相變介質(zhì)的過濾器支撐物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于處理經(jīng)分離的細(xì)胞（尤其是諸如循環(huán)腫瘤細(xì)胞的罕見細(xì)胞）以使其適于光學(xué)成像的方法，所述方法包括以下步驟：（a）在相變介質(zhì)上沉積包括捕獲到的細(xì)胞的過濾材料；（b）熔化所述相變介質(zhì)，直到介質(zhì)在所述過濾材料下方被分散；以及（c）降低所述相變介質(zhì)的溫度，直到介質(zhì)固化，在固定位置處形成包括所述細(xì)胞的光學(xué)平面過濾器。所述方法可以額外地包括在過濾材料上捕獲細(xì)胞的初始步驟。所述相變介質(zhì)（優(yōu)選為石蠟）可以包括允許穿過所述介質(zhì)的流體通過的多孔或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。所述相變介質(zhì)還可以被安裝在載體上，諸如，玻璃載體或聚合材料載體。本發(fā)明還涉及經(jīng)處理的過濾材料，其包括適于光學(xué)成像的經(jīng)分離的細(xì)胞，通過所述方法可獲得所述經(jīng)分離的細(xì)胞；這種過濾材料用于診斷、組織學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)、腫瘤學(xué)或血液分析，還涉及一種用于分離細(xì)胞或處理細(xì)胞以使其適于光學(xué)成像的設(shè)備。
【專利說明】相變介質(zhì)的過濾器支撐物
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于處理經(jīng)分離的細(xì)胞(尤其是諸如循環(huán)腫瘤細(xì)胞的罕見細(xì)胞)的方法，以使其適于光學(xué)成像，所述方法包括以下步驟:Ca)在相變介質(zhì)上沉積包括經(jīng)捕獲的細(xì)胞的過濾材料；(b)熔化所述相變介質(zhì)，直到所述介質(zhì)在所述過濾材料下方被分散；以及(C)降低所述相變介質(zhì)的溫度，直到所述介質(zhì)固化，在固定位置處形成包括所述細(xì)胞的光學(xué)平面過濾器。所述方法可以額外地包括在過濾材料上捕獲細(xì)胞的初始步驟。所述相變介質(zhì)(優(yōu)選為石蠟)可以包括允許穿過介質(zhì)的流體通過的多孔或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。所述相變介質(zhì)還可以被安裝在載體上，諸如，玻璃載體或聚合材料載體。本發(fā)明還涉及經(jīng)處理的過濾材料，其包括適于光學(xué)成像的經(jīng)分離的細(xì)胞，通過所述方法可獲得所述經(jīng)分離的細(xì)胞；這種過濾材料用于診斷、組織學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)、腫瘤學(xué)或血液分析，也涉及一種用于分離細(xì)胞或處理細(xì)胞設(shè)備，以使其適于光學(xué)成像。
【背景技術(shù)】
[0002]轉(zhuǎn)移(S卩，癌癥從原發(fā)部位到不相鄰的二級部位的擴(kuò)散)是癌癥研究、診斷和處置的主要挑戰(zhàn)之一。轉(zhuǎn)移被認(rèn)為通過包括局部浸潤、血管內(nèi)滲、循環(huán)輸送、微血管中抑制、血管外滲、微小轉(zhuǎn)移形成、休眠、血管新生、移植以及大量轉(zhuǎn)移形成(Weinberg，2007，Thebiology of cancer,Garland Science,New York)的一系列步驟而得到發(fā)展。在其循環(huán)系統(tǒng)中(尤其在血流中)的輸送期間，腫瘤細(xì)胞被稱為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)。CTC被認(rèn)為在癌(即，上皮的惡性腫瘤)的轉(zhuǎn)移擴(kuò)散中起到關(guān)鍵作用。由此，對其的檢測具有重要的預(yù)后和處置性含義，并且尤其與臨床分期、疾病復(fù)發(fā)、處置反應(yīng)和患者存活期相關(guān)聯(lián)。CTC還被視為用于復(fù)發(fā)風(fēng)險評估和處置療程的獨立替代標(biāo)記。
[0003]然而，CTC在血流中是極其罕見的，并且在患有轉(zhuǎn)移性疾病患者中被發(fā)現(xiàn)僅具有全血中每毫升1-10個細(xì)胞的頻率，相比之下，在相同的體積中能夠發(fā)現(xiàn)IO9個紅血球和數(shù)百萬個白血球。因此，有必要選擇并富集這些罕見的循環(huán)腫瘤細(xì)胞。傳統(tǒng)上，富集處理是基于CTC的密度差異，其通過密度離心法被分開。然而，痊愈率非常低。最近，CTC的富集是基于對具體表面標(biāo)記(尤其是上皮黏附分子(EpCAM))的識別。因此，例如通過磁流體納米粒子,能夠以免疫磁性的方式富集CTC。然而，這種途徑被約10%到90%的寬痊愈范圍阻礙，所述約10%到90%的寬痊愈范圍顯然應(yīng)歸于表面標(biāo)記的可變表達(dá)(Zheng等人，2011，BiomedMicrodevices,13:203 - 213)。
[0004]作為用于分離CTC的備選方案，已經(jīng)提出細(xì)胞尺寸排阻方法的使用，尤其應(yīng)歸于在許多情況下作為上皮細(xì)胞的CTC大于周圍血細(xì)胞的事實。已經(jīng)發(fā)展了若干過濾器類型，包括在隨機位置處包括孔的聚碳酸酯過濾器、微加工過濾器、微加工單層2D過濾器、基于電場的微流體過濾器、基于鎳電成型的過濾器微腔陣列設(shè)備或3D微過濾器設(shè)備(Zheng等人，2011，Biomed Microdevices，13:203 - 213)。還已經(jīng)發(fā)展了類似的途徑，其用于其他細(xì)胞類型的選擇，例如，血流內(nèi)或某些樣本形態(tài)內(nèi)的細(xì)菌細(xì)胞、骨髓細(xì)胞或脾細(xì)胞等。
[0005]然而，從溶液中選擇具體細(xì)胞僅僅是確定細(xì)胞特性(例如，其轉(zhuǎn)移性特征)必要的反應(yīng)序列的第一步。由此，在細(xì)胞已經(jīng)被分離之后，通常接受染色和光學(xué)微分過程。在這些后續(xù)步驟期間，過濾材料通常難以處理、變薄、易碎，并且容易破損。
[0006]另外，過濾器經(jīng)常起皺并且不是光學(xué)平面，由此使細(xì)胞的光學(xué)成像處理復(fù)雜化。盡管現(xiàn)有技術(shù)提供了克服這個問題的途徑，例如，通過使用免疫磁珠和磁體，以倚靠顯微鏡蓋拉動細(xì)胞，這些方法復(fù)雜、耗時或需要專用裝備。
[0007]因此，需要提供允許處理包括經(jīng)分離的細(xì)胞的過濾材料的裝置和方法，使得能夠在過濾材料上快速并且精確地對捕獲到的細(xì)胞進(jìn)行成像。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明解決了這些需要，并且提供用于處理經(jīng)分離的細(xì)胞以使其適于光學(xué)成像的裝置和方法。尤其通過用于處理經(jīng)分離的細(xì)胞以使其適于光學(xué)成像的方法來實現(xiàn)以上目的，所述方法包括以下步驟:Ca)在相變介質(zhì)上沉積包括捕獲到的細(xì)胞的過濾材料；(b)熔化所述相變介質(zhì)，直到介質(zhì)在所述過濾材料下方被分散；以及(C)降低所述相變介質(zhì)的溫度，直到介質(zhì)固化，在固定位置處形成包括所述細(xì)胞的光學(xué)平面過濾器。所述方法提供以下優(yōu)勢:能夠以簡單、省時和精確的方式來處理可過濾細(xì)胞(諸如循環(huán)腫瘤細(xì)胞)，用于后續(xù)光學(xué)分析步驟。尤其，甚至在不具有任何染色的情況下，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在標(biāo)準(zhǔn)明視場顯微鏡中具有非常高的對比度的細(xì)胞是可成像的。對于經(jīng)處理細(xì)胞的觀察到的高質(zhì)量特性的解釋是介質(zhì)散射光并且抑制來自過濾材料、光學(xué)組件和支撐材料的反射。由此，本方法以非常溫和的方式建立光學(xué)平面過濾器表面。此外，過濾器上的經(jīng)處理的細(xì)胞仍經(jīng)過染色、固定、生物或機械操縱或培養(yǎng)途徑。另外，在后續(xù)處理步驟期間，表面區(qū)域的變形能夠通過固定在諸如玻璃的載體材料上來避免。由此，所述發(fā)展方法非常適于處理從血液樣本中可推導(dǎo)的細(xì)胞類型，尤其是CTC。另外，它一般能夠被應(yīng)用于任何情況，其中(不管來源、類型或尺寸的)細(xì)胞(例如要求后續(xù)光學(xué)分析的細(xì)胞)存在于過濾材料上。
[0009]在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，上文中定義的方法額外地包括在過濾材料上捕獲細(xì)胞的初始步驟。
[0010]在本發(fā)明的又一優(yōu)選實施例中，所述過濾材料能夠以尺寸排阻細(xì)胞，以將其從流體或溶液中分離。過濾材料可以優(yōu)選地具有0.5到20 μ m的孔尺寸，更優(yōu)選為約8 μ m。在本發(fā)明的其他優(yōu)選實施例中，上文中定義的所述過濾材料是聚合物過濾器，更優(yōu)選為聚碳酸酯、聚對二甲苯或尼龍過濾器。在本發(fā)明的又一優(yōu)選實施例中，上文中定義的所述過濾材料是非聚合物過濾器，更優(yōu)選為硅過濾器。在本發(fā)明的又一優(yōu)選實施例中，所述過濾材料是3D微過濾器。
[0011]在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施例中，所述相變介質(zhì)是在約25°C到70°C的溫度范圍內(nèi)熔化和固化的介質(zhì)。
[0012]在又一優(yōu)選實施例中，以上提及的相變介質(zhì)包括多孔、網(wǎng)狀、開放或部分開放的結(jié)構(gòu)，和/或包括通道、通路或管元件，其中，所述結(jié)構(gòu)或元件允許穿過所述介質(zhì)的流體通過。
[0013]在本發(fā)明的又一優(yōu)選實施例中，所述相變介質(zhì)是烴蠟，優(yōu)選為具有CnH2n+2 (n=20到40)分子式的石臘。
[0014]在本發(fā)明的又一優(yōu)選實施例中，以上提及的所述相變介質(zhì)被安裝在載體上。在本發(fā)明的具體優(yōu)選實施例中，所述載體是玻璃載體或聚合材料載體。在又一優(yōu)選實施例中，所述載體(例如玻璃或聚合材料載體)包括位置標(biāo)記。
[0015]在又一優(yōu)選實施例中，上文描述的方法包括從對經(jīng)分離的細(xì)胞進(jìn)行染色、固定、釋放、機械操縱、生物操縱和生化操縱的群組中選擇的活動，作為額外的步驟。
[0016]在本發(fā)明的具體優(yōu)選實施例中，所述活動包括優(yōu)選地經(jīng)由流動營養(yǎng)液穿過所述多孔、網(wǎng)狀、開放或部分開放的相變介質(zhì)來培養(yǎng)所述經(jīng)分離的細(xì)胞。
[0017]在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施例中，上文提及的被分離或存在于過濾器上的細(xì)胞是罕見細(xì)胞。在具體優(yōu)選實施例中，所述細(xì)胞是循環(huán)腫瘤細(xì)胞。
[0018]在又一優(yōu)選實施例中，上文描述的所述光學(xué)成像是明視場顯微鏡檢查、暗視場顯微鏡檢查、相位對比度顯微鏡檢查、微分干涉對比度顯微鏡檢查、熒光顯微鏡檢查、原子力顯微鏡檢查、共聚焦激光掃描顯微鏡檢查或超分辯率顯微鏡檢查。
[0019]在另一方面，本發(fā)明涉及包括適于光學(xué)成像的經(jīng)分離的細(xì)胞的經(jīng)處理的過濾材料，通過例如上文定義的根據(jù)本發(fā)明的方法可獲得所述經(jīng)處理的過濾材料。
[0020]在另一方面，本發(fā)明涉及包括適于光學(xué)成像的經(jīng)分離的細(xì)胞的經(jīng)處理的過濾材料的使用，通過例如上文定義的根據(jù)本發(fā)明的方法可獲得所述經(jīng)分離的細(xì)胞，用于診斷、組織學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)、腫瘤學(xué)、或血液分析。
[0021]在另一方面，本發(fā)明涉及一種用于處理細(xì)胞以使其適于光學(xué)成像的設(shè)備，包括:
[0022](a)上文定義的用于捕獲細(xì)胞的過濾材料；
[0023](b)上文定義的相變介質(zhì)層；以及
[0024]( c )加熱和/或冷卻單元。
[0025]最后，在具體實施例中，本發(fā)明涉及一種上文提及的用于處理細(xì)胞以使其適于光學(xué)成像的設(shè)備，額外地包括被耦合到過濾材料的可移動壓力遞送系統(tǒng)，允許在過濾材料上分離細(xì)胞，和/或上文提及的用于將所述過濾材料和/或所述相變介質(zhì)層輸送到載體的裝置。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1描繪了所述方法的橫截面:熔化支撐結(jié)構(gòu)將使相變介質(zhì)均勻地分布在物鏡和過濾器之間。固化在適當(dāng)?shù)奈恢霉潭ㄟ^濾器，使其關(guān)于物鏡在單光學(xué)平面和在固定的位置留下并且保持全部細(xì)胞。
[0027]圖2示出了珀耳帖(Peltier)元件，其熔化支撐聚碳酸酯過濾器的石蠟結(jié)構(gòu)(圖2A)，冷卻之后所述聚碳酸酯過濾器形成光學(xué)平面且固定的濾波器表面(圖2B)。
[0028]圖3A示出了在石蠟支撐結(jié)構(gòu)熔化之后在具有8 μ m孔(小黑點)的聚碳酸酯過濾器(Whatman Cyclopore跟蹤蝕刻膜)頂部的MCF7(乳腺癌)細(xì)胞。圖3B示出了在石臘支撐結(jié)構(gòu)熔化和后續(xù)H&E染色之后在具有8 μ m孔(小黑點)的聚碳酸酯過濾器(Whatman Cyclopore跟蹤蝕刻膜)頂部的MCF7 (乳腺癌)細(xì)胞。所述細(xì)胞保持在過濾器上并且在整個染色協(xié)議中過濾器經(jīng)由石蠟保持附著顯微鏡載玻片。
[0029]圖4示出了對設(shè)備的樣本原型創(chuàng)建的步驟，以測試過濾器的過濾和光學(xué)平化的集成功能。
[0030]圖5描繪了具有由過濾器分開的2室的實施例。圖5A示出了以頂部觀察的可熔化支撐結(jié)構(gòu)。圖5B示出了支撐過濾器的可能的支撐結(jié)構(gòu)(4，圖5A)。由內(nèi)管(2)和過濾器(在支撐結(jié)構(gòu)的頂部)密封第一隔室，由內(nèi)管(2)和外管(3)密封第二隔室。在該實施例中，能夠容易地被移除細(xì)胞供應(yīng)和真空生成機器，在其之后過濾器(3)可以變平并且被成像。
【具體實施方式】
[0031]本發(fā)明涉及用于處理經(jīng)分離的細(xì)胞以使其適于光學(xué)成像的裝置和方法。
[0032]盡管將關(guān)于具體實施例描述本發(fā)明，本說明書不被解釋為限制意義。
[0033]在詳細(xì)描述本發(fā)明的范例性實施例之前，給出對理解本發(fā)明重要的定義。
[0034]如在本說明書和所附的權(quán)利要求中使用的，“一”、“一個”和“這個”的單數(shù)形式也包括相應(yīng)的復(fù)數(shù),除非上下文清晰地另有指示。
[0035]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語“約”和“近似”指代本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的精確度的區(qū)間，以仍確保討論中的特點的技術(shù)效果。所述術(shù)語通常指示與指示的數(shù)值的偏差為±20%、優(yōu)選為±15%、更優(yōu)選為±10%、以及甚至更優(yōu)選為±5%。
[0036]應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語“包括”不是限制。為了達(dá)到本發(fā)明的目的，術(shù)語“構(gòu)成”被認(rèn)為是術(shù)語“包括”的優(yōu)選實施例。如果在下文中，群組被定義為包括至少某個數(shù)量的實施例，這意味著也涵蓋僅由這些實施例優(yōu)選構(gòu)成的群組。
[0037]另外，術(shù)語“第一”、“第二”、“第三”或“ (a)，，、“ (b)，，、“ ( c)”、“( d)”、“( i )”、“( ii )”
等以及在說明書中和權(quán)利要求中的類似表述被用于在相似元件之間進(jìn)行區(qū)分，并且不一定用于描述連續(xù)或按時間排列的順序。應(yīng)當(dāng)理解，如此使用的術(shù)語在適當(dāng)情況下是可互換的，并且本文描述的本發(fā)明的實施例能夠以除本文描述或圖示以外的其他次序進(jìn)行操作。
[0038]假如術(shù)語“第一”、“第二”、“第三”或“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”、“(i)”、“(ii)”等涉及方法或使用或化驗的步驟，在所述步驟之間不存在時間或時間間隔一致，即，可以同時實施所述步驟或在這些步驟之間可以有幾秒、幾分鐘、幾小時、幾日、幾周、幾月或甚至幾年的時間間隔，除非在上文或下文中陳述的申請中另有指示。
[0039]應(yīng)當(dāng)理解，由于本文描述的具體方法、協(xié)議、試劑等可以變化，本發(fā)明不限于本文描述的具體方法、協(xié)議、試劑等。也應(yīng)當(dāng)理解，本文使用的詞匯僅僅是出于描述具體實施例的目的，并不意味著限制本發(fā)明的范圍，將僅通過所附的權(quán)利要求限制本發(fā)明的范圍。除非另有定義，本文使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域普通技術(shù)人員中的一個普遍理解的相同的含義。
[0040]如上文已經(jīng)陳述的，在一個方面，本發(fā)明涉及一種用于處理經(jīng)分離的細(xì)胞以使其適于光學(xué)成像的方法，所述方法包括以下步驟:(a)在相變介質(zhì)上沉積包括捕獲到的細(xì)胞的過濾材料；(b)熔化所述相變介質(zhì)，直到介質(zhì)在所述過濾材料下方被分散；以及(c)降低所述相變介質(zhì)的溫度，直到介質(zhì)固化，在固定位置處形成包括所述細(xì)胞的光學(xué)平面過濾器。
[0041]本文使用的術(shù)語“處理經(jīng)分離的細(xì)胞”涉及對一個或更多細(xì)胞的處置和處理，所述一個或更多細(xì)胞從其環(huán)境中已經(jīng)被選擇和/或富集，即，涉及在對細(xì)胞的選擇或富集步驟之后實施的步驟。本文使用的“細(xì)胞”可以是任何類型的細(xì)胞，例如，諸如細(xì)菌細(xì)胞的原核細(xì)胞、或諸如低等真核或原生生物細(xì)胞的真核細(xì)胞、或來源于高等真核生物的細(xì)胞。通常，所述細(xì)胞是來源于哺乳動物的細(xì)胞，優(yōu)選為來源于人類的細(xì)胞。細(xì)胞還可以是來源于家畜或農(nóng)畜的細(xì)胞，例如狗、貓、牛、豬、雞、小鼠、大鼠、雞、或猴細(xì)胞。在具體實施例中，所述細(xì)胞可以來源于體液樣本，諸如全血、血清、血漿、淋巴液、清液。所述細(xì)胞可以備選地來源于醫(yī)學(xué)或法醫(yī)樣本，例如活檢樣本。在其他實施例中，所述細(xì)胞可以來源于植物或真菌，例如來源于愈傷組織培養(yǎng)。在其他實施例中，所述細(xì)胞也可以來源于以下樣本，諸如或包括糞便、淚液、唾液、鼻液、痰液、耳液、生殖器液、胸液、乳液、初乳、胎液、羊水、汗液、滑液、腹水、腦脊液、膽汁、胃液、眼房水、玻璃體液、胃腸液、滲出液、漏出液、胸水、心包液、精液、上呼吸道液、腹膜液、從免疫反應(yīng)的部位獲得的液體、從合并收集部位獲得的液體、支氣管灌洗、或相應(yīng)的抽取物、或尿液、或例如來自全部適當(dāng)?shù)钠鞴?例如肺、肌、腦、肝臟、皮膚、胰、胃等)的活檢材料、有核細(xì)胞樣本、與粘膜表面、毛發(fā)、皮膚相關(guān)聯(lián)的液體。另外，所述細(xì)胞可以來源于環(huán)境資源的樣本，例如水樣本、肉類或家禽樣本、來自潛在污染源的樣本等。
[0042]因此，所述細(xì)胞可以是或來源于任何已知組織類型或組織形態(tài)，例如來源于固體組織，或是可自由移動或獨立的。假如給定固體組織，通過采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當(dāng)?shù)娜芙饧夹g(shù)，例如在適當(dāng)?shù)木彌_溶液或營養(yǎng)液中，可以將細(xì)胞從這樣的結(jié)構(gòu)中溶解。在一些實施例中，可以從樣本中直接獲得細(xì)胞。在其他情況下，樣本可以經(jīng)受例如基于標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議的樣本制備技術(shù)，例如，所述樣本制備技術(shù)包括部分純化。例如，血液樣本可以被離心，排泄物樣本可以被切片并且用生理可接受的緩沖使其均質(zhì)化，并且清洗液、痰液樣本可以被液化和分餾。并且，在具體實施例中，抗生素或殺菌劑可以被添加到樣本中。優(yōu)選使用經(jīng)分離的細(xì)胞，在三維或光學(xué)密集大于一個細(xì)胞層結(jié)構(gòu)或形態(tài)中提供所述經(jīng)分離的細(xì)胞。因此，優(yōu)選使用在一個細(xì)胞層結(jié)構(gòu)或形態(tài)或更開放的結(jié)構(gòu)中提供的細(xì)胞。在具體實施例中，細(xì)胞可以單獨存在，即，作為不直接接觸相鄰細(xì)胞的單個細(xì)胞，或互相協(xié)調(diào)，例如，作為細(xì)胞集聚或細(xì)胞對或細(xì)胞群。優(yōu)選地，細(xì)胞存在于非集聚構(gòu)造中，更優(yōu)選地作為與相鄰細(xì)胞沒有直接接觸的單細(xì)胞。在又一實施例中，如果細(xì)胞存在于集聚構(gòu)造中，或與相鄰細(xì)胞有接觸，尤其當(dāng)這樣的結(jié)構(gòu)攜帶生物相關(guān)性，例如在循環(huán)微栓子的情況下，可以是有利的。
[0043]所述細(xì)胞可以具有任何尺寸、形態(tài)、表面或表面結(jié)構(gòu)，例如所述細(xì)胞包括蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、或糖基化或非糖基化表面實體等。因此，所述細(xì)胞可以具有約0.5到5 μ m的小直徑，或更大，具有約 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25 或 30μπι 或更大的直徑。
[0044]所述細(xì)胞可以是有活性的，例如能夠生長和/或核分裂活躍和/或能夠分裂等；所述細(xì)胞可以是休眠的，例如核分裂不活躍，或不能分裂，但代謝活躍；所述細(xì)胞或是死亡的，例如代謝不活躍。在其他實施例中，根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞可以被分離作為活性細(xì)胞或休眠細(xì)胞，并且在處理期間死亡。在其他實施例中，細(xì)胞可以被分離作為死細(xì)胞。在其他具體實施例中，根據(jù)本發(fā)明，細(xì)胞可以被分離作為活性細(xì)胞，并且在處理或部分處理之后仍有活性。
[0045]可以根據(jù)任何適當(dāng)方法實施所述分離，即，對細(xì)胞的選擇和/或富集。例如，例如通過單、雙或三重過濾設(shè)備可以過濾細(xì)胞。備選地，例如通過表面標(biāo)記和相應(yīng)的配體或結(jié)合分子(諸如抗體)之間的具體相互作用，根據(jù)細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)可以選擇或分離細(xì)胞。在其他實施例中，例如通過細(xì)胞分選設(shè)備，可以根據(jù)形態(tài)和/或尺寸來選擇或分離細(xì)胞。在另一實施例中，例如通過測試細(xì)胞代謝活動，或其核分裂活動，可以根據(jù)其活性來選擇或分離細(xì)胞。在其他實施例中，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的尺寸可以用于選擇，例如核的尺寸或形態(tài)、線粒體、葉綠體、液泡的存在或可檢測性等。
[0046]本文中使用的術(shù)語“適于光學(xué)成像”涉及在高分辨率和具有適當(dāng)顯微鏡裝備(通常具有明視場顯微鏡)的細(xì)胞可被光學(xué)檢測的能力。適于光學(xué)成像的細(xì)胞一般存在于單光學(xué)平面，即，檢測區(qū)域內(nèi)的全部細(xì)胞存在于層，所述層具有約經(jīng)分離的細(xì)胞的平均直徑加上所述直徑的約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 或 110%，優(yōu)選地加上所述直徑的約5%、10%、15%,20%或25%的厚度。額外地或備選地，適于光學(xué)成像的細(xì)胞可以示出關(guān)于其周圍的高對比度。通過染色過程和/或通過使用漫射光源和/或通過消除有關(guān)標(biāo)本的干涉反射，還可以增強這樣的高對比度。
[0047]在所述方法的第一步驟中，過濾材料(包括上文定義的捕獲到的細(xì)胞)被放置在相變介質(zhì)上。本文使用的術(shù)語“過濾材料”涉及能夠承載或支持一個或更多細(xì)胞，優(yōu)選多于
10、50、100、500、1000、5000或10000個細(xì)胞的群的任何材料。所述材料可以是多孔或具有開口，其允許水分子或其他液體分子滲透。所述材料還能夠允許空氣或氧氣分子滲透。在某些實施例中，例如通過提供孔或孔狀結(jié)構(gòu)，其允許某些細(xì)胞、細(xì)胞類型、細(xì)胞尺寸等通過，而保留其他細(xì)胞、細(xì)胞類型或細(xì)胞尺寸，過濾材料可以額外地具有過濾或保留功能。因此，具有過濾或保留功能的過濾材料可以具有任何適當(dāng)?shù)目壮叽纭⒖撞贾?、厚度，?或由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)?shù)牟牧蠘?gòu)成。所述過濾材料可以具有任何適當(dāng)形態(tài)，例如是圓形、橢圓形、矩形、方形、三角形，或具有提到的形態(tài)的混合。優(yōu)選是圓形過濾材料。在其他實施例中，所述過濾材料可以覆蓋連續(xù)、封閉的內(nèi)部區(qū)域，或其備選地是在內(nèi)部區(qū)域內(nèi)具有中心或不對稱孔洞的環(huán)形形態(tài)，或其在內(nèi)部區(qū)域內(nèi)包括兩個或更多開口。
[0048]本文中使用的“相變介質(zhì)”涉及示出了在適于處理生命體的溫度范圍內(nèi)(優(yōu)選在約250C到70°C溫度范圍內(nèi))固相和液相之間的相轉(zhuǎn)變的介質(zhì)。優(yōu)選地，相變介質(zhì)在室溫以上的溫度(例如在高于28°C的溫度)固化。通常對介質(zhì)的能量添加可以誘導(dǎo)相轉(zhuǎn)變。例如，通過使用UV輻射、紅外輻射或直接加熱，可以誘導(dǎo)相轉(zhuǎn)變，即，介質(zhì)變成優(yōu)選粘性的流體。而且，本發(fā)明上下文中使用的相變介質(zhì)還應(yīng)當(dāng)具有在固相是半透明的特性。本文中使用的術(shù)語“半透明”涉及讓應(yīng)用光束的約 50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%通過的能力。另外，或備選地，相變介質(zhì)可以是漫射的。本文使用的詞“漫射”涉及作為可見光漫射器的相變介質(zhì)的能力。因此，介質(zhì)可以有利地一除在單光學(xué)平面存在細(xì)胞之外一有效地消除過濾材料、支撐材料和光學(xué)成像裝備、尤其是顯微鏡載玻片的一側(cè)或兩側(cè)之間的反射。由此，相變介質(zhì)的這些特性對總體圖像質(zhì)量做出貢獻(xiàn)。
[0049]在本發(fā)明的其他實施例中，相變介質(zhì)可以具有約10到IOOym的厚度，例如厚度為 10μηι>15μηι>20μηι>25μηι>30μηι>35μηι>40μηι>45μηι>50μηι>55μηι>60μηι>65μηι>70 μ m、75 μ m、80 μ m、85 μ m、90 μ m、95 μ m、100 μ m或更多、或在提及的值之間的任何值。在
具體實施例中，所述厚度也可以更小。在特定優(yōu)選實施例中，相變介質(zhì)具有約40 μ m的厚度。特定優(yōu)選地調(diào)整相變介質(zhì)的厚度，使得沒有液體相變介質(zhì)穿過過濾材料的孔或開口。在本發(fā)明的其他實施例中，相變介質(zhì)可以覆蓋以上提到的過濾材料的面積的約10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%或更多或在這些值之間的任何比例的面積。
[0050]在優(yōu)選實施例中，相變介質(zhì)初始可以為固體轉(zhuǎn)變狀態(tài)。在固體轉(zhuǎn)變狀態(tài)中，相變介質(zhì)可以具有任何適當(dāng)形態(tài)，例如是圓形、橢圓形、矩形、方形、三角形，或具有提及的形態(tài)的混合。優(yōu)選是圓形相變介質(zhì)。在其他實施例中，相變介質(zhì)可以覆蓋連續(xù)、封閉的內(nèi)部區(qū)域，或其備選地具有在內(nèi)部區(qū)域內(nèi)具有中心或不對稱孔洞的環(huán)形形態(tài)，或其在內(nèi)部區(qū)域內(nèi)包括兩個、三個、4、5、6、7、8或更多開口。在圖5A中描述了本發(fā)明設(shè)想的相變介質(zhì)形態(tài)的范例。
[0051]優(yōu)選地，例如通過使相變介質(zhì)具有與過濾材料相同、基本上相同或相似的形態(tài)、尺寸、面積或直徑，將相變介質(zhì)調(diào)整為過濾材料的尺寸、面積或直徑。在其他實施例中，可以將相變介質(zhì)調(diào)整為過濾材料的尺寸、面積或直徑，使得處于液體轉(zhuǎn)變狀態(tài)中的所述相變介質(zhì)覆蓋與過濾材料相同，基本上相同或相似的面積，和/或具有與過濾材料相同或基本相同或相似的形態(tài)、尺寸或直徑，以便增強在過濾材料下方的相變介質(zhì)的分散和/或減少建立平整表面需要的更高溫度的時間。
[0052]在其他實施例中，相變介質(zhì)可以具有與過濾材料相同、基本相同或相似的形態(tài)，例如，如果過濾材料是圓形的，則相變介質(zhì)也是圓形的，如果過濾材料是矩形形態(tài)，則相變介質(zhì)也可以是矩形等。在其他實施例中，相變介質(zhì)可以具有不同于過濾材料的形態(tài)。優(yōu)選地，相變介質(zhì)可以具有小于過濾材料的尺寸。在優(yōu)選實施例中，相變介質(zhì)可以具有環(huán)形形態(tài)，而過濾材料具有圓形形態(tài)。備選地，相變介質(zhì)可以具有格柵或網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而過濾材料具有矩形形態(tài)等。
[0053]本文中使用的術(shù)語“將過濾材料放置在相變介質(zhì)上”意味著上文定義的過濾材料，尤其包括細(xì)胞或經(jīng)捕獲的細(xì)胞的過濾材料，從過濾或捕獲一個或更多細(xì)胞的部位被轉(zhuǎn)移到相變介質(zhì)所在的部位，優(yōu)選地，在所述部位能夠處理相變介質(zhì)，使得能夠發(fā)生從固相到液相的轉(zhuǎn)變。通常在相變介質(zhì)的頂部提供過濾材料。在具體實施例中，過濾材料可以覆蓋下面的相變介質(zhì)。在某些實施例和情況中，相變材料也可以位于或存在于過濾材料的頂部。在其他具體實施例中，相變材料可以位于圍繞過濾材料的邊緣或環(huán)形形態(tài)，或僅僅部分位于過濾材料下方。在其他實施例中，相變介質(zhì)可以被部分地放置在過濾材料的下方和頂部。在又一實施例中，過濾材料可以以類似三明治的方式被放置在兩層相變介質(zhì)之間，即，一層在過濾材料下面，另一層在過濾材料頂部。如果相變介質(zhì)被用在過濾材料的頂部，或兩側(cè)，優(yōu)選具有薄，或非常薄的一層的相變介質(zhì)，例如不超過捕獲到的細(xì)胞的最大厚度，或捕獲到的細(xì)胞最大厚度的50%、40%、30%、20%、10%。
[0054]在某些實施例中，沉積過程可以被集成在設(shè)備結(jié)構(gòu)或整個處理工作流程內(nèi)。范例是針對過濾或細(xì)胞捕獲處理所需的設(shè)備單元移除和/或針對液體殘留形成過濾材料移除的沉積步驟。在這些實施例中，例如在過濾處理或細(xì)胞捕獲處理期間，相變介質(zhì)可以已經(jīng)存在于初相，或相變介質(zhì)可以替代先前使用的結(jié)構(gòu)，用于實施過濾或細(xì)胞捕獲處理。在優(yōu)選實施例中，整個處理工作流程可以包括使用圖5B中示出的隔室結(jié)構(gòu)，或使用圖4中示出的實體。
[0055]在所述方法的第二步驟中，熔化本文中定義的相變介質(zhì)，直到介質(zhì)被分散在本文中定義的過濾材料下方?？梢愿鶕?jù)相變介質(zhì)的類型、尺寸、厚度、其溫度特性、覆蓋的面積、室溫或任何其他適當(dāng)?shù)膮?shù)來實施熔化步驟?？梢栽O(shè)置熔化溫度為本文中指示的適當(dāng)溫度范圍(例如約37°C到70°C)內(nèi)的高位值，以便提高相轉(zhuǎn)變的速度。在這樣的實施例中，例如由于后續(xù)固定或化學(xué)處理等，細(xì)胞的活性可以不重要。在其他實施例中，可以設(shè)置熔化溫度為更低的值，例如不高于37 - 50°C，優(yōu)選不高于37°C的值。在這個實施例中，細(xì)胞在熔化過程之后可以有活性，并且后續(xù)其可以利用針對活細(xì)胞的具體測試進(jìn)行測試。備選地，例如通過提供適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)等，這樣的細(xì)胞在過濾材料上可以保持存活。熔化期也可以適于相變介質(zhì)的類型、尺寸、厚度、其溫度特性、覆蓋的面積、室溫或任何其他適當(dāng)?shù)膮?shù)。例如，熔化期可以是I秒、5秒、7秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、I分、2分、3分、4分、5分、7分、10分、15分或更多、或在指示值之間的任何值的時段。
[0056]通過任何適當(dāng)?shù)哪芰總鬟f單元，例如通過加熱設(shè)備、UV光源、紅外光源、微波源等可以傳達(dá)相變介質(zhì)的熔化。在具體實施例中，根據(jù)本發(fā)明的能量傳遞單元可以位于過濾材料附近，或設(shè)備或裝置結(jié)構(gòu)內(nèi)。優(yōu)選的能量源是珀耳帖(Peltier)元件。
[0057]在本發(fā)明的具體實施例中，從外部例如以注射器的方式或經(jīng)由連接到過濾材料的流體可以提供熔化的相變介質(zhì)。在這些實施例中，由于在離過濾材料某個距離處實施溫度升高活動，以上提及的沉積步驟不是必要的。借助于閥門、泵送單元、管道實體或任何其他微流體輸送裝置，熔化的相變介質(zhì)還可以被輸送到過濾材料。在具體實施例中，輸送處理可以被集成在微流體設(shè)備或裝置的工作流程內(nèi)。
[0058]本文中使用的術(shù)語“相變介質(zhì)分散在過濾材料下方”涉及相變介質(zhì)完全或基本完全散布在過濾材料的整個區(qū)域。優(yōu)選地，相變介質(zhì)的分散或散布導(dǎo)致在過濾材料的全部區(qū)域中基本相同厚度和密度的等平面介質(zhì)層。分散相變介質(zhì)可以優(yōu)選無氣泡，或基本無氣泡。
[0059]在本發(fā)明的其他備選實施例中，相變介質(zhì)的散布或分散也能夠位于過濾材料的具體區(qū)，例如過濾材料的中心、過濾材料的遠(yuǎn)區(qū)、過濾材料上細(xì)胞所在的區(qū)，例如在過濾材料上僅僅非常少的細(xì)胞存在的場景，或過濾材料的任何其他區(qū)。在其他實施例中，例如通過提供傳送熔化的相變介質(zhì)的過濾結(jié)構(gòu)，可以預(yù)確定區(qū)。
[0060]在本發(fā)明的其他具體實施例中，例如在相變介質(zhì)未完全分散在過濾材料的整個區(qū)域的情況下，或在介質(zhì)層不具有基本相同厚度的情況下，本文中定義的熔化步驟可以重復(fù)一次或更多次。
[0061]在所述方法的第三步驟中，降低溫度，直到相變介質(zhì)固化。根據(jù)相變介質(zhì)的熔化和/或分散的程度、其溫度特性、覆蓋的面積、室溫或任何其他適當(dāng)?shù)膮?shù)，可以實施溫度降低步驟。通過溫度降低活動可以達(dá)到的最終溫度可以被設(shè)置為本文中指示的適當(dāng)?shù)臏囟确秶?，例如約4°C - 35 °C。最終溫度可以優(yōu)選被設(shè)置為約4、8、10、20、22、24、25或26 °C的低溫，以便提高相變介質(zhì)向固相的相轉(zhuǎn)變速度。通過主動冷卻處理,例如,通過將熔化的介質(zhì)冷卻到指示的溫度，或通過終止加熱或熔化處理，例如通過停止加熱、UV光或紅外光、或微波設(shè)備并且讓相變介質(zhì)的溫度適于周圍溫度或室溫，可以實施溫度的降低。
[0062]在其他實施例中，例如通過在5°C、10°C、15°C或20°C的跳躍降低溫度，或通過直接降低(即，冷卻到最終溫度)，可以以級聯(lián)方式實施溫度降低步驟。本領(lǐng)域技術(shù)人員將已知并且本發(fā)明也設(shè)想其他降低模式或溫度減少程序。
[0063]在本發(fā)明的某些具體實施例中，溫度的級聯(lián)降低可以與部分溫度升高結(jié)合。例如溫度降低為10°c之后，可以執(zhí)行5°C的升高，隨后溫度進(jìn)一步減少等。
[0064]當(dāng)相變介質(zhì)不包括或基本不包括液體區(qū)間或區(qū)域時,相變介質(zhì)可以被認(rèn)為是固化的。
[0065]通過任何適當(dāng)?shù)睦鋮s設(shè)備可以傳達(dá)相變介質(zhì)的溫度降低。在具體實施例中，這樣的冷卻設(shè)備可以位于過濾材料附近，或設(shè)備或裝置結(jié)構(gòu)內(nèi)。優(yōu)選的冷卻設(shè)備是珀耳帖元件。在其他優(yōu)選實施例中，珀耳帖元件可以用于熔化步驟和后續(xù)的冷卻步驟。而且，可以指導(dǎo)珀耳帖元件來執(zhí)行本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的具體熔化和冷卻程序。
[0066]可以實施相變介質(zhì)的溫度降低步驟，使得過濾材料被轉(zhuǎn)換為光學(xué)平面過濾器，優(yōu)選為包括在單光學(xué)平面存在的細(xì)胞的過濾器，即，檢測區(qū)域內(nèi)的全部細(xì)胞存在于層，所述層具有約經(jīng)分離的細(xì)胞的平均直徑加上所述直徑的約5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 或 110%，優(yōu)選地加上所述直徑的約 5%、10%、15%,20% 或 25% 的厚度。
[0067]在其他優(yōu)選實施例中，由于在相變介質(zhì)中細(xì)胞的嵌入，所述細(xì)胞可以在過濾器上的固定位置。例如對顯微鏡中經(jīng)處理的過濾器的第一輪分子分析之后等，可以檢測并且記住這個固定位置，以便允許后續(xù)分析步驟。由此，經(jīng)由顯微鏡分析開放對具體細(xì)胞的識別和選擇，所述固定位置允許經(jīng)識別的細(xì)胞的后續(xù)移除或標(biāo)簽，例如以進(jìn)行其他個體測試。[0068]在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，上文中定義的方法額外地包括在過濾材料上捕獲細(xì)胞的初始步驟。通過任何適當(dāng)?shù)难b置可以執(zhí)行在過濾器上“捕獲”一個或更多細(xì)胞，導(dǎo)致在上或下文定義的過濾材料上存在細(xì)胞。在一個實施例中，通過過濾處理可以實施捕獲，例如經(jīng)由采用壓力傳遞系統(tǒng)，或例如在流體或微流體系統(tǒng)或設(shè)備中使用流體流。在其他實施例中，可以根據(jù)其表面結(jié)構(gòu)通過選擇或分離細(xì)胞來執(zhí)行在過濾材料上捕獲細(xì)胞，例如通過表面標(biāo)記和相應(yīng)的配體或結(jié)合分子(諸如抗體)之間的具體相互作用。優(yōu)選為基于例如上皮黏附分子(EpCAM)的黏附技術(shù)。由本發(fā)明設(shè)想的這些技術(shù)的不同實施方式對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是已知的。一個優(yōu)選實施例是例如基于磁流體納米粒子的免疫磁性選擇處理。在其他實施例中，繼富集和/或培養(yǎng)步驟之后可以捕獲細(xì)胞。而且，可以富集或具體處理細(xì)胞，以便在成像之前移除潛在過量的免疫磁性粒子。
[0069]在具體實施例中，通過使用過濾材料或排除不同尺寸或形態(tài)的細(xì)胞的過濾器組，可以實現(xiàn)捕獲不同尺寸、具體起源、或具體表面構(gòu)成等的細(xì)胞。例如，為了捕獲小細(xì)胞，諸如細(xì)菌細(xì)胞，可以使用一個或兩個或三個過濾器組。在測試環(huán)境樣本的情況下，使用具有恰當(dāng)孔尺寸的一個過濾器組可以是有利的。在使用血液或其他體液的情況下，使用兩個或多于兩個的過濾器機構(gòu)可以是有利的，其中，一個過濾器捕獲大的，例如人類細(xì)胞，而具有更小孔的第二過濾器捕獲細(xì)菌細(xì)胞。可以從適當(dāng)?shù)某霭嫖?，例如Sage和Neece，1984，J ClinMicrobiol, 20 (I):5 - 8中獲得其他細(xì)節(jié)。
[0070]在優(yōu)選實施例中，過濾材料可以能夠尺寸排阻細(xì)胞，使其從環(huán)境，例如從流體或溶液，通常從血液樣本中分離。通過過濾材料的具體孔或開口尺寸可以實現(xiàn)尺寸排阻。另外，孔形態(tài)是圓柱形、圓形、橢球形、矩形或菱形。另一相關(guān)參數(shù)是在過濾或捕獲處理期間的流速或流體壓力。例如，流速可以在從每分鐘50ml到0.1ml的范圍內(nèi)。然而，本發(fā)明也設(shè)想在指示的范圍以下或以上的其他流速。另外，可以修改3維孔形態(tài)，以便實現(xiàn)具體尺寸和/或靈活排除。在具體實施例中，優(yōu)選使用過濾材料，其允許保留細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性，即，以捕獲完整細(xì)胞和/或有活性的細(xì)胞。在備選實施例中，可以使用不必要保留細(xì)胞膜完整性的過濾材料。因此，過濾材料和任選的過濾過程或過濾參數(shù)可以適于應(yīng)當(dāng)被捕獲的細(xì)胞尺寸，和/或捕獲到的細(xì)胞的功能要求，即，是完整的或有活性的等。
[0071]在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，過濾材料可以具有約0.5到20 μ m的孔尺寸，例如孔X ^ ^ 0.5 μ m>0.75 μ m> I μ m>2 μ m>3 μ m>4 μ m>5 μ m>6 μ m>7 μ m>8 μ m>9 μ m> 10 μ m>114!11、124 111、134 111、144 111、154 111、164 111、174 111、184 111、1941]1或20 41]1或更多、或指不值之間的任何值。根據(jù)要分離的細(xì)胞可以選擇孔尺寸。在本發(fā)明的其他具體實施例中，過濾材料或在過濾過程內(nèi)實現(xiàn)的過濾材料可以具有約0.5到20 μ m的尺寸排阻，例如約0.5 μ m、
0.75um、lum、2um、3um、4um、5um、6um、7um、8um、9um、10um、llum、12um、13um、14 μ m、15 μ m、16 μ m、17 μ m、18 μ m、19 μ m或20 μ m或更多、或在指示值之間的任何值的尺寸排阻。本文中使用的術(shù)語“尺寸排阻”意味著具有約5μπι和更大的平均直徑的細(xì)胞，例如5 μ m值的細(xì)胞在過濾材料上被捕獲，而具有小于5 μ m平均直徑的細(xì)胞通過過濾器并且不被捕獲。
[0072]對于捕獲細(xì)菌細(xì)胞，優(yōu)選地使用約0.5 μ m到4 μ m孔尺寸的過濾材料。對于捕獲無血小板的血液成分，優(yōu)選地使用約4μπι到IOym孔尺寸的過濾材料。對于捕獲無紅血球的血液成分，優(yōu)選地使用約7 μ m到12 μ m孔尺寸的過濾材料。對于捕獲腫瘤細(xì)胞，可以使用約8μπι到20 μ m的較大孔尺寸。對于腫瘤細(xì)胞的分離，尤其對于上皮腫瘤細(xì)胞的分離，具體優(yōu)選使用8μπι的孔尺寸，其被認(rèn)為是恰當(dāng)?shù)目壮叽纭Ｔ谄渌唧w實施例中，還可以從樣本中(例如從溶解宿主細(xì)胞的懸浮液中)捕獲或分離病毒顆粒、病毒或噬菌體。對于這樣的捕獲過程，可以使用約20nm到300nm的孔尺寸,更優(yōu)選約20nm到約50nm。相應(yīng)的過濾器可以是尺寸排阻/病毒移除過濾器，諸如頗爾公司銷售的多孔環(huán)氧纖維過濾器。如果將要捕獲或分離的是病毒、病毒顆粒或噬菌體，則過濾器優(yōu)選與具有更大孔尺寸的預(yù)過濾器進(jìn)行組合。本發(fā)明的優(yōu)勢是，例如病毒顆粒的AFM和/或STM研究在很大程度上得益于通過根據(jù)本發(fā)明的所述方面創(chuàng)建的均勻的、非常平整的表面。
[0073]在優(yōu)選實施例中，使用的過濾材料由彈性和/或耐液壓和/或化學(xué)惰性的材料構(gòu)成，即，不與樣本內(nèi)的生物或生化成分反應(yīng)和/或耐例如約-80°C到+130°C范圍內(nèi)的溫度變化。而且，過濾材料可以耐UV輻射。
[0074]在優(yōu)選實施例中，過濾材料可以是適當(dāng)?shù)木酆喜牧?。聚合材料的?yōu)選范例是聚碳酸酯、尼龍或聚對二甲苯。例如，在使用兩層或更多層過濾器的情況下，也設(shè)想是相似材料，或衍生物或其組合。在其他優(yōu)選實施例中，過濾材料可以是適當(dāng)?shù)姆蔷酆喜牧稀７蔷酆喜牧系膬?yōu)選范例是硅。例如，在使用兩層或更多層過濾器情況下，也設(shè)想是相似材料，或衍生物或聚合材料和非聚合材料的組合。在本發(fā)明的其他優(yōu)選實施例中，過濾材料可以是由以3維方式布置的聚對二甲苯部分構(gòu)成的3D微型過濾器，3D微型濾波器在孔開口下下方包括系船柱狀的結(jié)構(gòu)，例如從Zheng等,2011, BiomedMicrodevices, 13:203 - 213中可獲得。在本發(fā)明的具體優(yōu)選實施例中，過濾材料是聚碳酸酯過濾器，更優(yōu)選Whatman Cyclopore跟蹤蝕刻膜過濾器，甚至更優(yōu)選具有8 μ m孔的Whatman Cyclopore跟蹤蝕刻膜過濾器。
[0075]在本發(fā)明的其他優(yōu)選實施例中，上文中定義的相變介質(zhì)是在約25°C到70°C的溫度范圍內(nèi)熔化和/或固化的介質(zhì)。例如相變介質(zhì)可以在約25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70°C的溫度或在這些值之間的任何溫度熔化。而且，相變介質(zhì)可以在約 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70°C的溫度或在這些值之間的任何溫度固化。本文中使用的術(shù)語“熔化”涉及相變介質(zhì)完全或基本完全從固相轉(zhuǎn)變?yōu)橐合嗟哪芰Α１疚闹惺褂玫男g(shù)語“固化”涉及相變介質(zhì)完全或基本完全從液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔嗟哪芰?。?yīng)注意，對于相同的相變介質(zhì)，即，具有清晰定義的分子成分的相變介質(zhì)，例如石蠟，其物理相轉(zhuǎn)變特性是相同的。由此，對于這樣的相變介質(zhì)，該介質(zhì)的熔化溫度與其固化溫度相同。然而，本發(fā)明涵蓋不同相變介質(zhì)的使用，其可以從具有以上指示的熔化和固化溫度范圍的介質(zhì)中選擇。
[0076]在本發(fā)明的其他優(yōu)選實施例中，相變介質(zhì)包括多孔、網(wǎng)狀、開放、或部分開放的結(jié)構(gòu)。例如，相變介質(zhì)可以具有某個厚度的3維結(jié)構(gòu)，允許存在開口或空腔。在優(yōu)選實施例中，這樣的開口可以具有通道、通路或管元件形態(tài)。這些結(jié)構(gòu)可以能夠在相變介質(zhì)的全部分區(qū)或區(qū)域之間提供連通性，例如，對于流體和/或?qū)τ跉鈶B(tài)實體(例如對于空氣)的連通性。優(yōu)選地，這樣的結(jié)構(gòu)或元件允許流體通過相變介質(zhì)的空腔。
[0077]例如，通過從大量緊密的相變介質(zhì)中刻出或切出相應(yīng)的分區(qū)可以提供空腔、開口或通道結(jié)構(gòu)。備選地，當(dāng)熔化或液體材料放入相應(yīng)的模具可以燒鑄相變介質(zhì)，并且隨后使其固化，然后抽取模具。備選地，通過在特定位置局部地熔掉或燃掉材料，激光或激光設(shè)備可以用于切出結(jié)構(gòu)。
[0078]假如過濾材料位于所述相變介質(zhì)上，或與其連接，相變介質(zhì)的多孔、網(wǎng)狀、開放或部分開放的結(jié)構(gòu)和/或通道、通路或管元件的存在可以用于將流體或溶液(例如營養(yǎng)液)遞送到所述過濾材料上捕獲的細(xì)胞。通過使用相變介質(zhì)的連通性特點，在本文中描述的過濾材料上培養(yǎng)捕獲到的細(xì)胞，尤其有活性的捕獲到的細(xì)胞變得可能。由此，在約30分鐘到幾周的時間段內(nèi)，提供誘導(dǎo)或抑制因子、選定的營養(yǎng)素等，捕獲到的細(xì)胞可以保持活性。而且，例如通過使用標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)方法(諸如胰蛋白酶化)，培養(yǎng)之后，細(xì)胞可以從過濾器上移除，并且隨后被轉(zhuǎn)移到標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶。經(jīng)由光學(xué)成像過程，可以分析捕獲到的細(xì)胞，或如本文中描述的進(jìn)行處理等。通常，例如過濾材料沉積在相變介質(zhì)上之后，即，任何熔化步驟之前，相變介質(zhì)的多孔、網(wǎng)狀、開放、或部分開放結(jié)構(gòu)可以存在于固化狀態(tài)。繼本文定義的熔化步驟之后，相變介質(zhì)可以失去其多孔、網(wǎng)狀、開放、或部分開放結(jié)構(gòu)，并且轉(zhuǎn)換為光學(xué)平面過濾器。在具體實施例中，然而，在已經(jīng)熔化和固化之后，相變介質(zhì)仍可以包括多孔、網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)或至少部分開放的結(jié)構(gòu)。例如，這樣的結(jié)構(gòu)可以存在于具體區(qū)域，同時其他區(qū)域示出光學(xué)平面結(jié)構(gòu)。
[0079]在本發(fā)明的優(yōu)選實施例中，本文中描述的相變介質(zhì)是烴蠟。術(shù)語“烴蠟”涉及具有CnH2n+2 (n=20到40)分子式的碳?xì)浠衔锘蛱細(xì)浠衔锏幕旌衔?，或具有其他分?優(yōu)選為其他有機分子)的這些碳?xì)浠衔锏幕旌衔铩＠?，烴蠟可以由飽和η -和異烷烴和/或環(huán)烷和/或烷基-和環(huán)烷取代的芳香化合物和/或環(huán)烴的混合物構(gòu)成。在烴蠟中包括的烷烴或其他分子可以含支鏈或不含支鏈，或包括含支鏈和不含支鏈分子的混合物。含支鏈分子可以具有不同程度的支鏈，或有不同程度的支鏈，例如所述含支鏈分子包括1、2、3或更多支鏈，或支鏈中還含支鏈，即具有1、2、3或更多二級生成支鏈。在優(yōu)選實施例中，相變介質(zhì)是石蠟?！笆灐弊畲蟀ㄌ?xì)浠衔锘蚓哂蠧nH2n+2 (n=20到40)分子式的碳?xì)浠衔锏幕旌衔铩Ｏ嘧兘橘|(zhì)的其他設(shè)想的和潛在有用的范例包括具有CnH2n+2 (n=24到36，或n=24)、CnH2n+2 (n=25)、CnH2n+2 (n=26)、CnH2n+2 (n=27)、CnH2n+2 (n=28)、CnH2n+2 (n=29)、CnH2n+2 (n=30)、CnH2n+2 (n=31)、CnH2n+2 (n=32)、CnH2n+2 (n=33)、CnH2n+2 (n=34)、CnH2n+2 (n=35)、CnH2n+2 (n=36)、CnH2n+2 (n=37)、CnH2n+2 (n=38)、CnH2n+2 (n=39)、CnH2n+2 (n=40)、CnH2n+2 (n=41 )、CnH2n+2 (n=42)、CnH2n+2 (n=43)、CnH2n+2 (n=44)、或CnH2n+2 (n=45)分子式的分子，或這些分子的任何混合物。這樣的混合物可以以任何適當(dāng)?shù)谋壤嬖冢龌旌衔锇?、3、4、5、6、7、8、9、10種或更多分子，包括占量的5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%的分子并且包括占相應(yīng)的量的第二或其他分子。
[0080]在另一優(yōu)選實施例中，相變介質(zhì)是無序材料，其具有一致的光散射特性。該材料組的設(shè)想范例是Cltl到C2tl有機酸，例如，癸酸到花生酸。所述組也可以包括具有不同碳鏈長度的酯類和醇類。在其他實施例中，相變介質(zhì)可以由基于狄爾斯阿爾德(Diels-Alder)機制的可逆系統(tǒng)構(gòu)成。
[0081 ] 在本發(fā)明的其他具體實施例中，相變介質(zhì)可以是動物蠟或植物蠟。通常，蠟是通過若干植物或動物進(jìn)行生物合成，并且可以包括蠟酯、蠟酸、蠟醇和碳?xì)浠衔铩Ｏ烏タ梢詮母鞣N羧酸和各種脂肪醇中獲得。動物蠟的成分可以取決于物種和有機體的地理位置。動物蠟的范例包括蜂蠟，或其他昆蟲分泌的蠟，以及抹香鯨蠟。植物蠟的范例包括源于巴西棕櫚的巴西棕櫚蠟，以及小燭樹蠟、小冠椰子蠟、甘蔗蠟或藤蔓蠟。植物蠟可以優(yōu)選為植物的表皮蠟，其包括取代的長鏈脂肪烴的混合物，或所述植物蠟含有烷烴、脂肪酸、伯醇和仲醇、二醇、酮和/或醛。在本發(fā)明的其他優(yōu)選實施例中，相變介質(zhì)可以被安裝在載體上。
[0082]本文中使用的術(shù)語“載體”涉及允許支撐相變介質(zhì)的任何結(jié)構(gòu)。所述載體應(yīng)當(dāng)優(yōu)選為對本文所述的用于熔化/固化過程的溫度有抵抗力的。另外，或備選地，例如在相變介質(zhì)的上下文中上文所述的，載體可以是半透明的。由此，例如對于太陽光光譜和/或?qū)τ谔柟獾牟ㄩL的光譜內(nèi)或太陽光的波長的光譜外的特定波長范圍，載體可以是半透明的。這類波長的范例包括紫外光的波長。從而，在過濾材料上捕獲到的細(xì)胞的光學(xué)成像可以變得可行。
[0083]優(yōu)選的載體是玻璃載體。也優(yōu)選是由聚合物或塑性材料(例如由熱塑性塑料或彈性材料)構(gòu)成的載體。本文中使用的術(shù)語“熱塑性塑料”涉及熱軟化塑料聚合物，當(dāng)加熱時其變成液體，并且當(dāng)充分冷卻時凍結(jié)到玻璃狀態(tài)。熱塑性塑料可以是高分子量聚合物，其鏈通過弱范德華力、更強的偶極-偶極相互作用和氫鍵、或芳環(huán)進(jìn)行關(guān)聯(lián)。熱塑性塑料的范例包括丙烯睛一丁二烯一苯乙烯共聚物(ABS)、丙烯酸(PMMA)、賽璐珞、醋酸纖維素、環(huán)烯共聚物(C0C)、乙烯-醋酸乙烯酯(EVA)、乙烯醇(EV0H)、氟塑料(PTFE、與FEP、PFA、CTFE,ECTFE, ETFE)、離聚物、丙烯酸/PVC合金、液晶聚合物(LCP)、聚縮醛(Ρ0Μ或縮醛)、聚丙烯酸酯(丙烯酸)、聚丙烯腈(PAN或丙烯腈)、聚酰胺(PA)、聚酰胺-酰亞胺(PAI)、聚芳醚酮(PAEK或酮)、聚丁二烯(PBD)、聚丁烯(PB)、聚對苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚三氟氯乙烯(PCTFE)、聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚亞環(huán)己基對苯二甲酸乙二醇酯(PCT)、聚碳酸酯(PC)、聚羥基烷酸(PHAs)、聚酮(PK)、聚酯、聚乙烯(PE)、聚醚醚酮(PEEK)、聚醚酮酮(PEKK)、聚醚酰亞胺(PEI)、聚醚砜(PES)、氯化聚乙烯(PEC)、聚酰亞胺(PI)、聚乳酸(PLA)、聚甲基戊烯(PMP)、聚苯醚(ΡΡ0)、聚苯硫醚(PPS)、苯丙醇胺(PPA)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚砜(PSU)、聚對苯二甲酸丙二醇酯(PTT)、聚氨酯(PU)、聚乙烯酯(PVA)、聚氯乙烯(PVC)、聚偏二氯乙烯(PVDC)、和苯乙烯丙烯腈(SAN)。本文中使用的術(shù)語“彈性材料”涉及具有粘彈特性的聚合物，其中，鏈接以形成聚合物的單體，通常由碳、氫、氧和/或硅制成。彈性材料可以是在其玻璃轉(zhuǎn)變溫度以上存在的非晶態(tài)聚合物，使得相當(dāng)大的鏈段運動是可能的。在環(huán)境溫度下，它們可以比較柔軟并且可變形。彈性材料的范例包括合成聚異戊二烯(IR)、聚丁二烯(BR)、丁苯橡膠(聚苯乙烯和聚丁二烯的共聚物、SBR)、丁腈橡膠(聚丁二烯和丙烯腈的共聚物、NBR)、氫化丁腈橡膠(HNBR)、氯丁橡膠(CR)、聚氯丁烯、氯丁橡膠、EPM (乙烯丙烯橡膠，乙烯和丙烯的共聚物)、氯醚橡膠(ECO)、聚丙烯酸酯橡膠(ACM、ABR)、硅橡膠(S1、Q、VMQ)、氟硅橡膠(FVMQ)、氟橡膠(FKMJP FEPM)、氟化橡膠、Tecnoflon,氟橡膠(Fluorel)、四丙氟橡膠、全氟醚橡膠(FFKM)、Tecnoflon PFR、全氟化橡膠、密封圈、Perlast、聚醚嵌段酰胺(PEBA)、氯磺化聚乙烯(CSM)、乙烯-醋酸乙烯酯(EVA)、熱塑性彈性體(TPE)、Elastron、熱塑性烯烴(TP0)、節(jié)肢彈性蛋白、彈性蛋白和聚硫橡膠。[0084]在具體實施例中，載體可以由從聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯和聚環(huán)烯的群組中選擇的有機聚合物構(gòu)成。本文中使用的“聚乙烯”涉及由單體乙烯的長鏈構(gòu)成的聚合材料。聚乙烯材料可以以不同形態(tài)的密度和/或支鏈存在。聚乙烯材料的范例包括超高分子量聚乙烯(UHMWPE)、超低分子量聚乙烯(ULMWPE或PE-WAX);高分子量聚乙烯(HMWPE)；高密度聚乙烯(HDPE )；高密度交聯(lián)聚乙烯(HDXLPE )；交聯(lián)聚乙烯(PEX或XLPE )；中密度聚乙烯(MDPE);線性低密度聚乙烯(LLDPE);低密度聚乙烯(LDPE)和超低密度聚乙烯(VLDPE)。本文使用的“聚丙烯”涉及由單體丙烯單元構(gòu)成的熱塑性聚合物。聚丙烯的范例包括聚丙烯均聚物、無規(guī)聚丙烯共聚物和嵌段聚丙烯共聚物。丙烯也可以包括聚丙烯衍生物，其包括聚丙烯單元和乙烯或聚乙烯單元。本文中使用的“聚苯乙烯”涉及由芳香族單體苯乙烯制成的芳香族聚合物。聚苯乙烯的范例包括等規(guī)聚苯乙烯、無規(guī)聚苯乙烯和間規(guī)聚苯乙烯。本文中使用的“聚碳酸酯”涉及包括碳酸酯組的熱塑性聚合物。聚碳酸酯可以從雙酚A和碳酰氯的組合(雙酚A和碳酸二苯酯的酯交換)中獲得。在一個實施例中，聚碳酸酯材料可以是透明的。本文中使用的“聚環(huán)烯”涉及包含多于一個碳原子閉環(huán)但不具有芳香族特性的烯烴碳?xì)浠衔?。例如，聚環(huán)烯可以由單體烯烴(諸如環(huán)丙烯、環(huán)丁烯、環(huán)戊烯、環(huán)己烯、環(huán)庚烯、1，3_環(huán)己二烯、1，4-環(huán)己二烯或1，5-環(huán)辛二烯)構(gòu)成。在其他實施例中，載體可以包括適于光學(xué)儀器(例如鏡頭、鏡片、太陽鏡、接觸鏡等)生產(chǎn)的材料。這種材料的范例是具有高折射率的材料，例如具有高折射率的塑料材料。例如，適于光學(xué)儀器生產(chǎn)的塑料材料的群組包括聚碳酸脂塑料，諸如聚碳酸烷基乙二醇酯(PADC)或CR - 39或其衍生物。
[0085]在典型實施例中，所述載體是用于標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡的載玻片。
[0086]在本發(fā)明的其他實施例中，上文中定義的載體可以包括或可以額外地包括位置標(biāo)記。本文中使用的術(shù)語“位置標(biāo)記”涉及標(biāo)記、網(wǎng)格、線系、維數(shù)或長度指示、數(shù)字或字母代碼、條形碼、矩陣代碼或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他適當(dāng)標(biāo)記，其允許確定細(xì)胞的位置、其尺寸或直徑、到相鄰細(xì)胞的距離等。在具體實施例中，位置標(biāo)記可以是在具體波長下誘導(dǎo)的可檢測的位置標(biāo)記。例如，當(dāng)利用波長為約540nm、550nm、560nm、570nm、580nm、590nm、600nm、610nm、620nm、630nm、640nm、650nm、660nm、670nm、680nm、690nm、7OOnm 或更高的光進(jìn)行激發(fā)時，位置標(biāo)記可以是可檢測的。另外，可以存在物理標(biāo)記，以便于STM顯微鏡的 AFM。
[0087]在本發(fā)明的又一優(yōu)選實施例中，本文中描述的用于處理經(jīng)分離的細(xì)胞的方法包括將在經(jīng)分離的細(xì)胞上實施的活動，作為額外步驟。在相變介質(zhì)已經(jīng)被熔化和固化之前，可以在過濾材料上捕獲到的細(xì)胞上執(zhí)行這樣的活動，或在相變介質(zhì)熔化和固化之后可以執(zhí)行這樣的活動。因此，根據(jù)本發(fā)明，例如在設(shè)備之內(nèi)原位可以實施所述活動，或其在不同地點(例如在具體實驗室、不同設(shè)備等)可以執(zhí)行所述活動。因此，所述活動可以適于具體情況，例如存在或不存在相變介質(zhì)、存在額外的實體諸如載體。另一設(shè)想是，例如在微流體系統(tǒng)或環(huán)境中活動的自動化或半自動化。例如，活動步驟可以由機器人實施，或由包括計算機控制單元控制的機械移動部件的系統(tǒng)實施。
[0088]在一個實施例中，所述活動可以是固定活動。本文中使用的“固定”被理解為后續(xù)染色的準(zhǔn)備步驟，并且可以取決于規(guī)劃的分析類型。通常，固定的目的在于盡可能多地保留細(xì)胞的形狀。在某些實施例中，固定可以是用于殺死、粘附和改變細(xì)胞的加熱固定，以便允許細(xì)胞接受染色。備選地，細(xì)胞可以通過風(fēng)干來固定。在又一備選方案中，可以執(zhí)行化學(xué)固定?；瘜W(xué)固定的設(shè)想范例是甲醛、乙醇、甲醇和/或苦味酸的使用。在其他實施例中，固定可以跟隨抗原修復(fù)技術(shù)，諸如短暫暴露到微波輻射的短加熱。
[0089]在又一實施例中，所述活動可以是染色活動。本文中使用的“染色”涉及特定類(例如特定的DNA、蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物)染料添加到細(xì)胞或包括過濾材料的細(xì)胞，以對該類化合物的存在進(jìn)行定性和/或定量。所述術(shù)語也包括例如利用熒光標(biāo)簽或標(biāo)記進(jìn)行熒光標(biāo)注。在活體中，即利用活細(xì)胞，優(yōu)選地利用如本文中描述的過濾材料上原位培養(yǎng)的細(xì)胞，或用在本文所述的過濾材料上捕獲到的活細(xì)胞，可以實施染色。在典型實施例中，利用上文中定義被固定的細(xì)胞實施染色。染色過程可以適于存在于過濾材料上的細(xì)胞類型。例如，可以根據(jù)革蘭氏染色過程或通過抗酸染色對細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行染色。又一設(shè)想染色過程包括蘇木精和伊紅染色、巴氏染色、PAS染色、馬森(Masson)三色染色、羅馬諾夫斯基(Romanovsky)染色、銀染色或康克林(Conklin)染色。又一設(shè)想的染色途徑包括利用吖啶橙、俾斯麥棕、胭脂蟲紅、考馬斯藍(lán)、結(jié)晶紫、DAP1、伊紅、溴化乙啶、酸性品紅、赫斯特染色、碘、孔雀綠、甲基綠、中性紅、尼羅藍(lán)、尼羅紅、四氧化鋨、羅丹明或番紅染色進(jìn)行染色。例如通過使用熒光標(biāo)簽或標(biāo)記和/或經(jīng)突光標(biāo)注的抗體或通過經(jīng)標(biāo)注或可識別的第二抗體識別的抗體，染色還可以包括熒光標(biāo)注或分子標(biāo)注。例如，這能夠使用適當(dāng)標(biāo)簽來實現(xiàn)，根據(jù)本發(fā)明所述適當(dāng)?shù)臉?biāo)簽?zāi)軌蚬曹椀綑z測分子，其能夠識別表面上或過濾材料上捕獲到的細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)或?qū)嶓w。適當(dāng)標(biāo)簽的范例包括熒光染料(例如熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、熒光胺)、發(fā)色團(tuán)染料(例如視網(wǎng)膜紅質(zhì))、化學(xué)發(fā)光化合物(例如魯米那、咪唑)和生物發(fā)光蛋白質(zhì)(例如熒光素、熒光素酶、綠色熒光蛋白質(zhì)、黃色熒光蛋白質(zhì)、其衍生物)。諸如抗體的檢測分子可以進(jìn)一步利用熒光標(biāo)簽如FITC、6 - FAM、HEX、TET, ROX, Cy3、Cy5、德克薩斯紅和/或同時利用淬火標(biāo)簽如TAMRA、淬滅劑、黑洞猝光劑、BHQ -1或BHQ - 2進(jìn)行標(biāo)記。檢測分子也可以優(yōu)選地利用酶或酶域生成發(fā)光、熒光或電化學(xué)信號進(jìn)行標(biāo)記。這種酶的具體優(yōu)選范例包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶和β -內(nèi)酰胺酶。在其他實施例中，檢測分子可以利用放射性同位素(例如3H、14C、32P、33P、35S、1251、nC、13N、150、18F、64Cu、62Cu、1241、76Br、82Rb、68Ga 或 18F)或粒子(例如金)進(jìn)行標(biāo)記。使用各種化學(xué)反應(yīng)(例如胺反應(yīng)或硫醇反應(yīng))，不同類型的標(biāo)簽可以被共軛到檢測分子。然而，除了胺和硫醇之外，還能夠使用其他反應(yīng)基，例如醛、羧酸和谷氨酰胺。在具體優(yōu)選實施例中，利用被連接到的任何提到的熒光染色劑，更優(yōu)選為被連接到FITC標(biāo)簽的反EpCAM抗體，可以實施染色。又一具體優(yōu)選是針對DNA或RNA分子使用Syto9染色劑。
[0090]在又一實施例中，所述活動可以是對細(xì)胞的機械操縱。本文中使用的“機械操縱”涉及對于細(xì)胞、細(xì)胞群或據(jù)本發(fā)明在根過濾材料上捕獲到的全部或基本全部細(xì)胞的任何外部干預(yù)。外部干預(yù)可以包括細(xì)胞的機械開口、細(xì)胞的物理移動或旋轉(zhuǎn)。由于對于細(xì)胞或細(xì)胞群采用電流、液體流、使用壓力、采用溫度增加或降低，因此又一設(shè)想是物理干預(yù)。例如，例如在微流體系統(tǒng)或細(xì)胞制備系統(tǒng)的環(huán)境中，通過機器人或半機器人實體，可以實施這樣的活動。
[0091]在又一具體實施例中，所述活動可以是包括細(xì)胞釋放活動的機械操縱。本文中使用的術(shù)語“釋放”涉及抽取來自過濾材料的一個或更多具體細(xì)胞或細(xì)胞群。在熔化/固化過程之前、期間或之后，或者在染色或光學(xué)分析過程之前、期間或之后，可以執(zhí)行所述抽取。例如，在測試標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)潛在感興趣或注意到的通過活體染色檢測的細(xì)胞，可以從過濾材料中釋放，隨后被輸送到不同載體或介質(zhì)(例如培養(yǎng)基)，并且利用不同方法進(jìn)行分析，或被培養(yǎng)和放大，用于后續(xù)分析步驟等。細(xì)胞的釋放可以基于上文定義的位置標(biāo)記元件的使用。例如，通過存儲位置標(biāo)記代碼或相應(yīng)坐標(biāo)，在初始染色或檢測步驟之后，可以容易地識別或再識別細(xì)胞。針對細(xì)胞的釋放，可以使用顯微操縱器或抽吸裝備。由于根據(jù)本發(fā)明的方法的有利結(jié)果，以提供包括處于固定位置的細(xì)胞的過濾材料，可迅速并精確地實現(xiàn)后續(xù)分析和抽取過程。
[0092]在又一實施例中，所述活動可以是細(xì)胞的生物操縱。本文中使用的“生物操縱”涉及針對細(xì)胞的生物實體的應(yīng)用，以便影響其行為、尺寸、結(jié)構(gòu)、組織等。這些生物操縱的范例包括生物結(jié)合實體(諸如抗體)的應(yīng)用。其他范例包括針對細(xì)胞的營養(yǎng)供給，允許細(xì)胞的生長和有絲分裂。另一設(shè)想是采用結(jié)合因子，諸如配體或生長因子、轉(zhuǎn)錄因子、具體糖類、使用細(xì)胞抑制劑或激活劑等。其他生物操縱對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是已知的，并且也是本發(fā)明設(shè)想的。
[0093]在又一實施例中，所述活動能夠是生化操縱。本文中使用的“生化操縱”被理解為將根據(jù)本發(fā)明的過濾材料上的細(xì)胞暴露到生物活性實體，諸如RNAi分子、降解酶、通過結(jié)合到配體或受體而引起分子反應(yīng)等應(yīng)該具有具體分子影響的小分子。生化操縱也可以包括執(zhí)行原位生化反應(yīng)，例如執(zhí)行原位聚合酶鏈反應(yīng)、檢測原位基因表達(dá)或蛋白質(zhì)表達(dá)、檢測蛋白質(zhì)、脂類、DNA/RNA、熒光/顯色原位雜交(FISH/CISH)、糖苷結(jié)構(gòu)或一個或更多細(xì)胞內(nèi)的其他實體等的存在。其他生化操縱對于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是已知的，并且也是本發(fā)明設(shè)想的。
[0094]在本發(fā)明的又一具體優(yōu)選實施例中，所述活動包括培養(yǎng)經(jīng)分離的細(xì)胞?？梢韵蛟谶^濾材料上捕獲到的細(xì)胞提供生長介質(zhì)或營養(yǎng)，例如碳源，諸如糖、氮源、維生素、激素、生長因子、無機鹽、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)等，所述過濾材料優(yōu)選地沉積在包括多孔、網(wǎng)狀、開放、或部分開放結(jié)構(gòu)的相變介質(zhì)上。培養(yǎng)可以適于捕獲的細(xì)胞，例如細(xì)菌細(xì)胞、人類細(xì)胞、上皮細(xì)胞等。在其他具體實施例中，生長介質(zhì)可以是最低限度介質(zhì)、選擇介質(zhì)、或利用用于后續(xù)分析的標(biāo)簽進(jìn)行富集，例如放射性或熒光標(biāo)簽、或染料等。例如在包括空腔或開口的相變介質(zhì)層內(nèi)，通過使生長介質(zhì)捕獲到的細(xì)胞下方通過或流過，可以執(zhí)行培養(yǎng)本身。所述流可以是由包括閥門或運動單元、容器、循環(huán)或替換單元等的管道或流體系統(tǒng)提供的恒定流。在具體實施例中，可以在微流體環(huán)境中實施培養(yǎng)。而且，可以在適當(dāng)溫度實施培養(yǎng)，例如適于捕獲到的細(xì)胞生長的溫度，例如在28°C到40°C的范圍，優(yōu)選處于37°C。通過修改孵育溫度，可以進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生分子反應(yīng)，其隨后能夠被光學(xué)檢測。可以在任何適當(dāng)時間內(nèi)實施培養(yǎng)，例如30分鐘到若干周的時間段。
[0095]在本發(fā)明的又一具體優(yōu)選實施例中，被分離或捕獲的細(xì)胞是罕見細(xì)胞。本文中使用的術(shù)語“罕見細(xì)胞”涉及在其他細(xì)胞群內(nèi)所述細(xì)胞出現(xiàn)的相對頻率。例如，罕見細(xì)胞可以是以在約Iml的樣本體積內(nèi)一個細(xì)胞對106、107、108、109或更多細(xì)胞的比率存在的細(xì)胞。具體優(yōu)選的罕見細(xì)胞是循環(huán)腫瘤細(xì)胞，尤其是通過人體或哺乳動物或高等真核生物的血流輸送的上皮腫瘤細(xì)胞。在其他具體實施例中，捕獲到的細(xì)胞可以是腫瘤細(xì)胞，諸如乳腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、泌尿道上皮癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞、肉瘤細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞或非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞。
[0096]在其他優(yōu)選實施例中，所述細(xì)胞可以是細(xì)菌細(xì)胞，例如奈瑟氏菌屬的細(xì)菌，諸如腦膜炎奈瑟氏菌、鏈球菌屬的細(xì)菌，例如肺炎鏈球菌、葡萄球菌屬的細(xì)菌，例如金黃色葡萄球菌、嗜血桿菌屬的細(xì)菌，例如流感、大腸埃希菌屬的細(xì)菌，例如大腸桿菌或分支桿菌屬的細(xì)菌，例如結(jié)核分枝桿菌或麻風(fēng)分枝桿菌。
[0097]在本發(fā)明的又一優(yōu)選實施例中，可以利用適當(dāng)?shù)娘@微鏡和顯微鏡技術(shù)執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的方法處理的細(xì)胞的光學(xué)成像或光學(xué)分析。這樣的顯微鏡技術(shù)的范例包括明視場顯微鏡檢查、暗視場顯微鏡檢查、相位對比度顯微鏡檢查、微分干涉對比度顯微鏡檢查，熒光顯微鏡檢查、原子力顯微鏡檢查、超分辯率顯微鏡檢查和共聚焦激光掃描顯微鏡檢查。本發(fā)明的具體有利方面是基于簡單、廣為人知、通用和容易實現(xiàn)的明視場顯微鏡，根據(jù)本文中描述的方法處理的細(xì)胞能夠以改善的質(zhì)量地被成像或可視化。所述細(xì)胞處理還非常適于使用其他顯微鏡技術(shù)的成像途徑。使本方法的某些特點和參數(shù)適于選擇的顯微鏡途徑在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力之內(nèi)。例如，可以適于染色、熒光標(biāo)記的使用、激發(fā)和檢測波長等，可以適于載體。而且，在具體實施例中，可以使用蓋玻片，以便覆蓋過濾材料上的處理細(xì)胞。
[0098]在另一方面，本發(fā)明涉及經(jīng)處理的過濾材料，其包括適于光學(xué)成像的經(jīng)分離的細(xì)胞，通過本文中使用的處理方法可獲得所述過濾材料。因此，過濾材料可以包括在本文中描述的熔化和固化處理之后的捕獲到的細(xì)胞，所述捕獲到的細(xì)胞位于一個光學(xué)平面中。所述過濾材料可以用于光學(xué)分析，或經(jīng)受額外的染色或操縱步驟。因此，提供的過濾材料還可以用于對于捕獲到的細(xì)胞的生命延長活動。由此，所述過濾材料可以與本文中定義的生長介質(zhì)接觸，或其可以被儲存在冷卻環(huán)境中，例如在冰箱或冷卻室。備選地，可以例如在_20°C或在-80°C冷凍過濾材料，以將其保存用于后續(xù)分析步驟。冷凍之前，例如通過添加本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當(dāng)冷凍介質(zhì)，可以為冷凍條件制備過濾材料。
[0099]在本發(fā)明的又另一方面，根據(jù)本文中描述的方法獲得的經(jīng)處理的過濾材料可以用于任何適當(dāng)?shù)脑\斷或分析測試。例如，優(yōu)選在本文中描述的染色步驟之后，所述經(jīng)處理的過濾材料可以用于組織學(xué)檢查。而且，所述經(jīng)處理的過濾材料可以用于微生物學(xué)或病毒學(xué)分析，例如對捕獲到的細(xì)菌或病毒的識別和表征。在其他實施例中，所述經(jīng)處理的過濾材料可以用于生化目的，例如用于對在捕獲到的細(xì)胞上提供影響的活性小分子的識別和選擇、在捕獲細(xì)胞上抑制或誘導(dǎo)分子的測試、對于新陳代謝的生化修改的測試、細(xì)胞活性結(jié)構(gòu)等。在具體優(yōu)選實施例中，所述經(jīng)處理的過濾材料可以用于腫瘤學(xué)分析，例如對捕獲到的罕見細(xì)胞(諸如循環(huán)腫瘤細(xì)胞)的檢測和表征。例如，根據(jù)抗體與表面標(biāo)記的結(jié)合和伴行或后續(xù)的利用熒光染料的染色、或針對DNA或RNA利用隔室具體染料進(jìn)行染色，可以識別細(xì)胞，以便分析有絲分裂活動。在又一具體優(yōu)選實施例中，所述經(jīng)處理的過濾材料可以用于血液分析。因此，所述經(jīng)處理的過濾材料細(xì)胞可以從包括例如白血球或具體白細(xì)胞類型或種類的血液樣本中獲得。因此，針對細(xì)胞的頻率、尺寸、活性等，可以分析所述細(xì)胞。
[0100]在又一方面中，本發(fā)明涉及一種用于處理細(xì)胞以使其適于光學(xué)成像的設(shè)備，所述設(shè)備包括(a)上文中定義的過濾材料，其用于捕獲細(xì)胞。(b)上文中定義的相變介質(zhì)的層；以及(C)加熱和/或冷卻單元。在一個實施例中，所述設(shè)備可以包括可移除的過濾材料，例如，其可轉(zhuǎn)移到過濾單元或被插入過濾設(shè)備，其中，在過濾材料上捕獲一個或更多細(xì)胞，優(yōu)選為上文中定義的罕見細(xì)胞，或任何其他細(xì)胞類型，諸如上文中定義的細(xì)菌細(xì)胞。還可以通過不同方法執(zhí)行對細(xì)胞的捕獲，例如經(jīng)由選擇性結(jié)合到諸如抗體的結(jié)合分子、免疫磁性分離過程等。隨后，過濾材料可以被重新引入用于根據(jù)本發(fā)明處理細(xì)胞的設(shè)備。
[0101]在另一實施例中，例如在獨立設(shè)備或在過濾單元中已經(jīng)執(zhí)行過濾或細(xì)胞捕獲處理，或本文中提到的另一捕獲過程之后，用于捕獲細(xì)胞的過濾材料可以已經(jīng)具有捕獲到的細(xì)胞或與其上的捕獲到的細(xì)胞一起存在。在具體實施例中，所述設(shè)備可以包括多于一個過濾材料，例如2、3、4、5、6、7、IO、15或更多過濾材料或過濾器，其允許并行或半并行處理。本發(fā)明也設(shè)想多于一個過濾材料或過濾器的相繼處理。
[0102]在又一實施例中，所述設(shè)備可以包括插入槽、缺口或引入?yún)^(qū)，其允許插入包括一個或更多捕獲到的細(xì)胞的過濾材料或過濾器。在處理步驟之后，這個區(qū)可以配備過濾器的快速引入及其移除，即如在固定位置處包括細(xì)胞的光學(xué)平面過濾材料。在具體實施例中，所述設(shè)備可以包括多于一個的插入槽、缺口或引入?yún)^(qū)，例如2、3、4、5、6、7、10、15或更多插入槽、缺口或引入?yún)^(qū)，其允許并行或半并行處理。也設(shè)想在所述插入?yún)^(qū)中的相繼處理。
[0103]在本發(fā)明的另一實施例中，本文中定義的設(shè)備包括上文中定義的相變介質(zhì)的一層或更多層。例如，相變介質(zhì)的這些層可以被提供在容器或庫隔室中，并且在將包括細(xì)胞的過濾材料引入設(shè)備時，其與過濾材料相關(guān)聯(lián)。備選地，在針對一個或多于一個過濾器的處理過程完成之后，所述設(shè)備可以提供相變介質(zhì)的外部補給。例如，相變介質(zhì)在適當(dāng)環(huán)境中可以以準(zhǔn)備使用的方式進(jìn)行存儲，并且當(dāng)新的處理周期開始時，其被引入設(shè)備。例如通過使用機器人技術(shù)，或經(jīng)由自動遞送系統(tǒng)，可以優(yōu)選地自動執(zhí)行這一過程。在其他實施例中，可以以熔化形態(tài)提供相變介質(zhì)，例如，在處理周期開始時被保持在熱容器或加熱單元中，并且在優(yōu)選上文描述的模具中被燒鑄。在處理方案的每個周期中可以重復(fù)這一過程。因此，在相變介質(zhì)已經(jīng)固化之后，可以移除模具。在具體實施例中，用于熔化的相變介質(zhì)的容器也可以是根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備的一部分。備選地，這些容器可以是可移除的，并且當(dāng)需要時僅與設(shè)備相關(guān)聯(lián)。
[0104]在其他具體實施例中，所述設(shè)備也可以提供上文中定義的載體的存在。例如，所述設(shè)備可以包括庫隔室或針對載體的遞送系統(tǒng)，在將包括細(xì)胞的過濾材料引入設(shè)備時，所述載體可以與過濾材料和相變介質(zhì)相關(guān)聯(lián)。備選地，載體材料可以已經(jīng)被連接到相變介質(zhì)，并且在將過濾材料引入設(shè)備時，所述載體材料與過濾材料相關(guān)聯(lián)(組合)。也優(yōu)選，在設(shè)備中(例如在庫隔室中)提供預(yù)制造載體相變介質(zhì)束或包。當(dāng)處理周期開始時，載體相變介質(zhì)包可以被插入處理部位。所述包可以保持在適當(dāng)環(huán)境中，例如冷卻環(huán)境或干燥環(huán)境中等。
[0105]在本發(fā)明的其他實施例中，在設(shè)備中，在培養(yǎng)或允許細(xì)胞生長的環(huán)境中可以提供相變介質(zhì)或相變介質(zhì)與載體的組合。因此，所述設(shè)備可以配備管或節(jié)點；和/或其可以包括用于液體(例如水、化學(xué)品、原料、營養(yǎng)素、生長因子、碳或氮源等)的容器和貯藏室，或用于培養(yǎng)細(xì)胞的任何其他實體，諸如溫度控制單元和CO2供給。例如，所述設(shè)備可以被集成在流體或微流體系統(tǒng)中，所述流體或微流體系統(tǒng)包括以上指示的連接和容器。也可以包括用于控制液體流、pH、溫度、分子濃度等的單元。在其他實施例中，以上描述的培養(yǎng)單元可以從設(shè)備中移除，并且因此當(dāng)必要時(例如當(dāng)處理活細(xì)胞時)被使用。
[0106]在又一優(yōu)選實施例中，本文中定義的設(shè)備可以包括能夠加熱過濾材料和相關(guān)聯(lián)的相變介質(zhì)的單元，尤其以便提供熔化上文中定義的相變介質(zhì)的可能性。在其他實施例中，所述設(shè)備可以額外地包括冷卻單元，尤其以便提供增強本文中描述的固化處理的可能性。在其他實施例中，所述加熱或冷卻單元可以額外地用于控制在設(shè)備中培養(yǎng)步驟的溫度。冷卻設(shè)備還可以用于根據(jù)本發(fā)明經(jīng)處理的過濾材料的原位保護(hù)。例如，這樣的保護(hù)可以原位制冷，直到實施后續(xù)染色過程或光學(xué)成像分析。例如，所述經(jīng)處理的過濾材料可以被冷卻到約4 - 8°C的溫度。也設(shè)想在設(shè)備內(nèi)存在冷凍單元，其允許對本文中描述的經(jīng)處理的過濾材料進(jìn)行冷凍。經(jīng)冷凍的過濾材料可以原位保持，或者從設(shè)備中移除，以便儲存在-80°C，或-20°C或在任何其他適當(dāng)溫度的冷凍箱中。在其他實施例中，以上描述的冷凍單元或冷卻單元可以從設(shè)備中移除，并且因此在必要時(例如當(dāng)要求儲存過濾材料時)使用。
[0107]在具體優(yōu)選實施例中，冷卻單元或加熱單元可以是珀耳帖元件，其允許加熱和冷卻活動。
[0108]在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施例中，上文中定義的設(shè)備可以包括過濾單元或捕獲單元，其允許對在上文中定義的過濾材料上細(xì)胞的分離或捕獲。例如，過濾單元或捕獲單元能夠在或樣本材料的液體流上提供壓力，導(dǎo)致強行通過上文中定義的過濾材料。備選地，捕獲單元可以配備磁珠或免疫元件等，其允許對細(xì)胞進(jìn)行免疫磁性或免疫選擇。
[0109]尤其優(yōu)選地，上文中定義的設(shè)備包括可移除的壓力遞送系統(tǒng)。在一個實施例中，所述系統(tǒng)可以被直接耦合到過濾材料。在一個具體實施例中，可移除的壓力遞送系統(tǒng)可以是被連接到真空或低壓生成單元(例如真空泵)的針。所述針可以從過濾材料或隔室中移除，在已經(jīng)執(zhí)行過濾或細(xì)胞分離步驟后，所述過濾材料位于所述隔室。
[0110]在其他具體實施例中，可以實現(xiàn)以上描述的可移除壓力遞送系統(tǒng)，以便從過濾材料中移除水或液體殘留物，例如乙醇剩余物。
[0111]而且，根據(jù)本發(fā)明的所述設(shè)備可以具有隔室或嵌入的隔室結(jié)構(gòu)。在圖5B中提供了設(shè)想隔室結(jié)構(gòu)的范例，圖5A示出了在設(shè)備中使用的可能的相變介質(zhì)。這樣的集成設(shè)備形態(tài)可以與上或下文中描述的額外的單元進(jìn)行組合，例如溫度單元、容器、庫單元、管等。
[0112]尤其優(yōu)選地，本文中定義的設(shè)備包括用于將上文中定義的過濾材料輸送至上文中定義的載體的裝置。這樣的輸送單元可以是機器人實體或遞送系統(tǒng)。也設(shè)想是半自動輸送裝置。另外具體優(yōu)選地，上文中定義的設(shè)備包括用于將相變介質(zhì)層輸送至上文中定義的載體的裝置。這樣的輸送單元可以是機器人實體或遞送系統(tǒng)。也設(shè)想是半自動輸送裝置。
[0113]在本發(fā)明的其他實施例中，上文中定義的設(shè)備可以被連接到下游處理和/或分析單元或裝備。例如，所述設(shè)備可以配備染色、固定、機械操縱、生物操縱和/或生化操縱單元，或允許這樣的活動的入口或出口。上文提供了可以在這些單元中實施或由這些單元實施的可能的活動細(xì)節(jié)。而且，所述設(shè)備可以被連接到光學(xué)成像系統(tǒng)，例如顯微鏡?？梢耘c本發(fā)明的所述設(shè)備相關(guān)聯(lián)或在其中集成的顯微鏡的范例包括明視場顯微鏡、暗視場顯微鏡、相位對比度顯微鏡、微分干涉對比度顯微鏡、熒光顯微鏡、原子力顯微鏡、共聚焦激光掃描顯微鏡和超分辯率顯微鏡。另外設(shè)想是存在光源、光學(xué)過濾器、攝像單元和光學(xué)成像所必需的其他元件。優(yōu)選地，設(shè)備也可以配備控制單元或計算機單元，其允許執(zhí)行、監(jiān)管和編排設(shè)備活動。控制單元還可以具有用戶接口，其允許對所述設(shè)備進(jìn)行編程、監(jiān)管和配置。而且，可以向所述設(shè)備提供互聯(lián)網(wǎng)或內(nèi)聯(lián)網(wǎng)接口，其允許遠(yuǎn)程控制等。也設(shè)想，使用例如以計算機設(shè)備形態(tài)的圖像捕獲和儲存單元。該圖像捕獲和儲存單元還可以配備適當(dāng)?shù)姆治鲕浖虺绦?，其允許例如在腫瘤細(xì)胞的情況下對細(xì)胞或細(xì)胞組織學(xué)的表征，或用于診斷分析過程。假如分析細(xì)菌細(xì)胞或病毒，也設(shè)想使用微生物識別程序。
[0114]在又一方面，本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)光學(xué)平面過濾材料的方法。所述方法包括以下步驟:熔化上文中定義的相變介質(zhì)，直到所述介質(zhì)被分散在過濾材料下方；以及降低相變介質(zhì)的溫度，直到介質(zhì)固化，形成光學(xué)平面過濾器。在優(yōu)選實施例中，利用包括捕獲到或經(jīng)分離的細(xì)胞(例如上文中定義的罕見細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞)的過濾材料執(zhí)行所述方法。在具體實施例中，所述方法也可以用于過濾材料的制備，所述過濾材料包括元件(諸如病毒粒子)、無機實體(諸如金屬、木材、塑性或其他材料)，例如從事故、質(zhì)量控制測量、產(chǎn)品測試測量等獲得的這種材料的微米尺寸片。
[0115]在又一方面，本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)適于本方法的相變介質(zhì)的方法。所述方法包括從固體相變介質(zhì)的塊中切出或刻出空腔的步驟。因此，相變介質(zhì)可以提供多孔、網(wǎng)狀、開放或部分開放的結(jié)構(gòu)、一個或更多個通道、一個或更多個通路或一個或更多個管元件。例如，所述切出可以由激光或激光設(shè)備執(zhí)行。通道或通路可以與相變介質(zhì)的邊緣連接和/或與相變介質(zhì)的外部接觸。而且，可以將通路、開口等互相連接。優(yōu)選地，所述開口允許適當(dāng)?shù)囊后w流，尤其在過濾材料上捕獲到的細(xì)胞附近或下方的生長或培養(yǎng)介質(zhì)。在又一實施例中，所述方法可以包括把熔化的或液態(tài)的相變介質(zhì)燒鑄到相應(yīng)的模具中并且隨后使材料固化的步驟，接著抽取模具。
[0116]出于說明目的，提供以下范例和附圖。由此，應(yīng)當(dāng)理解，所述范例和圖不應(yīng)被解釋為限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員將清楚地能夠設(shè)想本文中陳述的原理的其他修改。
[0117]范例
[0118]范例1- MCF7 (乳腺癌)細(xì)胞的制備
[0119]過濾過程
[0120]具有90%融合MCF7細(xì)胞的75cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Nunc)被胰蛋白酶化(胰蛋白酶+EDTA，英杰公司)6分鐘，并且懸浮在提供FBS、青霉素/鏈霉素和Glutamax (英杰公司)的RPMI1640介質(zhì)中。之后，所述細(xì)胞借助離心分離(5分鐘，1000RPM)被一次洗掉，并且懸浮在IOml DPBS (英杰公司)。以使得細(xì)胞將在IOml DPBS中覆蓋約10%的有效過濾面積的方式來稀釋細(xì)胞懸浮液。通過在穿過隔室的流中應(yīng)用適度的真空，玻璃微觀分析過濾支架(微孔過濾器)用于過濾IOml的細(xì)胞懸浮液。
[0121]過濾器的制備和可視化
[0122]過濾器隨后從過濾支架上移除，并且被放置在標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡載玻片的頂部，在所述標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡載玻片上沉積20 μ I固體石蠟。顯微鏡載玻片被轉(zhuǎn)移到珀耳帖元件，其提供熱量以熔化固體石蠟(見圖2Α)。當(dāng)石蠟被完全熔化時，顯微鏡載玻片被移除并且在室溫下冷卻，直到石蠟已經(jīng)重新固化(見圖2Β)。之后，所述載玻片使用反射光在標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡(蔡司)上成像(見圖3Α)，或者進(jìn)入標(biāo)準(zhǔn)蘇木精和伊紅(Η&Ε)染色過程(見圖3Β)。后者甚至提供更大的對比度。
[0123]當(dāng)根據(jù)以上列舉的過程進(jìn)行處理時，過濾器保持完全地附著石蠟層，并且細(xì)胞保持完全地附著過濾器(在染色過程之前使用或者不使用固定)。值得注意的是，由于Η&Ε協(xié)議要求在若干不同流體箱中數(shù)百次侵泡并且在流動的自來水下進(jìn)行沖洗。以非常高的圖像質(zhì)量對生物細(xì)胞進(jìn)行成像。高圖像質(zhì)量歸因于光學(xué)平面和固化石蠟層充當(dāng)非常好的光漫射器的事實。
[0124]范例2 -具有集成流系統(tǒng)的熔化過濾支撐物結(jié)構(gòu)
[0125]通過將約400 μ I熔化的石蠟移液到大量熱水中，隨后允許石蠟冷卻、變薄、變平，創(chuàng)建石蠟均勻小點。使用熱印，在顯微鏡載玻片上的小點被穿孔出圓圈(I)。使用更小的圓形冷印移除圓圈的內(nèi)部(2)。然后針被加熱,并且被固定在圓形支撐結(jié)構(gòu)的側(cè)壁(3、4)。應(yīng)用過濾器(5)，并且使用大熱印，將過濾器密封在環(huán)形支撐結(jié)構(gòu)上(6)使用大熱印(I)。通過對針應(yīng)用真空，在過濾材料下方的隔室中生成低壓，允許進(jìn)行過濾處理(見圖4)。
[0126]通過除針以外的其他裝置，例如通過基底材料中的孔或孔洞，或通過支撐石蠟中的孔或孔洞，也能夠應(yīng)用真空壓。通過加熱，過濾材料(具有細(xì)胞)能夠被附著在顯微鏡載玻片。加熱引起固體石蠟熔化，并且將過濾器吸引到顯微鏡載玻片(如范例I)。
[0127]因為關(guān)于過濾器和顯微鏡載玻片固定細(xì)胞，在處置之前和之后能夠定位相同的細(xì)胞。
【權(quán)利要求】
1.一種用于處理經(jīng)分離的細(xì)胞以使其適于光學(xué)成像的方法，所述方法包括以下步驟: (a)在相變介質(zhì)上沉積包括捕獲到的細(xì)胞的過濾材料； (b)熔化所述相變介質(zhì)，直到所述介質(zhì)被分散在所述過濾材料下方；以及 (c)降低所述相變介質(zhì)的溫度，直到所述介質(zhì)固化，形成在單光學(xué)平面中和在固定位置處包括所述細(xì)胞的過濾器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述方法額外地包括在過濾材料上捕獲細(xì)胞的初始步驟。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，所述過濾材料能夠尺寸排阻細(xì)胞，以使其從流體或溶液中分離，所述過濾材料優(yōu)選具有約0.5μπι到20 μ m的孔尺寸，更優(yōu)選具有約8 μ m的孔尺寸，并且其中，所述過濾材料優(yōu)選是聚合物過濾器，更優(yōu)選為聚碳酸酯、聚對二甲苯或尼龍過濾器，或非聚合物過濾器，更優(yōu)選為硅過濾器；或3D微型過濾器。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中的任一項所述的方法，其中，所述相變介質(zhì)是在約25°C到70 V的溫度范圍內(nèi)熔化和固化的介質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至5中的任一項所述的方法，其中，所述相變介質(zhì)包括多孔、網(wǎng)狀、開放或部分開放結(jié)構(gòu)和/或包括通道、通路或管元件，其中，所述結(jié)構(gòu)或元件允許流體通過所述介質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其中，所述介質(zhì)是烴蠟，優(yōu)選為具有CnH2n+2的分子式的石臘，n=20到40。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至6中的任一項所述的方法，其中，所述相變介質(zhì)被安裝在載體上，優(yōu)選為玻璃載體或聚合材料載體，并且其中，所述載體任選地包括位置標(biāo)記。
8.根據(jù)權(quán)利要求1至7中的任一項所述的方法，其中，所述方法包括從對所述經(jīng)分離的細(xì)胞的染色、固定、釋放、機械操縱、生物操縱和生化操縱的群組中選擇的活動，作為額外的步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述活動包括培養(yǎng)所述經(jīng)分離的細(xì)胞，優(yōu)選經(jīng)由使?fàn)I養(yǎng)液流過所述多孔、網(wǎng)狀、開放或部分開放的相變介質(zhì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中的任一項所述的方法，其中，所述細(xì)胞是罕見細(xì)胞，優(yōu)選為循環(huán)腫瘤細(xì)胞或細(xì)菌細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中的任一項所述的方法，其中，所述光學(xué)成像是明視場顯微鏡檢查、暗視場顯微鏡檢查、相位對比度顯微鏡檢查、微分干涉對比度顯微鏡檢查、熒光顯微鏡檢查、原子力顯微鏡檢查、共聚焦激光掃描顯微鏡檢查或超分辯率顯微鏡檢查。
12.一種包括適于光學(xué)成像的經(jīng)分離的細(xì)胞的經(jīng)處理的過濾材料，所述處理過濾材料能夠由根據(jù)權(quán)利要求1至11中的任一項所述的方法獲得。
13.一種包括適于光學(xué)成像的經(jīng)分離的細(xì)胞的經(jīng)處理的過濾材料的用途，所述經(jīng)分離的細(xì)胞能夠通過根據(jù)權(quán)利要求1至11中的任一項所述的方法獲得，其用于診斷、組織學(xué)、微生物學(xué)、生物化學(xué)、腫瘤學(xué)或血液分析。
14.一種用于處理細(xì)胞以使其適于光學(xué)成像的設(shè)備，所述設(shè)備包括: Ca)根據(jù)權(quán)利要求3所述的過濾材料，其用于捕獲細(xì)胞； (b)根據(jù)權(quán)利要求4至7中的任一項所述的相變介質(zhì)的層；以及 (c)加熱單元和任選的冷卻單元。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的設(shè)備，所述設(shè)備額外地包括被耦合到所述過濾材料的能夠移除的壓力遞送系統(tǒng)，允許在過濾材料上進(jìn)行細(xì)胞的分離，以及任選地包括一種用于輸送所述過濾材料和/或 所述相變介質(zhì)的層到根據(jù)權(quán)利要求7所述的載體上的裝置。
【文檔編號】G01N1/36GK103649714SQ201280034576
【公開日】2014年3月19日 申請日期:2012年7月4日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月13日
【發(fā)明者】M·W·J·普林斯, M·M·奧夫揚科, F·范赫默特, A·R·范多恩 申請人:皇家飛利浦有限公司