混合均勻并定容至500 μ L,留作以下測(cè)定用。2)取一支離心管將四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液用5 μ L超純水替代，其他按步驟I處理后作為空白對(duì)照體系溶液。3)制備菲林試劑-葡萄糖還原體系:取11支試管，在每支試管中加入IOyL
0.028mol/LCuS04,100 μ L 6.25mol/L NaOH, 200 μ L 1.23mol/L KNaC4H4O6 混合均勻，取50 μ L 10mg/mL葡萄糖加入以上試管中混合均勻；分別將步驟I和步驟2中的標(biāo)準(zhǔn)溶液體系和空白體系轉(zhuǎn)移到以上11支試管中，混合均勻后定容到100(^1^，置于601:恒溫孵育器里孵育6分鐘。取出后用自來(lái)水冷卻至室溫待用。4)共振散射值測(cè)定:分別取500 μ L步驟3)制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白對(duì)照液，置于石英突光用比色皿(內(nèi)徑為0.5cmX0.5cm,外徑為1.0cmX 1.0cm)中,用突光光度計(jì)進(jìn)行掃描測(cè)定信號(hào)。具體的掃描條件為:激發(fā)光狹縫為5nm，發(fā)射光狹縫為2.5nm，激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)均為620nm條件下同步掃描，獲得其共振散射信號(hào)光譜。四環(huán)素和空白對(duì)照液的共振散射光譜信號(hào)分別為I和Itl,計(jì)算Λ I=1-1c^5)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:以不同濃度四環(huán)素與對(duì)應(yīng)的共振散射信號(hào)變化量作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為:Λ I620nm=L 7986Ctet+99.575。6)制備樣品檢測(cè)體系:取5 μ L待測(cè)溶液，按步驟1-3制樣，按步驟4)方法測(cè)定其Al。7)根據(jù)樣品測(cè)得的Λ I，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以求得樣品中四環(huán)素含量。
8)驗(yàn)證:用本方法測(cè)定3份含四環(huán)素濃度分別為20nmol/L、50nmol/L和IOOnmol/L的純凈牛奶樣品各一份，得到的回收率為105%-107%，證明了本方法的可靠性。9)本方法測(cè)定牛奶中四環(huán)素的濃度范圍為0.0095 - 2.5 μ mol/L,最低檢測(cè)限為9.5nmol/L。
權(quán)利要求
1.一種四環(huán)素光敏性的實(shí)現(xiàn)方法，其特征在于，通過(guò)將四環(huán)素適配體和納米金混合后加入四環(huán)素溶液,然后通過(guò)加入氯化鈉溶液進(jìn)行聚集反應(yīng),最后與含有硫酸銅、氫氧化鈉和酒石酸鉀鈉的溶液混合，使得混合后得到的產(chǎn)物在620nm波長(zhǎng)處的共振散射信號(hào)的變化量與四環(huán)素濃度呈反比例關(guān)系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，去特征是，加入四環(huán)素溶液后混合液中四環(huán)素的濃度范圍為:0.0095 - 2.5 μ mol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，去特征是，所述的四環(huán)素適配體溶液通過(guò)以下方式制備得到:將定制合成好的含有1.29nmol四環(huán)素適配體的離心管在10000轉(zhuǎn)每分鐘的離心機(jī)下離心2分鐘，然后向離心管中加入258 μ L超純水溶解混合均勻，制成5 μ mol/L的四環(huán)素適配體，置于4° C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，去特征是，所述的納米金溶液是指:向IOOmL沸騰的0.01wt%的氯金酸中加入3.5mLl.0%的檸檬酸酸三鈉溶液，加熱煮沸攪拌30分鐘，溶液顏色由灰色變?yōu)榱良t色，停止加熱并繼續(xù)攪拌至冷卻，然后用0.2 μ m超濾膜過(guò)濾，所得溶液即為納米粒徑為15nm的納米金，并置于4° C冰箱保存?zhèn)溆谩?br> 5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，去特征是，所述的氯化鈉溶液為500mmol/L，檢測(cè)時(shí)體系添加7 μ L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，去特征是，所述的硫酸銅為0.028mol/L，檢測(cè)時(shí)體系添加10 μ L ;氫氧化鈉為6.25mol/L檢測(cè)時(shí)體系添加100 μ L ;酒石酸鉀鈉為1.23mol/L,檢測(cè)時(shí)體系添加200 μ L ;葡萄糖為10mg/mL，檢測(cè)時(shí)體系添加50 μ L。
7.一種基于納米金催化的共振散射光譜四環(huán)素檢測(cè)方法，其特征在于，通過(guò)構(gòu)建含有已知四環(huán)素濃度的檢測(cè)體系后，熒光光度計(jì)進(jìn)行共振散射光譜信號(hào)掃描得到共振散射信號(hào)變化量標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將待測(cè)對(duì)象與超純水，即對(duì)照樣分別加入含有四環(huán)素適配體和納米金的混合液，并通過(guò)加入氯化鈉溶液進(jìn)行聚集反應(yīng)，最后與含有硫酸銅、氫氧化鈉和酒石酸鉀鈉的溶液混合，最后經(jīng)熒光光度計(jì)進(jìn)行共振散射光譜信號(hào)掃描得到共振散射信號(hào)變化量標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)對(duì)象中的四環(huán)素濃度。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征是，所述的檢測(cè)體系通過(guò)以下步驟制備得到: 1)制備已知濃度的四環(huán)素檢測(cè)體系:取11支包含四環(huán)素核酸適配體與納米金混合液的離心管，在25°C條件下孵育15分鐘；然后分別加入5 μ L不同濃度四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)液，使得整個(gè)檢測(cè)體系中的四環(huán)素含量維持在0.01 - 2.5 μ mol/L，充分混勻后再將離心管置于25° C條件下孵育15min ;在上述混合液中加入7 μ L500mmol/L NaCl溶液充分混合均勻并定容至500 μ L，留作以下測(cè)定用； 2)取一支離心管將四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液用5μ L超純水替代，其他按步驟I處理后作為空白對(duì)照體系溶液； 3)制備菲林試劑-葡萄糖還原體系:取11支試管，在每支試管中加入IOyL0.028mol/LCuS04,100 μ L 6.25mol/L NaOH, 200 μ L 1.23mol/L KNaC4H4O6 混合均勻，取50 μ L 10mg/mL葡萄糖加入以上試管中混合均勻；分別將步驟I和步驟2中的標(biāo)準(zhǔn)溶液體系和空白體系轉(zhuǎn)移到以上11支試管中，混合均勻后定容到100(^1^，置于601:恒溫孵育器里孵育6分鐘，取出后用自來(lái)水冷卻至室溫待用。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征是，所述的共振散射信號(hào)變化量標(biāo)準(zhǔn)曲線是指:用熒光光度計(jì)對(duì)檢測(cè)體系以620nm條件下同步掃描獲得其共振散射信號(hào)光譜，將不同濃度的四環(huán)素混合液和空白對(duì)照液的共振散射光譜信號(hào)差值作為縱坐標(biāo)，四環(huán)素混合液的濃度作為橫坐標(biāo)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征是，所述的同步掃描進(jìn)采用石英熒光用比色皿盛放檢測(cè)體系，用熒光光度計(jì)以激發(fā)光狹縫為5nm，發(fā)射光狹縫為2.5nm，激發(fā)光和發(fā)射光波長(zhǎng)均為620nm條件 下同步掃描。
全文摘要
一種基于納米金催化的共振散射光譜四環(huán)素檢測(cè)方法，通過(guò)構(gòu)建含有已知四環(huán)素濃度的檢測(cè)體系后，熒光光度計(jì)進(jìn)行共振散射光譜信號(hào)掃描得到共振散射信號(hào)變化量標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將待測(cè)對(duì)象與超純水，即對(duì)照樣分別加入含有四環(huán)素適配體和納米金的混合液，并通過(guò)加入氯化鈉溶液進(jìn)行聚集反應(yīng)，最后與含有硫酸銅、氫氧化鈉和酒石酸鉀鈉的溶液混合，最后經(jīng)熒光光度計(jì)進(jìn)行共振散射光譜信號(hào)掃描得到共振散射信號(hào)變化量標(biāo)準(zhǔn)曲線得到待測(cè)對(duì)象中的四環(huán)素濃度。本發(fā)明克服核酸適配體需要修飾及檢測(cè)線不理想等缺陷，相比現(xiàn)有技術(shù)具有靈敏、選擇性好、成本低且高效的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK103196875SQ20131006027
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2013年2月26日
發(fā)明者周培, 羅艷芳, 賀蘭, 智文婷, 吳遠(yuǎn)根, 詹深山, 劉樂(lè) 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)