專利名稱：β-鏈蛋白及基因的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及β-鏈蛋白及基因在檢測(cè)胰島素瘤試劑和在胰島素瘤藥物篩選中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胰島素瘤是最常見(jiàn)的功能性胰島細(xì)胞瘤，由Nicholis于1902年首先報(bào)道在尸檢中發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病率約為1/25萬(wàn)。胰島素瘤的病因尚不清楚，其典型表現(xiàn)為明顯的低血糖及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，由于發(fā)病率較低及社區(qū)醫(yī)生認(rèn)知有限，容易被誤診成各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括癲癇、癔癥、精神障礙等。長(zhǎng)期的低血糖可造成不可逆性的腦損害，引起智力減退、行為緩慢，嚴(yán)重者甚至生活不能自理，常給患者帶來(lái)很大危害。如果能及時(shí)、快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出胰島細(xì)胞瘤，讓患者及時(shí)得到治療，將是患者的福音。menin是抑癌基因MENl的編碼產(chǎn)物，在進(jìn)化過(guò)程中高度保守。臨床上menin的變異可以直接導(dǎo)致多內(nèi)分泌腺瘤病I型(MENl)的發(fā)生。盡管menin廣泛分布于各種組織，但正如MENl病人或MENl雜合性突變小鼠所表現(xiàn)的癥狀那樣，menin的缺失僅引起特定的組織器官發(fā)生病變，特別是內(nèi)分泌器官，表現(xiàn)了其高度的功能組織特異性。menin蛋白的晶體結(jié)構(gòu)類似于人半合的左手，拇指和其余手指圍合起來(lái)連同掌心一起形成一個(gè)深的袋形結(jié)構(gòu)，這個(gè)袋形結(jié)構(gòu)的底部就是menin的活性中心,用于結(jié)合JunD、MLL等效應(yīng)蛋白。雖然JunD和MLL結(jié)合的位點(diǎn)相同，但是menin對(duì)二者的調(diào)控作用卻完全相反，其中的機(jī)制尚不清楚。Menin可以與很多蛋白發(fā)生作用。這些蛋白廣泛地參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，細(xì)胞分裂和DNA修復(fù)。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)，menin可以與β -鏈蛋白(β-catenin)結(jié)合并促使β-catenin出核。所以，本發(fā)明著重研究β-catenin是否在胰島細(xì)胞瘤的生成過(guò)程中發(fā)生作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是研究β -鏈蛋白(β -catenin)在小鼠胰島素瘤發(fā)生中所起的作用，為臨床上治療和檢測(cè)胰島素瘤提`供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。本發(fā)明涉及鏈蛋白基因在檢測(cè)胰島素瘤試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明涉及鏈蛋白基因在胰島素瘤藥物篩選中的應(yīng)用。本發(fā)明涉及鏈蛋白在檢測(cè)胰島素瘤試劑中的應(yīng)用。本發(fā)明還涉鏈蛋白在胰島素瘤藥物篩選中的應(yīng)用。腫瘤抑制基因Menl所編碼的蛋白稱為Menin，Menl條件性敲除小鼠(Menliwl0X-RipCre+, Menin-ΚΟ)正好提供了一個(gè)恰當(dāng)?shù)囊葝u素瘤發(fā)生模型，Menin-KO小鼠也可以發(fā)生與MENl病人類似的腫瘤譜。實(shí)驗(yàn)中，在Menin-KO小鼠胰腺β細(xì)胞中進(jìn)一步敲除β -catenin (DBK0小鼠),然后觀察β-catenin的缺失是否能夠影響胰島素瘤的生成。在為期兩年的生存率觀察中，發(fā)現(xiàn)DBKO小鼠的生存率相比Menin-KO小鼠得到了明顯提高。對(duì)Menin-KO小鼠和DBKO小鼠的死亡尸體進(jìn)行解剖，在胰腺中均發(fā)現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的腫瘤，而Menin-KO小鼠的腫瘤體積明顯大于DBKO小鼠。腫瘤發(fā)生率的統(tǒng)計(jì)也表明Menin-KO小鼠的腫瘤發(fā)生率在各個(gè)觀測(cè)時(shí)間點(diǎn)均高于DBKO小鼠，而在正常小鼠中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)胰腺腫瘤，說(shuō)明β-catenin與胰島素瘤成正關(guān)系，β-catenin —旦缺失，胰島細(xì)胞瘤的發(fā)生率將明顯降低。同時(shí)對(duì)各組轉(zhuǎn)基因小鼠及對(duì)照正常組小鼠進(jìn)行空腹血糖、隨機(jī)血糖、空腹胰島素水平進(jìn)行了測(cè)試，結(jié)果表明，Menin-KO小鼠的胰島β細(xì)胞胰島素分泌喪失了糖依賴性，在低血糖的狀態(tài)下仍然可以自主分泌胰島素。年齡大的Menin-KO小鼠一般表現(xiàn)為活動(dòng)明顯減小，對(duì)刺激反應(yīng)遲鈍以及精神萎靡，符合低血糖的臨床表現(xiàn)。在Menin敲除的基礎(chǔ)上敲除β-catenin可以有效的逆轉(zhuǎn)胰島素瘤小鼠的低血糖，胰島素分泌在一定程度上恢復(fù)了糖依賴性，從而提高了生存率。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于1、本發(fā)明通過(guò)轉(zhuǎn)基因型小鼠的研究了，確定了 β-catenin對(duì)胰島素瘤生長(zhǎng)成正關(guān)系，能通過(guò)β-catenin的檢測(cè),快速、準(zhǔn)確地對(duì)胰島素瘤小鼠確診。2、本發(fā)明為臨床上β-catenin在檢測(cè)胰島素瘤試劑中的應(yīng)用及在胰島素瘤藥物篩選中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。


圖1為小鼠的生存率比較圖。圖2為小鼠的腫瘤發(fā)生率統(tǒng)計(jì)圖。圖3為胰腺腫瘤組織免疫組化染色對(duì)比圖。圖4為小鼠空腹血糖測(cè)試對(duì)比圖。圖5為小鼠隨機(jī)血糖測(cè)試對(duì)比圖。圖6為 10月齡的小鼠的空腹血清胰島素水平測(cè)試比較圖。圖7為15月齡的小鼠的空腹血清胰島素水平測(cè)試比較圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明實(shí)施例11、轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立通過(guò)Cre/loxP技術(shù)建立胰島β細(xì)胞條件性敲除β-catenin基因(Catnb)小鼠和Menl/ β -catenin雙基因敲除小鼠模型I)購(gòu)自美國(guó)Jackson Lab純合型Catnb1 71 小鼠(攜帶IoxP修飾的β -catenin基因)，將該小鼠與野生型C57小鼠交配獲得Catnbiw+雜合型小鼠。2)將 β 細(xì)胞特異性的 Rat-1nsulin-promoter Cre (Rip-Cre)的小鼠，與 Catnb1 7lQX小鼠交配獲得β細(xì)胞條件性敲除β-catenin基因小鼠模型(Catnbiwira1-RipCre+)(以下簡(jiǎn)稱BBKO小鼠)。3) Menl 條件性敲除小鼠(Menl1ox7lox-RipCre+)(以下簡(jiǎn)稱 Menin-KO 小鼠)與Catnbwirai小鼠交配，2代后獲得純合雙基因敲除小鼠模型(Catnbwira1-Menlwl0X-RipCre+)(以下簡(jiǎn)稱DBKO小鼠)小鼠飼養(yǎng)的環(huán)境為IVC獨(dú)立送風(fēng)飼養(yǎng)籠，溫度控制在21±1° C，相對(duì)濕度為55± 10%，晝夜節(jié)律設(shè)為12-12小時(shí)，8am開(kāi)燈，8pm關(guān)燈。水和食物充分供給自由取食。2、實(shí)驗(yàn)過(guò)程及結(jié)果
對(duì)20只DBKO小鼠和20只Menin-KO小鼠進(jìn)行了 2年的生存率記錄，結(jié)果顯示DBKO小鼠的生存率大大高于Menin-KO小鼠，Menin-KO小鼠2年的生存率接近0%，而DBKO小鼠的生存率為80%，接近對(duì)照組小鼠(即正常小鼠)的90%，具體見(jiàn)圖1所示；對(duì)4個(gè)月、6個(gè)月和8個(gè)月齡的Menin-KO小鼠、DBKO小鼠、BBKO小鼠及對(duì)照組小鼠(即正常小鼠)進(jìn)行腫瘤發(fā)生率統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示DBKO小鼠的腫瘤發(fā)生率明顯低于Menin-KO小鼠組，Menin-KO小鼠的腫瘤發(fā)生率在6個(gè)月時(shí)已經(jīng)達(dá)到80%，8個(gè)月齡時(shí)達(dá)到100%，DBKO小鼠在6個(gè)月時(shí)為37. 5%，并且腫瘤發(fā)生率增加緩慢，8個(gè)月時(shí)僅為41. 7%，具體圖2所示；而對(duì)各組小鼠進(jìn)行胰腺腫瘤解剖探查發(fā)現(xiàn)，在Menin-KO小鼠胰腺均觀察到肉眼可見(jiàn)的腫瘤組織，其腫瘤的大小明顯大于DBKO小鼠，BBKO小鼠和對(duì)照組小鼠未探查到胰腺腫瘤。將腫瘤組織進(jìn)行免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，Menin-KO小鼠的胰島素瘤出現(xiàn)明顯的溝回樣結(jié)構(gòu)，核異質(zhì)性明顯，胰島素染色減弱。而DBKO小鼠瘤組織溝回樣結(jié)構(gòu)沒(méi)有Menin-KO小鼠明顯，具體見(jiàn)圖3所示(其中，圖3a為Menin-KO組，圖3b為DBKO組，圖3c為BBKO組，圖3d為對(duì)照組)。上述的結(jié)果表明β -catenin在胰島細(xì)胞瘤的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用，β -catenin 一旦缺失,胰島細(xì)胞瘤的發(fā)生率將明顯降低。將Menin-KO小鼠、DBKO小鼠、BBKO小鼠進(jìn)行空腹血糖和隨機(jī)血糖的測(cè)試，具體測(cè)試結(jié)果分別見(jiàn)圖4和圖5所示，從圖中可以看出，Menin-KO小鼠的空腹血糖和隨機(jī)血糖都明顯低于對(duì)照組小鼠，尤其是圖5中的數(shù)據(jù)表明18月齡的Menin-KO小鼠平均隨機(jī)血糖只有1. 97mmol/L，而DBKO小鼠平均隨機(jī)血糖達(dá)到5. 83mmol/L，接近于正常小鼠的8. 05mmol/L ;圖6為10月齡的小鼠的空腹血清胰島素水平，圖7為15月齡的小鼠的空腹血清胰島素水平，從圖中的測(cè)定結(jié)果表明，Menin-KO小鼠的低血糖是由于胰島素分泌過(guò)多造成的，Menin-KO小鼠的血清胰島素分泌明顯高于DBKO和對(duì)照小鼠。這表明Menin-KO小鼠的胰島β細(xì)胞胰島素分泌喪失了糖依賴性，在低血糖的狀態(tài)下仍然可以自主分泌胰島素。年齡大的Menin-KO小鼠一般表現(xiàn)為活動(dòng)明顯減小，對(duì)刺激反應(yīng)遲鈍以及精神萎靡，符合低血糖的臨床表現(xiàn)。在Menin敲除的基礎(chǔ)上敲除β -catenin可以有效的逆轉(zhuǎn)胰島素瘤小鼠的低血糖，從而提高了生存率。這表明DBKO小鼠的胰島素分泌在一定程度上恢復(fù)了糖依賴性。
權(quán)利要求
1.β-鏈蛋白基因在檢測(cè)胰島素瘤試劑中的應(yīng)用。
2.β_鏈蛋白基因在胰島素瘤藥物篩選中的應(yīng)用。
3.鏈蛋白在檢測(cè)胰島素瘤試劑中的應(yīng)用。
4.鏈蛋白在胰島素瘤藥物篩選中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及β-鏈蛋白及基因在檢測(cè)胰島素瘤試劑中的應(yīng)用和β-鏈蛋白及基因在胰島素瘤藥物篩選中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠的尸體解剖、血糖和胰島素水平的測(cè)定等實(shí)驗(yàn)，研究β-catenin與胰島素瘤的生成的影響關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明β-catenin與胰島素瘤成正關(guān)系，β-catenin一旦缺失，胰島細(xì)胞瘤的發(fā)生率將明顯降低。本發(fā)明的有益效果為通過(guò)β-catenin的檢測(cè)，能快速、準(zhǔn)確地對(duì)胰島素瘤小鼠進(jìn)行確診。而且本發(fā)明也為臨床上β-catenin在檢測(cè)胰島素瘤試劑中的應(yīng)用及在胰島素瘤藥物篩選中的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK103060463SQ201310023750
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2013年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月22日
發(fā)明者寧光, 李峰, 李小英, 曹亞南, 姜秀麗 申請(qǐng)人:上海市內(nèi)分泌代謝病研究所