專利名稱：基于倏逝場照明的移頻超分辨顯微成像方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微觀觀測測量領(lǐng)域，具體涉及一種基于倏逝場照明的移頻超分辨顯微成像方法和裝置。
背景技術(shù)：
納米技術(shù)與生物技術(shù)是21世紀發(fā)展最迅速和熱門的科學領(lǐng)域。納米技術(shù)應用廣泛，包括I IOOnm尺度內(nèi)的成像、測量、加工、操縱等。許多重要的生物體比如葡萄糖、抗體、病毒等都處于這個尺度范圍內(nèi)，研究這些微小物體的需求推動了高分辨率顯微成像技術(shù)的發(fā)展。反過來，超分辨顯微術(shù)的發(fā)展也推動了整個生命科學的進步。相比其他的顯微技術(shù)，光學顯微技術(shù)的一大優(yōu)勢是可以對處于自然狀態(tài)的活細胞進行研究。自世界上第一臺光學顯微鏡問世以來，提高光學顯微成像系統(tǒng)的分辨能力及測量范圍一直是眾多科學家致力研究的重要科學問題，特別是近年來，隨著物理學、生物醫(yī)學、微電子學和材料學等學科的迅速發(fā)展，對這一問題的研究變得尤為迫切，主要體現(xiàn)在物理學的發(fā)展要求人們能觀測到微觀世界中原子的大??；分子生物學的發(fā)展要求人們能觀測到活體細胞這種高散射物質(zhì)內(nèi)小到納米尺度的單分子；微電子技術(shù)的發(fā)展要求人們能檢測到超大規(guī)模集成電路中窄到數(shù)十納米的線寬尺寸；納米新材料的出現(xiàn)要求人們能觀測到納米尺度大小的納米顆粒等，這些現(xiàn)代科學的新進展，更加促使人們不斷地去探索高分辨顯微成像的新方法和新技術(shù)。由于衍射極限的存在，傳統(tǒng)的寬場光學顯微鏡橫向和縱向的分辨率分別僅約為230nm和lOOOnm。二十世紀三十年代發(fā)展起來的電子顯微成像技術(shù)及八十年代初崛起的各類非光學的探針掃描顯微成像技術(shù)具有納米甚至更高的分辨能力，但它們在不同程度上存在著系統(tǒng)結(jié)構(gòu)復雜、成像檢測環(huán)境要求苛刻及樣品處理繁瑣等困難，特別是不能獲得樣品重要的光學信息(如反射率、折射率、偏振態(tài)及光譜等信息)，因而無法完全取代光學顯微成像的地位。隨著現(xiàn)代激光技術(shù)、計算機技術(shù)、精密機械及電子技術(shù)的迅猛發(fā)展，超分辨的光學顯微成像技術(shù)(Super-resolution Optical Microscopy, SR0M)應運而生。根據(jù)原理不同，現(xiàn)有技術(shù)可以分為兩大類一類是以固體浸沒透鏡(Solid Immersion Lens, SIL)技術(shù)為代表的近場顯微技術(shù)；另一類則是以激發(fā)抵制損耗顯微鏡(Stimulated EmissionDepletion, STED)為代表的熒光顯微技術(shù)。然后，兩種現(xiàn)有技術(shù)都存在著一定的缺陷前者雖然使用寬場照明，但很難將其分辨率壓縮在IOOnm以下；后者則是基于熒光顯微技術(shù)，無法使用于非熒光樣品上，因此使用范圍受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明基于倏逝場照明，提供了一種實現(xiàn)遠場超分辨的方法，通過移頻算法實現(xiàn)了超分辨顯微圖像獲取。一種基于倏逝場照明的移頻超分辨顯微成像方法，包括以下幾個步驟I)將準直后的入射照明光傾斜照射在基板介質(zhì)分界面上產(chǎn)生全反射，在界面另一側(cè)產(chǎn)生倏逝場；2)使用倏逝場對樣品表面進行照明，并通過顯微鏡從遠場接收樣品表面的強度圖像；3)對所述的強度圖像進行傅里葉變換得到相應頻譜，使用移頻算法對所得到的頻譜進行還原，并得到相應的頻譜還原圖像；4)繞樣品多次改變?nèi)肷湔彰鞴夥较?，直至入射照明光方向覆蓋O 360° ,每次均重復步驟I) 步驟3)，得到不同方向下的頻譜還原圖像；5)對不同方向下的頻譜還原圖像進行疊加，得到完整的高頻頻譜圖像；6)對所述的完整高頻頻譜圖像進行傅里葉反變換，得到觀察樣品的超分辨顯微圖像。所述的入射照明光為具有相同偏振方向、且波長在380 780nm范圍內(nèi)的可見單色線偏振光。步驟(2)中所述的 照射在基板介質(zhì)分界面，是指入射照明光由光密介質(zhì)一側(cè)入射；所述的傾斜照射，是指入射照明光的入射角大于界面全反射角。所述的顯微鏡為100X放大非浸沒光學顯微鏡，其數(shù)值孔徑優(yōu)選為O. 8 O. 95。步驟4)中的入射照明光方向改變的次數(shù)由下式?jīng)Q定NUM= n /arcsin (km/ke)式中< 為顯微鏡最大截止頻率，ke為倏逝場橫向光波矢。本發(fā)明的工作原理是當準直后的單色光通過光密介質(zhì)后達到介質(zhì)分界面時，會在介質(zhì)分界面上發(fā)生光路折轉(zhuǎn)。當入射光線的入射角大于全反射角之后，將在界面上發(fā)生全反射。此時，在光疏介質(zhì)一側(cè)，全反射將產(chǎn)生倏逝場。根據(jù)光波矢邊界連續(xù)條件，倏逝場的橫向光波矢將由如下公式?jīng)Q定ke = n^osin Θ ^ n2k0其中，kQ為入射單色光在真空中的光波矢大小，Ii1和n2分別為光密介質(zhì)(棱鏡)和光疏介質(zhì)(空氣)的折射率，Θ為入射角。當倏逝場照射在樣品表面時，根據(jù)移頻理論，會發(fā)生頻譜搬移現(xiàn)象?？梢杂萌缦鹿奖磉_Yl = Y ± Λ,ξ其中，|K|>々m為樣品表面亞波長細節(jié)所對應的傅里葉頻譜，km為顯微鏡最大截止頻率，N為衍射級次。由于衍射強度隨衍射級次的增大而遞減，一般而言N= 1，當
時，原本不能分辨的樣品表面亞波長細節(jié)信息，可以被移頻至可傳導頻域內(nèi)從而可以被顯微鏡從遠場接收。通過對接收的強度圖像進行傅里葉變換即可以直接得到P；，再通過上述公式中的反運算石= 即可以將頻譜還原。如果倏逝場僅從單一方向?qū)悠愤M行照明，其可移頻的范圍是有限的。對整個頻譜面進行二維傅里葉展開，可知可移頻通帶范圍是一個與顯微鏡通帶等大的圓形區(qū)域。其相對于頻譜原點的張角，可由如下公式確定Θ = 2arcsin (km/ke)
權(quán)利要求
1.一種基于倏逝場照明的移頻超分辨顯微成像方法，其特征在于，包括以下幾個步驟1)將準直后的入射照明光傾斜照射在基板介質(zhì)分界面上產(chǎn)生全反射，在基板介質(zhì)分界面另一側(cè)產(chǎn)生倏逝場；2)使用倏逝場對樣品表面進行照明，并通過顯微鏡從遠場接收樣品表面的強度圖像；3)對所述的強度圖像進行傅里葉變換得到相應頻譜，使用移頻算法對所得到的頻譜進行還原，并得到相應的頻譜還原圖像；4)繞樣品多次改變?nèi)肷湔彰鞴夥较?，直至入射照明光方向覆蓋O 360°，每次均重復步驟I) 步驟3)，得到不同方向下的頻譜還原圖像；5)對不同方向下的頻譜還原圖像進行疊加，得到完整的高頻頻譜圖像；6)對所述的完整高頻頻譜圖像進行傅里葉反變換，得到觀察樣品的超分辨顯微圖像。
2.如權(quán)利要求1所述的基于倏逝場照明的移頻超分辨顯微成像方法，其特征在于，所述的入射照明光為具有相同偏振方向、且波長在380 780nm范圍內(nèi)的可見單色線偏振光。
3.如權(quán)利要求1所述的基于倏逝場照明的移頻超分辨顯微成像方法，其特征在于，步驟4)中的入射照明光方向改變的次數(shù)由下式?jīng)Q定NUM = n /arcsin (km/ke)式中km為顯微鏡最大截止頻率，ke為倏逝場橫向光波矢。
4.一種基于倏逝場照明的移頻超分辨顯微成像裝置，其特征在于，包括用于產(chǎn)生入射照明光的光源組；用于對所述入射照明光進行全反射且?guī)в谢褰橘|(zhì)分界面的棱鏡，該基板介質(zhì)分界面的背面放置有樣品；用于收集樣品表面的強度圖像的顯微鏡；以及用于對所述強度圖像進行計算和控制的計算機。
5.如權(quán)利要求4所述的基于倏逝場照明的移頻超分辨顯微成像裝置，其特征在于，所述的光源組包括繞棱鏡布置的多個子光源，且所有子光源處于同一水平面上，每個子光源包括沿光路依次布置的LED、窄帶濾色片、準直模塊和偏振片。
6.如權(quán)利要求4所述的基于倏逝場照明的移頻超分辨顯微成像裝置，其特征在于，所述棱鏡為倒置的多棱錐形，所述的基板介質(zhì)分界面位于棱鏡的頂部。
7.一種基于倏逝場照明的移頻超分辨顯微成像裝置，其特征在于，包括沿所述光路依次布置的用于產(chǎn)生入射照明光的激光光源；用于改變?nèi)肷湔彰鞴獾膫鞑シ较虻墓饴忿D(zhuǎn)換裝置；用于將入射照明光改變?yōu)榇蠼嵌绕叫泄馐娜瓷湮镧R鏡頭；用于對所述入射照明光進行全反射且?guī)в谢褰橘|(zhì)分界面的玻片，該玻片上放置有樣品;用于收集樣品表面的強度圖像的顯微鏡；以及用于對所述強度圖像進行計算和控制的計算機。
8.如權(quán)利要求7所述的基于倏逝場照明的移頻超分辨顯微成像裝置，其特征在于，所述光路轉(zhuǎn)換裝置為振鏡。
9.如權(quán)利要求8所述的基于倏逝場照明的移頻超分辨顯微成像裝置，其特征在于，所述振鏡和全反射物鏡鏡頭之間設有，用于將對所述振鏡出射的入射照明光進行聚焦的聚焦鏡。
10.如權(quán)利要求7所述的基于倏逝場照明的移頻超分辨顯微成像裝置，其特征在于，所述的光路轉(zhuǎn)換裝置為偏心光闌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于倏逝場照明的移頻超分辨顯微成像方法，包括以下幾個步驟1)入射照明光傾斜照射在基板介質(zhì)分界面上進行全反射并產(chǎn)生倏逝場；2)使用倏逝場對樣品表面進行照明，并通過顯微鏡接收樣品表面的強度圖像；3)對強度圖像進行傅里葉變換得到相應頻譜，對所得到的頻譜進行還原，得到相應的頻譜還原圖像；4)繞樣品多次改變?nèi)肷湔彰鞴夥较?，直至入射照明光方向覆蓋0～360°，得到不同方向下的頻譜還原圖像；5)對不同方向下的頻譜還原圖像進行疊加，得到完整的高頻頻譜圖像；6)對完整高頻頻譜圖像進行傅里葉反變換，得到觀察樣品的超分辨顯微圖像。本發(fā)明還公開了一種基于倏逝場照明的移頻超分辨顯微成像裝置。
文檔編號G01N21/55GK103048272SQ201310006658
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月8日
發(fā)明者劉旭, 郝翔, 匡翠方, 庫玉龍, 李旸暉 申請人:浙江大學