HIV gp-120變體的快速選擇方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于快速免疫原選擇(rapid?immunogen?selection，RIS)的方法，其基于使包含所展示的表面多肽之隨機化HIV?gp120變體的重組病毒文庫與所述中和抗體的結(jié)合。本發(fā)明還涉及根據(jù)本發(fā)明RIS方法分離之HIV?gp120免疫原在用于治療由病毒造成之疾病的藥物中和在用于鑒定患者中中和抗體的診斷中的用途。
【專利說明】HIV gp-120變體的快速選擇方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及可引發(fā)高中和抗體(neutralizing antibody,nAb)活性的免疫原的快速選擇方法。本發(fā)明公開并舉例說明了 nAb活性增強的這些免疫原的幾個實例。特別地，本發(fā)明公開了針對HIV-1Env表位的抗體親和力增強的免疫原。
【背景技術(shù)】[0002]據(jù)估計，自1982年以來全世界已有多于6千萬人感染了人免疫缺陷病毒。在相同時間范圍中這些感染個體中有近一半死于所產(chǎn)生的獲得性免疫缺陷綜合征(AcquiredImmunodeficiency Sydrome, AIDS)。雖然最近病毒傳播似乎已到達穩(wěn)定階段,但是據(jù)報道在2009年仍有250萬例HIV新感染。HIV仍然是主要的公共健康問題。參見UNAIDS，2010Report on the global AIDS epidemic。
[0003]HIV-1是迄今為止描述的遺傳多樣性最大的病毒病原體之一。HIV-1系統(tǒng)樹有三個主要分支，M(主要)、N(新型)和0(離群)組。M組病毒是最廣泛的，占全球感染的多于99%。主要基于短的env(包膜)基因序列，該組目前被分為九種不同的遺傳亞型或分支(clade) (A 至 K)。參見 McCutchan F，AIDS2000 ; 14 (S3):S31_S44 和 Robertson D 等，Science2000 ；288:55_56。
[0004]Env是變異性最大的HIV-1基因，在分支之間有多至35%的序列多樣性，分支內(nèi)有多至20%的序列多樣性，并且在單個感染者中有多至10%的序列多樣性。參見Kuiken C等，AIDS1996 ；10:31-37 和 Shankarappa R 等，J.Virol.1999 ；73:10489-10502。分支 B 在歐洲、美國和澳大利亞占主導地位。參見Kuiken C等，AIDS1996 ；Am.J.Epidemiol.2000 ；152:814-822。分支C常見于非洲南部、中國和印度并且目前在全世界感染了比任何其他分支都更多的人。參見McCutchan，2000(見上文)。在非洲中部和東部以分支A和D為主。
[0005]然而，由于常見的共流行病毒(co-circulating viruse)之間的混合導致了分支間(interclade)的重組體，所以許多病毒難以歸類至分支。參見Heyndrickx L等，J.Virol.200 ；74:363-370 和 McCutchan F 等，Virologyl999 ；254:226_234。一些重組形式事實上產(chǎn)生了重要的流行品系，稱為流行重組形式(circulating recombinant form,CRF)。這些CRF中最常見的兩種是在泰國發(fā)現(xiàn)的CRF01 (AE)(其最初被歸類為分支E，但是后來發(fā)現(xiàn)僅env是分支E而基因組的其他部分是分支A)，和非洲西部常見的AG重組形式CRF02。參見Robertson，2000 (見上文)。在全球，分支A至D以及CRF01AE和CRF02AG重組體占全球感染的多于90%。
[0006]針對病毒包膜蛋白(Env)的中和抗體(nAb)是通過阻斷易感細胞感染的針對HIV-1暴露的第一道獲得性免疫防線。參見Kwong P等，Nature 1998 ；393 =648-659 ；MooreJ 等，J.Virol.1994 ；68:469-484 ；Moore P 等，J.Virol.1996 ；70:1863-1872 和 Parren P等，AIDS1999 ;13:S137-S162。疫苗針對多種病毒的效力歸因于其引發(fā)nAb的能力。參見Burton D, Nat.Rev.Tmmunol.2002 ；2:706-713 和 Zinkerangel R 等，Adv.1mmunol.2001 ；79:1-53。然而，盡管付出了巨大的努力，但是關(guān)于開發(fā)有效HIV-1免疫原進展有限。參見 Burton, 2002 (見上文)；McMichael A, Hanke T, Nat.Med.2003 ;9:874-880 和 Moore,1996(見上文)。這些免疫原的設(shè)計需要鑒定能夠引起更好的nAb應答的表位。遺憾的是，到目前，開發(fā)引發(fā)廣泛nAb應答的免疫原的所有嘗試都失敗了。
[0007]因此，本領(lǐng)域需要能夠引起更好的nAb應答的新HIV-1免疫原。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明涉及用于快速選擇免疫原(rapid selection of immunogen,RIS)的方法，所述免疫原在用作B細胞免疫原時可引發(fā)高nAb活性。所述方法包括:i)使野生型目的表位的核苷酸編碼序列隨機突變以產(chǎn)生所述表位之變體的文庫，ii)用已知對野生型表位具有親和力的抗體或其部分測試文庫，以及iii)選擇抗體親和力增加的表位變體。優(yōu)選地，所述表位是HIV表位。更優(yōu)選地,所述表位是Env表位。
[0009]在第二實施方案中，本發(fā)明涉及通過RIS方法得到的核苷酸序列和肽，例如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:3的核苷酸序列。
[0010]在第三實施方案中，本發(fā)明涉及通過RIS方法得到的核苷酸序列和肽用于預防和治療完全或部分由野生型目的表位之作用引起的疾病的用途。優(yōu)選地，所述疾病是AIDS或由HIV感染造成的疾病。
[0011]在第四實施方案中，本發(fā)明涉及RIS方法的診斷用途。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1.使用本發(fā)明RIS方法鑒定的突變體的序列。最上方的序列對應于AC10gpl60多肽的121至160位氨基酸。所分離克隆中氨基酸與AC10gpl60中氨基酸相同的對應區(qū)域的序列以點示出，或者在其中突變體序列與野生型序列不同的那些位置處用對應氨基酸示出。
`[0013]圖2.4E10抗體與LRl-Cl特異性突變體之間所建議的相互作用。示出了整個env基因中的11個氨基酸替換，包括3個潛在N連接糖基化位點的缺失。C131Y突變尤其相關(guān)，原因是該替換消除了 C131與C157之間的天然二硫鍵，破壞了 Vl / V2環(huán)的構(gòu)造。
[0014]圖3.使用根據(jù)本發(fā)明之RIS方法鑒定的LRl-Cl病毒體示出對于廣泛中和抗體(broadly neutralizing antibody) 4E10增加的親和力。圖示出通過將增加量的AClO野生型分離株和LRl-Cl分離株添加到包被有4E10抗體或未經(jīng)處理的板中所確定的病毒體與包被有4E10抗體的板結(jié)合的滴定。圖表明與野生型變體相比，4E10抗體與LRl-Cl的親和力增加為4倍。
[0015]圖4.使用根據(jù)本發(fā)明之RIS方法用4E10抗體鑒定的LRl-Cl病毒體沒有示出對于其他廣泛中和抗體增加的親和力。圖示出通過將增加量的AClO野生型分離株、LRl-Cl分離株或在env基因中攜帶缺失的病毒體添加到包被有2F5(圖A)、2G12(圖B)或bl2(圖C)抗體或未經(jīng)處理的板中所確定的病毒體與包被有所述抗體之板結(jié)合的滴定。
[0016]圖5.SEQ ID NO:31 與 AClO 野生型 HXB2 序列的比對。SEQ ID N0:31 對于 PG16抗體具有親和力。修飾序列示出兩種突變:i)潛在糖基化位點中的N203S和ii)gp41免疫顯性區(qū)中的G604E。
[0017]發(fā)明詳述[0018]A.快速免疫原選擇(RIS)方法
[0019]本發(fā)明涉及一種用于優(yōu)化作為免疫原的HIV-1包膜蛋白(Env)的新方法。該方法將表位依賴于其在病毒體上暴露而引發(fā)抗體的能力考慮在內(nèi)。所述方法基于從具有隨機突變包膜蛋白之病毒體的文庫中選擇對廣泛nAb親和力增加的變體。
[0020]根據(jù)本發(fā)明，使用來自HIV毒株AClO的全長env基因通過基于PCR的方法產(chǎn)生隨機突變包膜的文庫?？寺〉絇NL4-3環(huán)境中并通過瞬時轉(zhuǎn)染至293T細胞中得到病毒體。通過改進的溶液中病毒體捕獲測定(in-solution virion capture assay)進行與廣泛nAb4E10親和力增加的病毒的選擇。從捕獲的病毒群體中提取RNA并進行逆轉(zhuǎn)錄PCR以得到來自對應病毒的env基因用于進一步的測序并克隆回PNL4-3環(huán)境中。在一輪選擇之后，分離了與4E10抗體親和力增加為4倍的包膜。參見實施例。
[0021]因此，在第一方面中，本發(fā)明涉及一種用于鑒定能夠引發(fā)針對多肽之中和抗體的免疫原的方法，其包括:
[0022](i)使對所述多肽特異的中和抗體與重組病毒文庫相接觸，每一種所述重組病毒包含編碼所述多肽之變體的隨機化基因并表達所述多肽；
[0023](ii)基于與中和抗體結(jié)合的能力，將重組病毒文庫中與中和抗體結(jié)合的那些成員與不發(fā)生此結(jié)合的成員分離；以及
[0024](iii)確定在步驟(ii)中選擇的重組病毒文庫成員中發(fā)現(xiàn)的變體多肽的序列。
[0025]本文使用的術(shù)語“免疫原”旨在指能夠在個體中引起獲得性免疫應答的物質(zhì)，其中所述獲得性免疫應答能夠引起這樣的免疫應答，其顯著地作用于與免疫原共享免疫學特性的病原體。
[0026]本發(fā)明使用的術(shù)語“ 引發(fā)”在涉及免疫應答時，指特異性控制或影響免疫應答的活性，并且包括激活免疫應答、上調(diào)免疫應答、增強免疫應答和/或改變免疫應答(例如，通過引發(fā)某一類型的免疫應答，進而使對象中免疫應答的普遍類型(prevalent type)由有害或無效的改變成有利或保護性的)。
[0027]術(shù)語“中和抗體”是與病原體結(jié)合并干擾所述病原體感染細胞和/或引起對象疾病的能力的抗體或其抗原結(jié)合片段。通常，用于本發(fā)明方法的中和抗體與病原體的表面結(jié)合，并且相對于不存在所述抗體或存在陰性對照時的病原體感染，使病原體感染被抑制或減少至少99%、至少95%、至少90%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少60%、至少50%、至少45%、至少40%、至少35%、至少30%、至少25%、至少20%或至少10%。然后可使用本文提供方法中的任一種來測試nAb以確定它們是否具有中和活性或BNAb活性。如果中和抗體或BNAb在非人動物中產(chǎn)生，則CDR可由非人框架轉(zhuǎn)移至人框架以產(chǎn)生適于施用于人的抗體。本領(lǐng)域中已描述了用于確定抗體是否是nAb的方法。參見LiM 等，J.Virol.2005 ；79: 10108-10125 ；ffei X 等，Nature2003 ；422:307-312 和 MontefioriD, Curr.Protoc.1mmunol.2005 ;Jan,第12章:第12.11單元。這些方法基于，在使用病毒對編碼報道基因的接受細胞系進行單輪病毒感染之后確定報道基因表達的減少。
[0028]本文使用的術(shù)語“病毒”指可僅在生物體活細胞內(nèi)復制的小感染源(infectiousagent)?？捎糜诒景l(fā)明方法的病毒家族的非限制性實例包括腺病毒科(adenoviridae)、非洲豬痕樣病毒(African swine fever-like viruse)、沙粒病毒科(arenaviridae)、動脈炎病毒(arterivirus)、星狀病毒科(astroviridae)、桿狀病毒科(baculoviridae)、雙 RNA病毒科(birnaviridae)、布尼亞病毒科(bunyaviridae)、杯狀病毒科(caliciviridae)、圓環(huán)病毒科(circoviridae)、冠狀病毒科(coronaviridae)、δ 病毒(deltavirus)、絲狀病毒科(filoviridae)、黃病毒科(flaviviridae)、嗜肝 DNA 病毒科(hepadnaviridae)、肝炎病毒科(hepeviridae)、抱疫病毒科(herpesviridae)、正粘病毒科(orthomyxoviridae)、副粘病毒科(paramyxoviridae)、小RNA病毒科(picomaviridae)、痕病毒科(poxyviridae)、呼腸孤病毒科(reoviridae)、逆轉(zhuǎn)錄病毒科(retroviridae)和彈狀病毒科(rhabdoviridae)。
[0029]A.1接觸步驟
[0030]在第一步中，本發(fā)明的方法包括使對在所述病毒表面上展示的多肽特異的中和抗體與重組病毒文庫相接觸，每一種所述重組病毒包含編碼在病毒表面上展示的所述多肽之變體的隨機化基因。
[0031]本文使用的術(shù)語“文庫”指包含編碼不同重組多肽的多核苷酸的多核苷酸多樣集合或混合體。本發(fā)明方法中待使用文庫的大小和復雜性可以不同。例如，本發(fā)明的方法可用于篩選具有多至500000種不同成員的文庫，或具有I X IO6,1 X IO8種或更多種成員的文庫。典型的病毒文庫具有I X IO8至I X IO13種成員，并且這樣的文庫可使用本發(fā)明的方法來篩選。實際上，雖然優(yōu)選這樣的文庫，但是本方法也可顯然地用于篩選小得多的文庫(例如，具有1000至50，000、50至1000、或100至500、或10至100、或5至100種成員的文庫)。變體文庫的多樣性可通過在DNA三聯(lián)體(triplet)水平上誘變編碼變體的基因使得單個密碼子產(chǎn)生差異(例如，通過在PCR反應中使用部分隨機化序列的引物)來產(chǎn)生。
[0032]當本文提及分子的文庫時，該術(shù)語可用于指核酸或蛋白質(zhì)水平(即，在所編碼蛋白質(zhì)表達發(fā)生之前或之后)下的這種文庫。然而，顯然地，為了進行結(jié)合伴侶(bindingpartner)相互作用的選擇，這樣的表達文庫必須以蛋白質(zhì)水平存在。因此，為了使接觸步驟(a)成功發(fā)生，文庫必須以蛋白質(zhì)水平存在(但是最初它們可以以核酸水平存在)。
[0033]在一個優(yōu)選實施方案`中，步驟(i)中所用中和抗體所針對的多肽在病毒中表達。在一個優(yōu)選實施方案中，多肽“在病毒表面上”展示。本文使用的該術(shù)語指在不需要破壞病毒結(jié)構(gòu)的情況下可接近試劑(例如抗體)的任何多肽。應理解，在表面上展示的多肽對于無包膜病毒而言可以是衣殼多肽，或?qū)τ诎げ《径钥梢允前ざ嚯?。在一個優(yōu)選實施方案中，在病毒表面上展示的多肽是包膜多肽。
[0034]可對任何病毒包膜蛋白進行改造以得到重組病毒的文庫，每一種所述重組病毒包含編碼所述多肽之變體的隨機化基因。示例性的抗原包括選自以下的那些:流感病毒血凝素，人呼吸道合胞病毒G糖蛋白，登革病毒的核心蛋白、基質(zhì)蛋白或其他蛋白質(zhì)，麻疹病毒血凝素，單純皰疹病毒2型糖蛋白gB，脊髓灰質(zhì)炎病毒I VPl，HIV-1或HIV-1I的包膜或衣殼糖蛋白，乙型肝炎表面抗原，白喉毒素，鏈球菌24M表位,淋球菌菌毛蛋白，假狂犬病病毒g50 (gpD)，假狂犬病病毒II (gpB)，假狂犬病病毒gill (gpC)，假狂犬病病毒糖蛋白H，假狂犬病病毒糖蛋白E，傳染性胃腸炎糖蛋白195，傳染性胃腸炎基質(zhì)蛋白，豬輪狀病毒糖蛋白38,豬細小病毒衣殼蛋白，Serpulinahydodysenteriae保護性抗原，牛病毒性痢疾糖蛋白55，新城病毒血凝素-神經(jīng)氨酸酶，豬流感血凝素，豬流感神經(jīng)氨酸酶，口蹄疫病毒，豬霍亂病毒(hog colera virus),豬流感病毒,非洲豬痕病毒,支原體liyopneutiioniae,牛傳染性鼻氣管炎病毒，牛傳染性鼻氣管炎病毒糖蛋白E、糖蛋白G，傳染性喉氣管炎病毒，傳染性喉氣管炎病毒糖蛋白G或糖蛋白I，La Crosse病毒的糖蛋白，新生牛腹瀉病毒，委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒，punta toro病毒，鼠白血病病毒,小鼠乳房腫瘤病毒，乙型肝炎病毒核心蛋白和乙型肝炎病毒表面抗原或其片段或衍生物，馬流感病毒或馬皰疹病毒的抗原(包括馬流感病毒類型A /阿拉斯加91神經(jīng)氨酸酶、馬流感病毒類型A /邁阿密63神經(jīng)氨酸酶、馬流感病毒類型A /肯塔基81神經(jīng)氨酸酶、馬皰疹病毒類型I糖蛋白B和馬皰疹病毒類型I糖蛋白D)，牛呼吸道合胞病毒或牛副流感病毒的抗原(牛呼吸道合胞病毒附著蛋白(BRSV G)、牛呼吸道合胞病毒融合蛋白(BRSV F)、牛呼吸道合胞病毒核衣殼蛋白(BRSVN)、牛副流感病毒3型融合蛋白、牛副流感病毒3型血凝素神經(jīng)氨酸酶)，牛病毒性腹瀉病毒糖蛋白48和糖蛋白53。
[0035]優(yōu)選地，重組病毒的文庫是逆轉(zhuǎn)錄病毒的文庫。術(shù)語“逆轉(zhuǎn)錄病毒”意指通過酶逆轉(zhuǎn)錄酶由其RNA基因組產(chǎn)生DNA從而在宿主細胞中復制并且屬于家族逆轉(zhuǎn)錄病毒科(retroviridae)的任何 RNA 病毒。
[0036]術(shù)語“逆轉(zhuǎn)錄病毒”以其常規(guī)意義用于本文并且一般包括其中遺傳物質(zhì)是單鏈RNA并且采用逆轉(zhuǎn)錄酶在宿主中將病毒RNA轉(zhuǎn)錄為DNA的一類病毒。本文所指的逆轉(zhuǎn)錄病毒可特別地屬于病毒家族逆轉(zhuǎn)錄病毒科，更特別地屬于亞科腫瘤病毒亞科(oncovirinae)、慢病毒亞科(Ientivirinae)或泡沫病毒亞科(spumavirinae)。本文所指的逆轉(zhuǎn)錄病毒可以是致病的。Env序列可來源于任何已知的逆轉(zhuǎn)錄病毒，包括但不限于HIV、MuLV、SMRV、SFV、HPV、MMTV、SRV、HTLV-1、HTLV-11、BLV、BIV, SIV、維斯納病毒(visna virus)、EIAV、FIV 和EIAV ;以及來源于逆轉(zhuǎn)錄病毒亞科的任何一種(例如，腫瘤病毒亞科、慢病毒亞科或泡沫病毒亞科)。許多逆轉(zhuǎn)錄病毒克隆(包括HIV-1克隆)是良好表征并且可獲得的。
[0037]本文特別指的是感染動物的逆轉(zhuǎn)錄病毒，更優(yōu)選溫血動物的逆轉(zhuǎn)錄病毒，甚至更優(yōu)選脊椎動物的逆轉(zhuǎn)錄病毒，更優(yōu)選哺乳動物的逆轉(zhuǎn)錄病毒，又更優(yōu)選靈長類動物的逆轉(zhuǎn)錄病毒，并且最優(yōu)選人的逆轉(zhuǎn)錄病毒。本文特別優(yōu)選的是包括但不限于HIV-1、HIV-2、HTLV-1和HTLV-2的人逆轉(zhuǎn)錄病毒。已良好確立的HIV(和其他逆轉(zhuǎn)錄病毒)序列信息庫包括GenBank、EMBL, DDBJ和NCBI。經(jīng)良好表征的HIV-1克隆包括HXCB2、HIV-1-MN和HIV-1-MN-ST.1。參見 Hall L 等，J.Virol.1992 ;66 (9):5553_5560。
[0038]在一個優(yōu)選實施方案中，重組病毒的文庫是由至少一種表面多肽隨機化所產(chǎn)生的HIV病毒的文庫。本文中使用首字母縮略詞“HIV”來一般性地指人免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiency virus),包括人免疫缺陷病毒I (HIV-1)和人免疫缺陷病毒2 (HIV-2)的所有分支和/或毒株并且與用于HIV的較老術(shù)語(例如HTL VIII和LAV)同義。
[0039]在一個更優(yōu)選的實施方案中，HIV文庫中的不同成員在env基因中隨機化。本文使用的術(shù)語env基因指病毒基因組中編碼HIV包膜蛋白的多核苷酸。本文使用的術(shù)語“Env多肽”或“包膜多肽”指來源于HIV包膜蛋白的分子。HIV的包膜蛋白是約160kd的糖蛋白(gpl60)。在病毒感染宿主細胞期間，gpl60被宿主細胞蛋白酶切割形成gpl20和膜內(nèi)在蛋白質(zhì)(integral membrane protein) gp41。
[0040]“gpl20多肽”是來源于Env多肽之gpl20區(qū)的分子。成熟的gpl20野生型多肽在其一級序列中具有約500個氨基酸。gpl20被重度N糖基化，產(chǎn)生了 120kD的表觀分子量。gpl20的的氨基酸序列為約511個氨基酸。gpl20包含穿插在五個可變結(jié)構(gòu)域(VI至V5)中的五個相對保守的結(jié)構(gòu)域(Cl至C5)?？勺兘Y(jié)構(gòu)域包含大量的氨基酸替換、插入和缺失。“gpl20多肽”包括單一亞基和多聚體兩種。gp41部分錨定在病毒體的膜雙層中(并且跨越膜雙層)，而gpl20區(qū)段凸出到周圍環(huán)境中。gpl20的受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域定位在蛋白質(zhì)的N端一半上。這之后是脯氨酸富集區(qū)(PRR)，認為其作為與結(jié)合融合機制之受體通訊的樞紐(hinge)或觸發(fā)物起作用。gpl20的C端是高度保守的并且與gp41相互作用。野生型gpl60多肽的示例性序列是可獲得的。參見GenBank登錄號AAB05604和AAD12142。
[0041]env基因的隨機化可在完整env基因序列上進行，或優(yōu)選地在env基因中對應于gpl20編碼區(qū)域的部分上進行，原因是gpl20是與靶細胞上的受體相互作用并且構(gòu)成與中和抗體結(jié)合的最佳候選物的分子。而且，env基因中編碼gpl20的區(qū)域的隨機化可在整個序列上進行或針對gpl20多肽的一個或更多個結(jié)構(gòu)域。因此，根據(jù)本發(fā)明的RIS方法考慮了使用在gpl20的任意保守環(huán)(Cl至C5)、gpl20任意可變環(huán)(VI至V5)或者優(yōu)選的保守區(qū)與可變環(huán)之組合中進行隨機化產(chǎn)生的HIV文庫。在一個優(yōu)選實施方案中，隨機化在整個env基因上進行。在另一個實施方案中，隨機化在env基因的對應于gpl20的區(qū)域中進行。在另一個實施方案中，隨機化在env基因的對應于gpl20Vl和/或V2區(qū)的區(qū)域中進行。
[0042]可使用任意誘變技術(shù)將突變引入到核酸分子中。參見Sambrook J等,“MolecularCloning.A Laboratory Manual，，(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold SpringHarbor, NY, US,1989) ；Bishop T 等，“Nucleic Acid and Protein Sequence.A PracticalApproach”(IRL Press, Oxford, England,1987) ；Reznikoff W 編，“Maximizing GeneExpression，，(Butterworths Publishers, Stoneham, MA, US,1987) ；Davis L 等，“BasicMethods in Molecular Biology” (Elsevier Science Publishing C0., New York, NY,US,1986) ；Schleef M 編，“Plasmid for Therapy and Vaccination”(Wiley-VCH VerlagGmbH, ffeinheim, Germany2001) ；Adereth Y 等，Biotechniques2005, 38:864-868 ；AllanJ 等，Biotechniquesl995 ；18:746-750 ；Bubeck A 等，J.Virol.2004，78:8026-8035 ；Doran B，美國專利公開 20070111201 ;Locher C 等，DNA Cell Biol.2005 ；24:256-263 ；Vasl J 等，Biotechniques2004 ；37:726-730 ；ffeiss G 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA2000 ；97:8950-8954和Delcourt M，US6，924，112。誘變策略包括隨機誘變、丙氨酸掃描誘變(Ala-scan mutagenesis)、位 點特異性誘變和嵌合重組。誘變試劑盒和服務(wù)是廣泛市售的。
[0043]術(shù)語“中和抗體”包括BNAb的亞類。本文使用的“廣泛中和抗體”或“BNAb”應理解為通過任何方法得到的這樣的抗體，當其以有效劑量遞送時可用作治療劑用于針對多于7 種 HIV 毒株(優(yōu)選多于8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 或更多種 HIV 毒株)預防或治療HIV感染或AIDS。用于根據(jù)本發(fā)明之RIS方法的合適中和抗體包括但不限于，針對近膜端外部區(qū)(membrane-proximal external region,MPER)的抗體、針對CD4結(jié)合位點的抗體和針對高甘露糖聚糖的抗體。在一些優(yōu)選實施方案中，用于根據(jù)本發(fā)明方法之RIS方法的中和抗體包括選自以下的抗體中的一種或更多種:
[0044]a)識別gp41胞外結(jié)構(gòu)域中鄰近病毒膜的區(qū)段的4E10抗體。參見Cardoso R,等，Immunity2005 ；22:163-173，PHSL 登錄號 90.091703,NIH ARRRP 目錄號 10091 和 KatingerH 等，US5, 753，503 ；
[0045]b)識別gp41胞外結(jié)構(gòu)域中鄰近病毒膜的區(qū)段的2F5抗體。參見Ofek G,等，J.Virol.2004 ；78:10724-10737，PHSL 登錄號 90.091704，NIH ARRRP 目錄號 1475 和Katinger (見上文)；[0046]c)EP0822941中描述的與HIV-1的兩種不同抗原決定簇結(jié)合的抗體，其中所述抗原決定簇是gpl60的片段，以及對應于處理的HIV-1分離株BHlO中g(shù)pl20的79至184位和326至400位氨基酸。參見PHSL登錄號95032240和95032241 ；
[0047]d)識別gpl20外部表面上的碳水化合物的2G12(mAb2G12)。參見Trkola A等，J.Virol.1996 ；70:1100-1108，EACC 登錄號 93091517 和 NIH ARRRP 目錄號 1476 ；
[0048]e)識別 CD4 結(jié)合位點的 bl2 抗體。參見 Burton D 等，Sciencel994 ；266:1024-1027，NIH ARRRP 目錄號 2640 和 Burton D 等，EP0675904 ;以及
[0049]f)中和抗體PG9、PG16、PG20、PGG14 和 PGC14。參見 Chan-Hui P 等，TO2010107939。
[0050]本領(lǐng)域中已描述了用于確定抗體是否是nAb的方法。這些方法中有一些是基于，確定使用編碼報道基因的接受細胞系進行單輪病毒感染后抗體對報道基因表達之作用的減少。參見 Li，2005，Wei，2003，Montefiori，2005(見上文)和 Alvin C，W02009117661。
[0051]根據(jù)本發(fā)明使用的抗體的中和能力可通過IC50(即，引起靶細胞感染降低50%的抗體濃度)進行表征。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明使用的中和抗體的IC50為2yg / mL或更低(小于 0.15 μ g / mL、小于 0.125 ug/ mL、小于 0.10 μ g / mL、小于 0.075 μ g / mL、小于 0.05 μ g / mL、小于 0.025yg / mL、小于 0.02yg / mL、小于 0.015yg / mL、小于0.0125 μ g / mL、小于 0.0lyg / mL、小于 0.0075 μ g / mL、小于 0.005yg / mL 或小于0.004 μ g / mL(抗體濃度為10_8或更低、優(yōu)選10-9Μ或更低、優(yōu)選KTiqM或更低，即10_nM、10_12M、10_13M或更低)。這意味著在體外中和HIV臨床分離株的50%僅需要非常低的抗體濃度?？梢允褂帽绢I(lǐng)域所述的標準中和測定來測量效力。
[0052]在足以使得重組病毒文庫中能夠與中和抗體特異性結(jié)合的那些成員確實與所述抗體結(jié)合的條件下進行接觸步驟。
[0053]本文使用的術(shù)語“特異 性結(jié)合”(或其衍生詞)指結(jié)合對(例如，兩種蛋白質(zhì)或化合物)之間的相互作用。在一些實施方案中，相互作用的親和常數(shù)為至多10_6摩爾/升、至多10_7摩爾/升或至多10_8摩爾/升。一般來說，短語“特異性結(jié)合”指一種化合物與另一種化合物的特異性結(jié)合，其中通過任何標準測定(例如，免疫測定)所測量的結(jié)合水平在統(tǒng)計上顯著高于測定的背景對照。
[0054]接觸步驟期間的條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員以常規(guī)方式進行確定。示例性的“接觸”條件可包括孵育15分鐘至4小時(例如，在4°C、37°C或室溫下孵育I小時)。然而，這些可以根據(jù)例如相互作用的結(jié)合伴侶的性質(zhì)而視情況改變。樣品可任選地并優(yōu)選地經(jīng)歷溫和搖動、混合或旋轉(zhuǎn)。此外，可添加其他適當?shù)脑噭?，例如降低非特異性結(jié)合的封閉劑。例如，可使用I %至4%的BSA或其他合適的封閉劑(例如，乳)。然而，應理解，接觸條件可以不同并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)篩選方法的目的來調(diào)整。例如，如果孵育溫度是例如室溫或37°C，則這可增加鑒定在這些條件下穩(wěn)定的結(jié)合劑(binder)(例如，在在37°C孵育的情況下，在人體條件下穩(wěn)定的結(jié)合劑)的可能性。如果結(jié)合伴侶之一或兩者是一些治療應用中待使用的候選物(例如，抗體)，則這樣的特性可能是極其有利的。這樣的調(diào)整在技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。
[0055]在一個優(yōu)選實施方案中，可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)(在專利和科學文獻中有充分描述)將用于接觸步驟的中和抗體固定在固體支持物上。固體支持物可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的抗體可與其連接的任何材料。例如，固體支持物可以是微滴定板中的測試孔或硝酸纖維素濾膜或其他合適的膜?；蛘?，支持物可以是珠或盤，例如玻璃、纖維玻璃、乳膠或塑性材料(例如聚苯乙烯或聚氯乙烯)。支持物也可以是磁性顆?；蚬饫w傳感器。參見 Jorgenson R 等，US5, 359，681。
[0056]可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種技術(shù)(在專利和科學文獻中有充分描述)將抗體固定在固體支持物上。在本發(fā)明的上下文中，固定包括非共價締合(例如，吸附)和共價結(jié)合(其可以是抗原與支持物上的官能團之間的直接連接或可以是借助交聯(lián)劑的連接)兩種。優(yōu)選通過吸附至微滴定板的孔或膜進行固定。在這樣的情況下，吸附可通過在合適緩沖液中使抗體與固體支持物接觸合適時間來實現(xiàn)。接觸時間隨溫度而改變，但是通常在約I小時與I天之間。在一個實施方案中，使塑料微滴定板(例如聚苯乙烯或聚氯乙烯)的孔與量為約IOng至約1 μ g并且優(yōu)選約100至200ng的抗體接觸足以固定足夠量的多肽。
[0057]抗體與固體支持物的共價結(jié)合還可通過首先使支持物與雙功能試劑反應來實現(xiàn)，所述雙功能試劑會與支持物和抗體上的官能團(例如羥基或氨基)二者反應。例如，可使用公知技術(shù)，使用苯醌或通過使支持物上的醛基與結(jié)合伴侶上的胺和活性氫縮合使抗體與具有適當聚合物涂層的支持物共價結(jié)合。
[0058]或者，代替將中和抗體共價或非共價地固定在支持物上，本發(fā)明考慮了這樣的可行性，通過與第一抗體(對之前已固定在支持物上的Fe或抗Fe抗體片段特異)結(jié)合來固定抗體。除了幫助捕獲抗體之外，第一抗體使中和抗體定向以增加對于與病毒文庫成員結(jié)合具有活性的固定化抗體的百分比。例如，固定可這樣來進行，即首先使已固定在固體支持物(通常為微滴定板的孔)上的抗體與文庫接觸，使得允許文庫中對中和抗體樣品顯示出親和力的那些病毒與固定化抗體結(jié)合。然后將未結(jié)合的樣品從固定化抗體-病毒復合物中移除。更特別地，一旦如上所述使抗體固定在支持物上，通常封閉支持物上剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點。
[0059]A.2分離步驟
[0060]在第二步中，本發(fā)明的RIS方法包括基于與中和抗體結(jié)合的能力，將重組病毒文庫中與中和抗體結(jié)合的成員與不發(fā)生此結(jié)合的成員相分離。
[0061]所述分離步驟可涉及物理分離(例如，在珠上或FACS)或?qū)⒐滔鄰姆磻旌衔镏幸瞥?，或者可涉及這樣的步驟，其中使固相經(jīng)歷一次或更多次洗滌步驟以移除反應混合物的其他組分。在其中進行物理分離或移除固相的實施方案中，優(yōu)選使固相也經(jīng)歷一次或更多次洗滌步驟。
[0062]洗滌步驟可根據(jù)固相和與其結(jié)合的相互作用結(jié)合伴侶的性質(zhì)以任何適當方式來進行。洗滌顆粒固相的適當方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。例如，如果固相是顆粒，則可通過在顆粒形成沉淀的條件下離心顆粒并且移除上清液來進行洗滌步驟。然后，可將顆粒重懸于適當?shù)乃越橘|(zhì)(例如，接觸步驟中采用的相同介質(zhì))中。洗滌(或?qū)嶋H上，接觸步驟)的強度(stringency)可通過添加本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的適當試劑(例如，吐溫)進行調(diào)整，以例如降低背景或非特異性性結(jié)合。這樣的沉淀和重懸步驟構(gòu)成一次洗滌。可進行任何適當次數(shù)的洗滌。然而，如果固相是磁性的，則洗滌步驟可常規(guī)地通過以下過程來進行:施加磁場于其中已進行接觸步驟的容器，移除上清液并將固相重懸于適當?shù)乃越橘|(zhì)中。這樣的磁性分離和重懸步驟構(gòu)成一次洗滌步驟，并且可進行任何適當次數(shù)的洗滌。如果固體支持物是非顆粒的(例如，是平表面，例如板、盤或濾膜)，則洗滌這些固相的適當方法同樣對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。
[0063]與上述的任選洗滌步驟相同，應注意，在RIS方法的任何其他適當階段也可進行一次或更多次的洗滌步驟。例如，也可在已進行任何固定步驟之后進行一次或更多次的洗滌固相的步驟，例如以移除未與固相結(jié)合的中和抗體。實際上，優(yōu)選這樣的洗滌步驟。另外，可在所述方法過程的其他適當時間對固相進行一次或更多次洗滌步驟，以移除例如未結(jié)合的實體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定所需的洗滌次數(shù)。
[0064]一旦移除反應混合物中與中和抗體弱結(jié)合的非特異性結(jié)合的組分，最后通過洗脫重組病毒文庫中已與中和抗體特異性結(jié)合的那些成員來進行分離步驟。根據(jù)固定類型，所述洗脫步驟可通過任何合適方法進行，例如，通過采用破壞非共價鍵的堿，去污劑或類似試劑，然后中和，以使得相互作用的伴侶重新折疊并與彼此結(jié)合。一般來說，在生物素標簽的情況下，將包含這種標簽的文庫構(gòu)建體改造成包含用于切割的一些類型的位點，像蛋白酶位點、限制酶位點或可用二硫蘇醇糖(DTT)打開的可切割S-S接頭部分。也可使用TEA。切割位點(例如上述的那些)可與任何類型的標簽一起使用以使得能夠洗脫或有助于洗脫。
[0065]由洗脫步驟引起的病毒從中和抗體中的釋放通?？赏ㄟ^測量上清液中一種或更多種病毒多肽的存在來進行。在一個優(yōu)選實施方案中，測定的多肽是病毒衣殼多肽。當特別地使用HIV文庫時，可適用于一些本文所示實施方案的HIV蛋白質(zhì)的非限制性實例包括HIV gag 蛋白 p53、p24、pl7、p7、p6、p2 或 pi ；HIV env 糖蛋白 gpl20、gp41 或 gpl60 ；HIV酶包括整合酶(p31)、逆轉(zhuǎn)錄酶(p51或p66)、RNA酶H(pl5)、蛋白酶(plO)、HIV nef蛋白(p25 / p27)、HIV vif 蛋白 p23、HIV rev 蛋白 pl9、HIV vpr 蛋白(pl2 / plO)、HIV vpU 蛋白(pl6)或HIV tat蛋白(pl6 / pl4)。在一個優(yōu)選實施方案中，用于確定所選擇的病毒是否已從中和抗體中有效洗脫所測定的HIV多肽是p24。
[0066]本文使用的術(shù)語“HIV p24”指HIV gag區(qū)域的基因產(chǎn)物，其特征在于表觀相對分子量為約24，000道爾頓。術(shù)語“HIV p24”還指具有p24免疫學活性的p24的修飾形式和片段。`
[0067]可通過酶免疫測定來測量p24，而結(jié)合p24的檢測需要用酸進行預處理以解離復合物。雖然制造商之間使用的方法不同，但是HIV p24抗原測試采用進行了改造以檢測抗原而非抗體的ELISA技術(shù)。在一種代表性測定(例如“抗體夾心”式)中，使針對HIV p24的特異性單克隆抗體與固相(微滴定板孔或聚苯乙烯珠)結(jié)合以在添加時起“捕獲”樣品中病毒抗原的作用。添加去污劑(例如，Triton X100)以破壞病毒體，如果基質(zhì)中存在抗原，則抗原與固相上的單克隆抗體結(jié)合。
[0068]A.3檢測步驟
[0069]在第三步中，根據(jù)本發(fā)明的RIS方法包括確定在步驟(ii)中所選擇的那些文庫成員中病毒表面上展示的所述變體多肽的序列。
[0070]—旦根據(jù)本發(fā)明方法選擇或分離了病毒文庫中的一組或更多組相互作用成員，使這些成員經(jīng)歷進一步的分析。所述進一步的分析或使用一般需要使候選結(jié)合伴侶與中和抗體分開、移除、分離或洗脫并且進行進一步的表達或產(chǎn)生。因此，本發(fā)明的方法還包括這樣的步驟，其中使病毒文庫中能夠與中和抗體特異性相互作用的所述成員分開、移除、洗脫或優(yōu)選分離，或者在彼此分離的情況下被表達或產(chǎn)生。所述進一步分析一般涉及通過以下來分離單個相互作用文庫成員:通過從結(jié)合病毒分離RNA，使病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA并將所述cDNA克隆到合適的表達載體中。
[0071]一旦編碼結(jié)合伴侶的DNA被克隆到合適的表達載體中，可對編碼結(jié)合伴侶的DNA進行測序，或可以以可溶形式表達蛋白質(zhì)并使其經(jīng)歷適當?shù)慕Y(jié)合研究以進一步在蛋白質(zhì)水平表征候選物。適當?shù)慕Y(jié)合研究取決于結(jié)合伴侶的性質(zhì)，并且包括但不限于ELISA、過濾篩選測定、FACS或免疫熒光測定、BiaCore親和力測量或定量結(jié)合常數(shù)的其他方法、染色組織切片或細胞以及其他免疫組織化學方法。這樣的方法在文獻中已良好記載并且他們的一種或更多種可用于分析所選擇的包膜蛋白變體。
[0072]如上所提到的，用于分析單個相互作用結(jié)合伴侶的適當方法是本領(lǐng)域已知的。一種優(yōu)選方法是，對文庫中與中和抗體特異性結(jié)合的病毒的遺傳物質(zhì)進行測序。
[0073]通常，在具有RNA作為遺傳物質(zhì)的逆轉(zhuǎn)錄病毒的情況下，檢測步驟包括分離RNA，使RNA逆轉(zhuǎn)錄以得到單鏈cDNA，處理單鏈DNA以得到雙鏈DNA，將雙鏈cDNA克隆到所選擇的載體中并對cDNA進行測序。
[0074]逆轉(zhuǎn)錄使用本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知的方法進行，并且可等溫地，以及在RNA依賴性DNA聚合酶存在下通過使用熱穩(wěn)定的RNA聚合酶進行，所述RNA依賴性DNA聚合酶包括但不限于，AMV、克隆的AMV、MMLV> Superscriptll、ReverTraAce> Tth逆轉(zhuǎn)錄酶、乙型肝炎逆轉(zhuǎn)錄酶、花椰菜花葉病毒逆轉(zhuǎn)錄酶、細菌逆轉(zhuǎn)錄酶和Thermoscript。本發(fā)明采用的酶包括RNA酶H活性被降低、大大被降低或完全消除的那些酶?！癛NA酶H活性大大降低”的酶意指具有小于約20 %，優(yōu)選小于約15 %、10 %或5 %，并且最優(yōu)選小于約2 %的相應野生型或RNA酶H+酶的RNA酶H活性的酶，例如野生型莫羅尼鼠白血病病毒(M-MLV)、禽成髓細胞增多癥病毒(AMV)或勞斯氏肉瘤病毒(RSV)逆轉(zhuǎn)錄酶。任何酶的RNA酶H活性可通過多種已知測定來確定。參見 Kotewicz M 等，Nucl.Acids Res.1988 ; 16:265-277, Gerard G 等，F(xiàn)ocusl992 ；14(5):91-93 和 Kotewicz M 等，US5, 244，797。用于本發(fā)明的一些特別優(yōu)選的多肽包括但不限于，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、RSV逆轉(zhuǎn)錄酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RAV (勞氏相關(guān)病毒)逆轉(zhuǎn)錄酶、MAV (成髓細胞增多癥相關(guān)病毒)逆轉(zhuǎn)錄酶和HIV逆轉(zhuǎn)錄酶。參見Kotewicz M等，US5，244，797和Gerard G等，W01998047912。然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應理解，能夠由核糖核酸分子產(chǎn)生DNA分子(即，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性)的任何酶可等價地用于本發(fā)明的組合物、方法和試劑盒。
[0075]可使用本領(lǐng)域已知的任何方法處理單鏈cDNA以得到雙鏈DNA。優(yōu)選地，使用體外擴增技術(shù)進行單鏈dDNA向雙鏈DNA的轉(zhuǎn)化，例如聚合酶鏈反應(PCR)、連接酶鏈反應(LCR)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、鏈置換擴增(SDA)、轉(zhuǎn)錄介導的擴增(TMA)、支鏈DNA 技術(shù)(Branched DNA technology, bDNA)、接頭輔助的 DNA 擴增(linker-aided DNAamplification,LADA)、ζ)β復制酶擴增(Q-beta)、環(huán)介導的等溫擴增(LAMP)和滾動環(huán)擴增技術(shù)(Rolling Circle Amplification Technology, RCAT)或其他體外酶擴增技術(shù)。使用對應于適配體(adapter)區(qū)域之序列的引物進行擴增步驟。所得雙鏈DNA可使用柱純化、與引物結(jié)合的電磁珠、或通過瓊脂糖凝膠電泳進行純化。
[0076]然后可使用本領(lǐng)域已知方法將所得雙鏈DNA插入到選定載體中。在一個優(yōu)選實施方案中，在PCR擴增步驟期間使用的引物在其5’區(qū)中包含用于限制性內(nèi)切酶的靶位點，其產(chǎn)生與選定載體中存在的那些相容的末端。內(nèi)切酶靶位點允許產(chǎn)生可用于在適當載體中克隆多核苷酸的粘性末端。[0077]可使用任何已知的測序手段進行測序步驟，例如化學測序(Maxam-Gi Ibert)、Sanger雙脫氧測序、焦磷酸測序(pyrosequencing)、突光檢測測序和質(zhì)譜DNA測序。
[0078]B.免疫原性多肽、多核苷酸、載體和宿主細胞
[0079]根據(jù)本發(fā)明的快速免疫原選擇(RIS)方法允許鑒定這樣的多肽，其是在病毒表面上展示的多肽的變體并且是用于產(chǎn)生中和抗體(并因此將其用作免疫原性組合物或疫苗)的候選物。因此，在另一方面中，本發(fā)明涉及通過本發(fā)明方法鑒定的多肽。
[0080]在本文中可與蛋白質(zhì)互換使用的術(shù)語“多肽”指任何長度的氨基酸鏈，其中不同的氨基酸通過肽鍵或雙硫橋彼此連接。
[0081]在根據(jù)本發(fā)明方法選擇的病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒的具體情況下，多肽是包膜蛋白的變體。在一個優(yōu)選實施方案中，逆轉(zhuǎn)錄病毒是HIV并且根據(jù)本發(fā)明的多肽是gpl20變體。
[0082]根據(jù)本發(fā)明RIS方法鑒定的多肽優(yōu)選在選自以下的區(qū)域中包含至少一個突變:C1恒定區(qū)、Vl可變區(qū)、V2可變區(qū)、C2恒定區(qū)、C5恒定區(qū)和gp41胞外結(jié)構(gòu)域。
[0083]在一個更優(yōu)選的實施方案中，Cl恒定區(qū)中的突變是第88位上的突變。在一個更優(yōu)選的實施方案中，第88位上的突變殘基是Asp。在一個更更優(yōu)選的實施方案中，Cl恒定區(qū)中的突變是N88D突變。
[0084]在一個更優(yōu)選的實施方案中，Vl可變區(qū)中的突變是在選自第131位、132位和138位的一個或更多個位置處的突變。在一個更優(yōu)選的實施方案中，Vl區(qū)中第131位、132位和138位上的突變殘基分別是Y、N和/或G。在一個更更優(yōu)選的實施方案中，Vl區(qū)中的突變是 C131Y、T132N 和 / 或 D138G。
[0085]在一個更優(yōu)選的實施方案中，V2可變區(qū)中的突變是在選自第160位和187位的一個或更多個位置處的突變。在一個更優(yōu)選的實施方案中，V2區(qū)中的突變殘基是第160位上的Y和/或第187位上的Asp。在一個更更優(yōu)選的實施方案中，V2區(qū)中的突變是N160Y和/ 或 N191D。
[0086]在一個更優(yōu)選的實施方案中，C2恒定區(qū)中的突變是第219位上的突變。在一個更優(yōu)選的實施方案中，C2區(qū)中第219位上的突變殘基是Val。在一個更更優(yōu)選的實施方案中，C2區(qū)中的突變是I219V。
[0087]在一個更優(yōu)選的實施方案中，C5恒定區(qū)中的突變是在選自第479位和507位的一個或更多個位置處的突變。在一個更優(yōu)選的實施方案中，C5區(qū)中第479位和507位上的突變殘基分別是Ile和Trp。在一個更優(yōu)選的實施方案中，C5區(qū)中的突變是M475I和/或R507W。
[0088]在一個更優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明突變的gpl20變體或其片段攜帶C131Y、T132N、D138G 和 N160Y 突變。
[0089]在一個更優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明突變的gpl20變體或其片段攜帶N88D、C131Y、T132N、D138G、N160Y、N191D、A226V、M4791、R507W 和 Y647N 突變。
[0090]在另一個實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的gpl20變體或其片段攜帶N203S和G604E突變。
[0091]在一個更優(yōu)選的實施方案中，gp41胞外結(jié)構(gòu)域中的突變是T643N。
[0092]上述位置的編號指由SEQ ID NO:2所示HIV AC10HXb2分離株的env基因(SEQ IDNO:1)編碼的gpl60前蛋白的序列，其由SEQ ID NO:1所述env基因編碼。參見Li，2005 (見上文)和NCBI登錄號AY835446。
[0093]在一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的免疫原性多肽包含由SEQ ID NO:3的多核苷酸編碼的LRl-Cl分離株(SEQ ID NO:4)之enV多肽或其片段。LRl-Cl分離株包含對應于 SEQ ID NO:2 編號的 N88D、C131Y、T132N、D138G、T132N、N160Y、N191D、A226V、M4791、R507W 和 Y647N 突變。
[0094]在一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的免疫原性多肽包含用PG16抗體分離的克隆10的env多肽(SEQ ID NO:31)或其片段。經(jīng)修飾序列顯示出N203S和G604E突變。
[0095]在一個優(yōu)選實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的免疫原性gpl20變體或其片段包含選自以下的序列:SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO: 24,SEQ ID NO:25,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:
27、SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29 和 SEQ ID NO:31。
[0096]雖然顯示出針對在本說明書中已確定的中和抗體親和力增加的gpl20突變體來源于AC10HIV分離株(NCBI登錄號AY835446和SEQ ID NO:1所示env基因)，但是應理解，根據(jù)本發(fā)明的免疫原性多肽可通過替換其他HIV分離株env基因的相應位置而來源于所述其他HIV分離株。其他HIV分離株中的相應位置可使用任何合適的序列比對算法無需進一步步驟而直接測定。
[0097]用于比較的序列比對方法在本領(lǐng)域是公知的。可例如通過Smith-Waterman局部同源性算法、通過Needleman-Wunsch同源性比對算法、通過Pearson-Lipman相似性搜索法、通過這些算法的電腦化執(zhí)行或通過手動比對和目測觀察來進行用于比較的序列最佳比對。參見 Smith T, Waterman M, Adv.App1.Math.1981 ；2:482-489 ；Needleman S, WunschC, J.Mol.Biol.1970 ；48:443-453 ；Pearsonff, Lipman D, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA1988 ；85:2444-2448 ；the GAP, BE STFIT, FASTA and TFASTA programs, Wisconsin GeneticsSoftware Package, Geneti cs Computer Group, Madison, WI, US ；Ausubel F 等編，“ShortProtocols in Molecular Biology”,第 4 版(John Wiley and Sons, Inc., New York, NY,US)。
[0098]“片段”是編碼本發(fā)明HIV-1包膜多肽的多核苷酸的獨特部分，其長度短于來源序列(parent sequence) 0類似地，術(shù)語“片段”指，包含多至減去一個氨基酸殘基的所定義肽序列全長的本發(fā)明HIV-1包膜多肽，以及其編碼核苷酸序列。例如，片段可包含5至2500個連續(xù)核苷酸或氨基酸殘基。用作探針、引物、抗原、治療分子或用于其他目的的片段的長度可以是至少 5、10、15、16、20、25、30、40、50、60、75、100、150、250、500 個或至少 700 個連續(xù)核苷酸或氨基酸殘基。片段可優(yōu)選地選自分子的某些區(qū)域。例如，多肽片段可包含選自多肽前250個或500個氨基酸(或前25%或50% )(如所定義的某定義序列所示的)的某一長度的連續(xù)氨基酸。清楚的是，這些長度是示例性的，并且本發(fā)明實施方案可包括本說明書(包括序列表、表格和附圖)所支持的任意長度。
[0099]本公開內(nèi)容涉及核酸構(gòu)建體，其包含編碼HIV-1抗原性gpl20多肽的多核苷酸序列。這些多核苷酸包括編碼目的多肽的DNA、cDNA和RNA序列。
[0100]本發(fā)明使用的術(shù)語“多核苷酸”指通過可變數(shù)目的單體形成的多聚體，其中所述單體是核苷酸，包括核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸兩種。所述多核苷酸包含通過甲基化修飾的單體以及未修飾形式。術(shù)語“多核苷酸”和“核酸”在本發(fā)明中可互換使用并且包括mRNA、cDNA和重組多核苷酸。本發(fā)明所使用的多核苷酸不限于與在天然狀態(tài)下所呈現(xiàn)的相同的多核苷酸，而包括包含非天然核苷酸類似物和核苷酸間鍵的多核苷酸。
[0101]用于將本發(fā)明核酸進行操縱并插入載體中的方法在本領(lǐng)域是公知的。參見Sambrook, 1989 (見上文)和 Ausubel F等編，“Short Protocols in Molecular Biology”,第 4 版(John Wiley and Sons, Inc., New York, NY, US, 2002)。
[0102]通常，編碼本發(fā)明gpl20多肽的核酸構(gòu)建體是質(zhì)粒。然而，可使用其他載體(例如，病毒載體、噬菌體、粘粒)來復制核酸。在本發(fā)明的上下文中，核酸構(gòu)建體通常是表達載體，其包含有助于所插入的基因序列有效轉(zhuǎn)錄的啟動子序列。表達載體通常包含復制起點、啟動子以及允許對轉(zhuǎn)化細胞進行表型選擇的特異性核酸序列。
[0103]更一般地，可使編碼本發(fā)明gpl20多肽的多核苷酸序列與能夠在引入到宿主細胞后驅(qū)動核酸表達的任何啟動子和/或增強子可操作性連接。啟動子是引導核酸轉(zhuǎn)錄的一列核酸控制序列。啟動子包括(可)接近轉(zhuǎn)錄起始位點的必需核酸序列，例如在II型聚合酶啟動子的情況下(TATA元件)。啟動子還可包含可位于距轉(zhuǎn)錄起始位點多至幾千個堿基對的遠端增強子或抑制元件。包括組成型和誘導型啟動子兩種。參見Bitter G等，Meth.Enzymol.1987 ； 153:516_544。
[0104]為了產(chǎn)生這樣的核酸構(gòu)建體，將編碼gpl20多肽的多核苷酸序列插入到合適的表達載體(例如質(zhì)粒表達載體)中。用于生產(chǎn)編碼gpl20多肽的多核苷酸序列和用于在體外操縱它們的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。參見Sambrook，1989和Ausubel，2002 (見上文)。
[0105]可將編碼免疫原性gpl20多肽的多核苷酸序列插入到表達載體中，所述表達載體包括但不限于質(zhì)粒、病毒或可被操縱以允許插入或整合序列并且可在原核生物或真核生物中表達的其他運載體中。宿主可包括微生物、酵母、昆蟲和哺乳動物生物體。在原核生物中表達具有真核生物或病毒序列的DN`A序列的方法在本領(lǐng)域是公知的。能夠在宿主中表達并復制的生物功能性病毒和質(zhì)粒DNA載體在本領(lǐng)域是已知的。
[0106]用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的常規(guī)技術(shù)來進行。在宿主是原核生物(例如大腸桿菌)的情況下，可使用本領(lǐng)域公知的步驟由在對數(shù)生長期后收獲并隨后經(jīng)CaCl2法處理的細胞制備能夠進行DNA攝取的感受態(tài)細胞?；蛘?，可使用MgCl2或RbCl。轉(zhuǎn)化也可在形成宿主細胞的原生質(zhì)體(如果期望的話)后或通過電穿孔進行。
[0107]當宿主細胞是真核生物時，可使用這樣的DNA轉(zhuǎn)染方法，例如磷酸鈣共沉淀、常規(guī)機械方法(例如微注射)、電穿孔、插入包埋在脂質(zhì)體中的質(zhì)粒、或病毒載體。也可用編碼免疫原性gpl20多肽的多核苷酸序列和編碼可選擇表型的第二外源DNA分子(例如單純性皰疹胸苷激酶基因)共轉(zhuǎn)化真核細胞。另一種方法是使用真核生物病毒載體(例如猴病毒40 (SV40)或牛乳頭瘤病毒)來瞬時感染或轉(zhuǎn)化真核細胞并表達蛋白質(zhì)。參見Gluzman Y編，“Eukaryotic Viral Vectors，，(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor, NY, US,1982)。
[0108]C.抗體
[0109]根據(jù)本發(fā)明的gpl20變體或其片段也可用于產(chǎn)生抗體，當對象的生物流體中存在病毒或其顆粒時所述抗體產(chǎn)生能夠識別并中和HIV。因此，在另一方面中，本發(fā)明涉及與根據(jù)本發(fā)明的免疫原性多肽特異性結(jié)合的抗體。[0110]如本發(fā)明中所使用的，術(shù)語“抗體”指這樣的單體蛋白或多聚體蛋白質(zhì)，其包含具有與確定抗原相結(jié)合的能力并且包含免疫球蛋白分子輕鏈或重鏈可變區(qū)之全部或部分的至少一種多肽。本發(fā)明的抗體包括但不限于，單克隆抗體、單特異性抗體、多克隆抗體、多特異性抗體、雙抗體(diabody)、三抗體(triabody)、四抗體(tetrabody)、人抗體、人源化抗體、駱騎化抗體(camelized antibodies)、嵌合抗體、單鏈抗體、單域抗體(single domainantibody)、Fab片段、F (ab) ’片段、F (ab) ’ 2片段、Fv片段(即，抗體的最小功能模塊)、單鏈Fv (scFv)、二硫化物穩(wěn)定化Fv (dsFv)、Fd、VH、VL、Va、V0和抗獨特型(抗Id)抗體(例如，針對本發(fā)明抗體的抗Id抗體)、內(nèi)抗體(intrabody)和任意上述抗體的表位結(jié)合片段。在一些實施方案中，抗體是單克隆抗體。在另一些實施方案中，抗體是Fv片段，包括
Vl區(qū)。
[0111]可利用本發(fā)明的肽通過常規(guī)手段產(chǎn)生這些抗體。參見Kieber-Emmons T等，W01991004273。例如，可通過以下方法產(chǎn)生多克隆抗體:用以上鑒定的肽之一或兩種或多價構(gòu)建體常規(guī)地刺激所選擇動物的免疫系統(tǒng)，允許免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對其的天然抗體，并從動物血液或其他生物流體中收集 這些抗體。通過使用如上所述的多價構(gòu)建體作為抗原可得到高效價的多克隆抗體。所得抗體能夠結(jié)合與感染對象的生物流體中存在的形式相同的選定HTV抗原。
[0112]另外，本發(fā)明的肽還可用于產(chǎn)生這樣的抗體，其可用作模板以產(chǎn)生抗獨特型抗體，所述抗獨特型抗體具有肽序列所含中和表位結(jié)構(gòu)的內(nèi)影像(internal image)。然后這些抗體(多克隆或單克隆抗體)可用于疫苗制劑或主動免疫療法。因此，本發(fā)明還包括攜帶有肽的內(nèi)影像的單克隆或多克隆抗體，以及用于產(chǎn)生這些抗體的方法。參見Kieber-Emmons (見上文)。
[0113]在期望得到單克隆抗體(MAb)并將其用于本發(fā)明的組合物和方法的情況下，可使用公知的常規(guī)技術(shù)通過使用可用的腫瘤細胞系產(chǎn)生表達期望MAb的雜種瘤細胞系。參見KihIer G, Milstein C, Naturel975 ；256(5517):495_497。
[0114]重組抗體可使用用于其生產(chǎn)的已知技術(shù)來產(chǎn)生。參見Huse W等，Sciencel989 ;246:1275-1281。期望的高效價抗體也可通過對針對這些抗原開發(fā)的單克隆或多克隆抗體采用已知的重組技術(shù)來產(chǎn)生。參見Amit R等，Sciencel986 ;233:747-753 ;Queen C等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA1988 ；86:10029-10033 ；Riechmann L 等，Nature 1988 ；332:323-327 和 Barbas C 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA1992 ；89:4457-4461 以及 Winter P,GB2188638。
[0115]D.能夠產(chǎn)生中和抗體的免疫原性組合物
[0116]本文公開的gpl20變體多肽和編碼變體gpl20多肽的核酸分子可用作免疫原或用于產(chǎn)生免疫原以引發(fā)針對gpl20或gpl20表達病毒的免疫應答(免疫原性組合物)，從而預防、降低或控制例如HIV-1感染或其相關(guān)癥狀。在施用治療有效量的所公開的治療組合物后，可監(jiān)測對象的HIV-1感染、與HIV-1感染相關(guān)的癥狀，或兩者。因此，在另一方面中，本發(fā)明涉及這樣的免疫原性組合物，其包含根據(jù)本發(fā)明的HIV-lgpl20變體多肽或其免疫原性片段、編碼所述多肽的多核苷酸或包含所述多核苷酸的表達載體。
[0117]適用于免疫原性組合物的gpl20的合適免疫原性片段包括大小相對小的肽,例如，大小為約5至100個氨基酸，例如約5、約6、約7、約8、約9、約10、約15、約20、約25、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90或約100個氨基酸。因此，gpl20多肽的片段(例如，表位或其他抗原性片段)例如本文所述的任意gpl20多肽或其片段可用作免疫原。
[0118]術(shù)語“免疫原性組合物”指引發(fā)免疫應答從而產(chǎn)生針對特定免疫原的抗體或細胞介導免疫應答的組合物?？蓪⒖勺⑸浣M合物制備成例如液體溶液、懸液和乳液。術(shù)語“抗原性組合物”指可被宿主免疫系統(tǒng)識別的組合物。例如，抗原性組合物包含可被宿主免疫系統(tǒng)的體液(例如，抗體)和/或細胞(例如，T淋巴細胞)組分識別的表位。
[0119]術(shù)語“疫苗”指用于體內(nèi)施用于宿主(可以是靈長類動物，特別是人宿主)以賦予針對疾病(特別是病毒疾病)的保護的免疫原性組合物。
[0120]根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物可用于治療或預防由HIV感染造成的疾病。在又一方面中，本發(fā)明涉及用于治療或預防由HIV-1感染造成的疾病的根據(jù)本發(fā)明的肽、核酸、載體、免疫原性組合物或疫苗。或者，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的肽、核酸、載體、免疫原性組合物或疫苗在制備用于治療或預防由HIV-1感染造成之疾病的藥物中的用途?；蛘撸景l(fā)明涉及用于治療或預防對象中由HIV-1感染造成的疾病的方法，其包括向所述對象施用根據(jù)本發(fā)明的肽、核酸、載體、或免疫原性組合物或疫苗。
[0121]本文中任何地方使用的術(shù)語“治療”包括任何類型的療法，其目的是終止、預防、改善和/或降低對本文所述臨床病癥的易感性。在一個優(yōu)選實施方案中，術(shù)語治療涉及預防性治療(即，降低本文所定義的臨床病癥、疾病或病癥的異感性的治療)。
[0122]本文使用的術(shù)語“治療”指得到期望的藥理學作用和/或生理學作用，包括哺乳動物(包括人)中病理病癥或疾病的任何治療。所述作用可以是預防性的(在完全或部分預防疾病或其癥狀方面)和/或可以是治療性的(在部分或完全治愈疾病和/或可歸因于疾病的不利影響方面)。即，“治療”包括(I)預防疾病在對象中發(fā)生或復發(fā)；(2)抑制疾病，例如阻止其發(fā)展；(3)停止或終止疾病或至少一種與其相關(guān)的癥狀，使得宿主不再患疾病或其癥狀，例如造成疾病或其癥狀退化，例如通過恢復或修復喪失的、缺少的或缺陷的功能，或刺激低效的過程；或者(4) 減輕、減緩或改善疾病或與其相關(guān)的癥狀，其中使用改善在廣義上指參數(shù)(例如炎癥、疼痛和/或免疫缺陷)幅度至少減少。
[0123]本文使用的術(shù)語“預防”指使動物中病理性細胞的發(fā)生降低。預防可以是完全的(例如，對象中完全不存在病理性細胞)。預防也可以是部分的，例如使得對象中病理性細胞的發(fā)生少于不使用本發(fā)明時發(fā)生的情況。預防還指降低對臨床病癥的易感性。
[0124]根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物還可包含可藥用載體。
[0125]本文中可互換使用的“可藥用載體”、“可藥用稀釋劑”或“可藥用賦形劑”或“可藥用載劑”指任何常規(guī)類型的無毒固體、半固體或液體填充物、稀釋劑、封裝材料或制劑輔料?？伤幱幂d體在所采用的劑量和濃度下對受體基本上是無毒性的，并且與制劑的其他成分相容。例如，用于包含多肽之制劑的載體通常不包含氧化劑和已知對多肽有害的其他化合物。合適的載體包括但不限于，水、右旋糖(dextrose)、甘油、鹽水、乙醇及其組合。載體可包含另外的試劑，例如潤濕劑或乳化劑、PH緩沖劑、或增強制劑效力的佐劑。佐劑可例如選自:A1K(S04)2, AlNa (S04) 2，A1NH4 (S04)，氧化硅，明礬，Al (OH) 3，Ca3(P04)2，高嶺土，碳，氫氧化鋁，胞壁酰二肽，N-乙酰-胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異谷氨酰胺(thr-DMP)，N-乙酰-正胞壁酰(nornuramyl) -L-丙氨酰-D-異谷氨酰胺(CGP11687,也稱為nor_MDP),N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺酰-L-丙氨酸-2-0- 2' -二棕櫚酰-sn-甘油-3-羥基磷酰氧基)-乙胺(CGP19835A，也稱為MTP-PE)，2 %鯊烯/吐溫_g§*.乳液中的RIBI (MPL+TDM+CWS)，脂多糖及其多種衍生物(包括脂質(zhì)A)，弗氏完全佐劑(FCA)，弗氏不完全佐劑，Merck佐劑65，多核苷酸(例如，聚IC和聚AU酸)，來自結(jié)核分支桿菌(mycobacterium, tuberculosis)的臘質(zhì) D、短棒狀桿菌(Corynebacterium parvum)、百日咳桿菌(Bordetella pertussis)以及布魯氏菌屬(Brucella)成員中發(fā)現(xiàn)的物質(zhì)，Titermax, ISCOMS, Quil A，ALUN,脂質(zhì)A衍生物，霍亂毒素衍生物，HSP衍生物，LPS衍生物，合成肽基質(zhì)或GMDP，白介素1，白介素2，Montanide ISA-51和QS-21，CpG寡核苷酸，聚1:C 和 GM-CSF。參見 Hunter R, US5, 554，372 和 Jager E, Knuth A, W01997028816。[0126]根據(jù)本發(fā)明的變體gpl20多肽可與載體共價連接，其是抗原性分子可與之結(jié)合的免疫原性大分子。當與載體結(jié)合時，結(jié)合多肽的免疫原性變得更大。選擇載體以增加結(jié)合分子的免疫原性和/或引發(fā)針對載體的抗體的更高效價，這在診斷、分析和/或治療上是有益的。分子與載體的共價連接可賦予增強的免疫原性和T細胞依賴性。參見Pozsgay V等，PNAS1999 ；96:5194-5197, Lee S 等，J.1mmunol.1976 ；116:1711-1718 和 Dintzis R 等，PNAS1976 ；73:3671_3675?？捎玫妮d體包括聚合性載體，其可以是包含反應部分可與其結(jié)合的一個或更多個官能團的天然物質(zhì)(例如，來自細菌或病毒的多糖、多肽或蛋白質(zhì))、半合成物質(zhì)或合成物質(zhì)。細菌產(chǎn)物和病毒蛋白質(zhì)(例如，乙型肝炎表面抗原和核心抗原)也可用作載體，以及來自較高等生物體的蛋白質(zhì)(例如鑰孔戚血藍蛋白、鱟血藍蛋白、麻仁球蛋白、哺乳動物血清白蛋白和哺乳動物免疫球蛋白)也是如此。用作載體的另一些細菌產(chǎn)物包括細菌壁蛋白質(zhì)和其他產(chǎn)物(例如，鏈球菌或鏈球菌細胞壁和脂多糖(LPS))。
[0127]本發(fā)明還涉及預防或減少與HIV感染相關(guān)的癥狀。這些包括與HIV感染輕微癥狀階段相關(guān)的癥狀，包括例如帶狀疹、皮疹和指甲感染、口瘡、復發(fā)性鼻喉感染和體重減輕。此外，與HIV感染主要癥狀階段相關(guān)的另一些癥狀包括例如口腔和陰道鵝口瘡(念珠菌屬)、持續(xù)性腹瀉、體重減輕、持續(xù)性咳嗽、再活化肺結(jié)核和復發(fā)性皰疹感染(例如感冒瘡(單純性皰疹))?？筛鶕?jù)本發(fā)明進行治療的充分發(fā)展型(full-blown)AIDS的癥狀包括例如，腹瀉、惡心和嘔吐、鵝口瘡和口腔潰瘍、持續(xù)性復發(fā)性陰道感染和子宮癌、持續(xù)性全身性淋巴結(jié)病(PGL)、重度皮膚感染、疣和癬、呼吸道感染、肺炎(尤其是卡氏肺孢子蟲肺炎(Pneumocystis carinii pneumonia, PCP)、帶狀皰疫(或帶狀疫)、神經(jīng)系統(tǒng)問題(例如，疼痛、麻痹或手腳“發(fā)麻(pins and needles) ”、神經(jīng)學異常)、卡波濟氏肉瘤、淋巴瘤、肺結(jié)核和其他機會性感染。
[0128]本發(fā)明的肽、核酸和載體的有益作用包括例如，預防或延遲暴露于HIV的個體的初次感染；降低感染HIV的個體的病毒負荷(virul burden);延長HIV感染的無癥狀期；在病毒水平已通過抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法(ART)降低的HIV感染患者中維持低的病毒載量(viralload);在未用藥患者和經(jīng)ART治療的患者中增加HIV-1特異性和非特異性⑶4T細胞的水平或使CD4T細胞的降低減小，增加患AIDS個體的整體健康或生活質(zhì)量；以及延長患AIDS個體的預期壽命。臨床醫(yī)生可將免疫作用與治療之前患者的情況，或與未治療患者的預期情況進行比較，以確定治療在抑制AIDS方面是否有效。
[0129]免疫原性組合物可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何手段來施用，例如通過肌內(nèi)、皮下或靜脈內(nèi)注射，以及口服、經(jīng)鼻或肛門施用。參見Banga A, “Parenteral ControlledDelivery of Therapeutic Peptides and Proteins,，，in Therapeutic Peptides andProteins (Technomic Publishing C0., Inc., Lancaster, PA, US, 1995)。為了延長妝或蛋白質(zhì)可用于刺激應答的時間，肽或蛋白質(zhì)可作為植入物、油狀注射劑或作為顆粒系統(tǒng)提供。顆粒系統(tǒng)可以是微粒、微膠囊、微球、納米膠囊或類似的顆粒。參見Banga，1995(見上文)。已證明基于合成聚合物的顆粒載體用于充當佐劑，除提供控制釋放之外還增強免疫應答。鋁鹽也可用作佐劑來產(chǎn)生免疫應答。
[0130]免疫原性組合物可配制成適用于精確劑量的個體化施用的單位劑型。在脈沖劑量(pulse dose)中，提供了包含所公開免疫原的免疫原性組合物的團注施用(bolusadministration),然后經(jīng)過不向?qū)ο笫┯盟_免疫原的一段時間段,然后進行第二次團注施用。在治療過程中，可以以單次劑量或多劑量(例如，每天)施用治療有效量的免疫原性組合物。在具體的非限制性實例中，在一天中，在一周中，或在一個月中施用脈沖劑量的包含所公開免疫原的免疫原性組合物。
[0131]每當期望作用(例如降低的HIV-1感染的體征、癥狀或?qū)嶒灲Y(jié)果)時，可施用免疫原性組合物。一般來說，劑量足以治療或改善疾病的癥狀或體征，并且對對象不產(chǎn)生不可接受的毒性?？刹捎萌硎┯没蚓植渴┯?。
[0132]對治療用途有效的量可取決于疾病的嚴重性和患者年齡、體重、一般狀況以及其他臨床因素。因此，適當治療方案的最終確定由主治臨床醫(yī)生做出。通常，體外使用的劑量可在對于原位施用藥物組合物可用的量方面提供有用的指導，并且可使用動物模型來確定治療具體疾病的有效劑量。參見Gilman R等編，Goodman and Gilman' s:The Pharmacological Basis of Therapeutics,第 8 版(Pergamon Press, New York, NY,US, 1990)和 Gennaro A 編，Remington ' s Pharmaceutical Sciences,第 18 版(MackPublishing C0.,Easton,PA,US, 1990)。通常，gpl20 多肽的劑量范圍為約 0.1 μ g / kg 體重至約IOOmg / kg體重。另一些合適的范圍包括約lyg/ kg體重至IOmg / kg體重的劑量。在一個實例中，劑量是約1.0 μ g至約50mg肽/對象,例如I μ g至Img肽/對象,例如Img肽/對象。給藥安排可根據(jù)臨床因素(例如對象對肽的敏感性及其疾病的發(fā)展速度)在每天到稀少到一年一次變化。因此，對象可接受第一劑量所公開的治療分子，然后在稍晚時候，例如至少一天后，例如至少`一周后，接受第二劑量(或甚至更多劑量)。
[0133]本文所公開的藥物組合物可以以劑量單元制備并施用。固體劑量單元包括片劑、膠囊、透皮遞送系統(tǒng)和栓劑。既可通過以單個劑量單元或幾次較小劑量單元的形式單次施用，也可通過在特定間隔細分劑量的多次施用來進行治療量的施用。合適的單次或分次劑量包括但不限于約0.01、0.1、0.5、1、3、5、10、15、30或50yg蛋白質(zhì)/ kg /天。
[0134]使用編碼本文所述抗原性gpl20多肽的核酸構(gòu)建體(例如組合使用)作為用于治療性例如預防性方案(例如疫苗)的藥物組合物(藥物)，并施用于對象(例如，靈長類對象，例如人對象)以引發(fā)針對一種或更多種HIV分支或毒株的免疫應答。例如，本文所述組合物可施用于感染HIV之前的人(或非人)對象以抑制病毒感染或病毒復制。因此，上述藥物組合物可施用于對象以引發(fā)針對HIV的保護性免疫應答。為了引發(fā)免疫應答，將治療有效(例如，免疫有效)量的核酸構(gòu)建體施用于對象，例如人(非人)對象。
[0135]通過核酸構(gòu)建體進行免疫在本領(lǐng)域是公知的并且例如以下進行教導。參見Robinson H等，US5，643，578 (其描述了通過引入編碼期望抗原的DNA以引發(fā)細胞介導應答或體液應答來使脊椎動物免疫的方法)；Weiner D等，US5，593，972和Weiner D等，US5, 817，637(其描述了使編碼抗原的核酸分子與使得能夠表達的調(diào)節(jié)序列有效連接)；以及Urban R等，US5，880, 103 (其描述了將編碼免疫原性肽或其他抗原的核酸遞送至生物體的幾種方法)。所述方法包括核酸(或其自身的合成肽)的脂質(zhì)體遞送、和免疫刺激構(gòu)建體、或在混合膽固醇與(JUIL.A? (皂素)時自發(fā)形成的大小為30至40nm的丨SCOMSk1帶負電荷的籠狀結(jié)構(gòu)。
[0136]為了施用gpl20核酸分子，可例如通過由施用使得其變?yōu)榧毎麅?nèi)的適當核酸表達載體表達，例如通過使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，通過直接注射，通過使用微粒轟擊(例如，基因槍；Biolistic, Dupont Corp, Delware, DE, US),用脂質(zhì)、細胞表面受體或轉(zhuǎn)染劑包被,或通過與已知進入細胞核的同源樣肽(homeobox-like peptide)結(jié)合施用，將核酸遞送到細胞內(nèi)。參見 Morgan J 等.，US4, 980，286 和 Joliot A 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA1991 ；88:1864-1868。本發(fā)明包括所有形式的核酸遞送,包括合成的寡聚物(oligo)、裸(naked)DNA、整合或不整合到基因組中的質(zhì)粒和病毒。
[0137]在使用核酸來免疫的另一種途徑中，也可由減毒病毒宿主或載體或細菌載體表達免疫原性gpl20多肽。重組疫苗病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)、皰疹病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他病毒載體可用于表達肽或蛋白質(zhì)，從而引發(fā)CTL應答。例如，可用于TB免疫方案的疫苗載體和方法為本發(fā)明的肽提供了另一些可能的載劑。參見Paoletti E等，US4，722，848和StoverC 等，Naturel991 ；351 =456-460?
[0138]在一個實例中，使用病毒載體。這些載體包括但不限于，腺病毒、皰疫病毒、牛痘或RNA病毒(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒)。在一個實例中，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是鼠或禽逆轉(zhuǎn)錄病毒的衍生物。其中可插入單個外源基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的實例包括但不限于，莫羅尼鼠白血病病毒(MoMuLV)、哈維鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺腫瘤病毒(MuMTV)和勞斯氏肉瘤病毒(RSV)。當對象是人時，可利用例如長臂猿白血病病毒(GaLV)的載體。多種另外的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可整合多個基因。所有的這些載體可轉(zhuǎn)移或整合可選擇標志物的基因，使得可識別并產(chǎn)生轉(zhuǎn)導細胞。通過將編碼gpl20多肽的核酸序列與例如編碼用于特定靶細胞上之受體的配體的另一種基因一起插入到病毒載體中，載體就成為靶特異性的。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可通過連接例如糖、糖脂或蛋白質(zhì)而制成靶特異性的。優(yōu)選的靶向通過使用抗體靶向逆轉(zhuǎn)錄病毒載體來完成。本領(lǐng)域 技術(shù)人員知曉或在沒有過度實驗的情況下可容易地確定可插入到逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中或與病毒包膜連接以允許靶特異性遞送包含編碼gpl20多肽之多核苷酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的特異性多核苷酸序列。
[0139]對于核酸構(gòu)建體合適的制劑包括可包含抗氧化劑、緩沖劑和抑菌劑的水性和非水性溶液、等滲無菌溶液；以及可包含懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩(wěn)定劑和防腐劑的水性和非水性無菌懸液。制劑可存在于單位劑量或多劑量密封容器(例如，安瓿和小瓶)中，并且可在冷凍干燥(凍干)條件下儲存，其在使用之前僅需要即時添加無菌液體載體(例如水)?？捎蔁o菌粉末、顆粒劑和片劑制備即時溶液和懸液。優(yōu)選地，載體是緩沖鹽水溶液。更優(yōu)選地，在施用前配制用于本發(fā)明方法的組合物以保護核酸構(gòu)建體免受損害。例如，可配制組合物以減少用于制備、儲存或施用表達載體的裝置(玻璃器皿、注射器或針)上腺病毒載體的損失?？膳渲平M合物以降低組分的光敏感性和/或溫度敏感性。為了這個目的，組合物優(yōu)選包含可藥用液態(tài)載體(例如上述的那些)和穩(wěn)定劑，所述穩(wěn)定劑選自聚山梨酯80、L-精氨酸、聚乙烯吡咯烷酮、海藻糖及其組合。[0140]在治療應用中，在暴露于HIV之前或之后或者HIV感染之前或之后向?qū)ο笫┯弥委熡行Я康慕M合物。當在暴露之前施用時，治療應用可稱為預防性施用(例如，以疫苗的形式)。組合物的單次或多次施用根據(jù)對象所需和耐受的劑量和頻率來施用。在一個實施方案中，劑量為以團注施用一次，但是在另一個實施方案中可周期性施用直至實現(xiàn)治療結(jié)果(例如，保護性免疫應答)。一般來說，劑量足以治療或改善疾病的癥狀或體征，并且不產(chǎn)生對象不可接受的毒性?？墒褂萌砘蚓植渴┯?。
[0141]在核酸疫苗的環(huán)境下，可與編碼gpl20多肽之核酸構(gòu)建體一起施用與參與先天免疫的受體結(jié)合并對其進行刺激的天然或合成免疫刺激性組合物。例如，刺激某些Toll樣受體(例如，TLR7、TLR8和TLR9)的藥劑可與編碼gpl20多肽之核酸構(gòu)建體組合施用。在一些實施方案中，核酸構(gòu)建體與免疫刺激性CpG寡核苷酸組合施用。
[0142]編碼gpl20多肽的核酸構(gòu)建體可作為裸DNA質(zhì)粒引入體內(nèi)。DNA載體可通過本領(lǐng)域已知方法引入到期望宿主細胞中，所述方法包括但不限于轉(zhuǎn)染、電穿孔(例如，經(jīng)皮電穿孔)、微注射、轉(zhuǎn)導、細胞融合、DEAE右旋糖酐、磷酸鈣沉淀、使用基因槍或使用DNA載體轉(zhuǎn)運體。參見 Wu C 等，J.Biol.Chem.1992 ；267:963-967, Wu C 和 Wu G, Biol.Chem.1988 ；263:14621-14624 和 Williams R 等，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA1991；88:2726_2730。用于配制裸DNA并將其施用于 哺乳動物肌肉組織的方法也是已知的。參見Feigner P等，US5, 580，859和US5，589，466。另一些分子也可用于幫助在體內(nèi)轉(zhuǎn)染核酸，例如陽離子寡肽、來源于DNA結(jié)合蛋白的肽或陽離子聚合物。參見Bazile D等，W01995021931和Byk G等，TO1996025508。
[0143]可用于將編碼gpl20免疫原的核酸構(gòu)建體引入宿主細胞中的另一種公知方法是粒子轟擊(即基因槍轉(zhuǎn)化(biolistic transformation))?；驑屴D(zhuǎn)化通常以幾種方式之一來完成。一種常見方法包括向細胞推動惰性或生物活性顆粒。參見Sanford等，US4, 945，050，US5, 036，006 和 US5, 100，792。
[0144]或者，載體可通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(Iipofection)引入體內(nèi)。使用陽離子脂質(zhì)可促進帶負電核酸的包封，并且也可可促進與帶負電細胞膜的融合。參見Feigner P, Ringold G,Sciencel989 ；337:387_388。已描述了對于轉(zhuǎn)移核酸特別有用的脂質(zhì)化合物和組合物。參見 Feigner P 等，US5, 459，127，Behr J 等，W01995018863 和 Byk G, TO1996017823。
[0145]如免疫原性多肽一樣，核酸組合物可以以單劑量施用，或者可以以時間間隔開的多次劑量施用，以引發(fā)針對HIV的免疫應答。例如，可在幾周、幾個月或甚至幾年的時間中向?qū)ο笫┯脙蓜┝?、三劑量、或四劑量、或五劑量、或六劑量或更多劑量，以?yōu)化免疫應答。
[0146]將本文所公開的免疫原性組合物與其他藥劑(例如，蛋白質(zhì)、抗體和其他抗HIV劑) —起施用可以是有利的。這種抗Hiv治療劑的實例包括核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，例如阿巴卡韋、AZT、地達諾新、恩曲他濱、拉米夫定、司他夫定、替諾福韋、扎西他濱、齊多夫定等；非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑，例如地拉韋啶、依法韋侖、奈韋拉平；蛋白酶抑制劑，例如安普那韋、阿扎那韋、茚地那韋、洛匹那韋、奈非那韋、osamprenavir、利托那韋、沙奎那韋、替拉那韋等；以及融合蛋白抑制劑，例如恩夫韋地等。在某些實施方案中，免疫原性組合物與其他抗HIV治療劑同時施用。在某些實施方案中，免疫原性組合物與其他抗HIV治療劑順序施用，例如在施用另一藥劑之前或之后。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，順序施用可意指之后立即施用或在適當時間段(例如晚數(shù)小時、天、周、月或甚至年)后施用。[0147]E.用于檢測生物樣品中抗HIV抗體的方法和用于檢測中和抗體應答的方法
[0148]本發(fā)明所述的免疫原適合于在來自患者的樣品中鑒定對所述免疫原特異的抗體。因為根據(jù)本發(fā)明的免疫原特異性結(jié)合中和抗體，所以免疫原可用于檢測已形成中和抗體的那些患者。因此，抗體可基于患者是否表現(xiàn)出中和抗體來幫助鑒定個體化治療。因此，在另一方面中，本發(fā)明涉及一種用于檢測樣品中對病毒特異的中和抗體的方法，其包括:
[0149](i)使所述樣品與根據(jù)本發(fā)明的多肽相接觸，以及
[0150](ii)檢測所述多肽之間免疫復合物的形成。
[0151]術(shù)語和表達“中和抗體”、“病毒”、“多肽”在以上已進行了詳細描述。
[0152]在一個優(yōu)選實施方案中，病毒是HIV并且多肽是如以上定義的gpl20變體多肽或其免疫原性片段。在一個更優(yōu)選的實施方案中，樣品來自HIV-1感染患者或來自AIDS疫苗受體。
[0153]根據(jù)本發(fā)明的方法可使用任意多種的測定形式。這些形式可以是多相或均相的，順序的或同時的，競爭性的或非競爭性的。參見Peterson M等，US5, 563, 036 ；ChengA 等，US5, 627, 080 ；Lee J 等，US5, 633, 141 ；Peterson M 等，US5, 679, 525 ；Draetta G等，US5, 691，147 ;Lucas F 等，US5, 698，411 ;Yan C 等，US5, 747，352 ;Davidson R,US5, 811, 526 ；0h C 等，US5, 851，778 和 Landrum E 等，US5, 976，822。這樣的測定可設(shè)計成定量的，以測量抗HIV抗體的濃度或量；或者它們可設(shè)計成定性的，以測量抗HIV抗體是否存在。科學文獻中可得到根據(jù)本發(fā)明原則可適于使用的免疫測定的另外描述。參見 Gnann J 等，Methods Enzymol.1989 ； 178:693-714 ；Dopel S 等，Eur.J.Clin.Chem.Clin.Biochem.1991 ；29:331-337 ；Manocha M 等，Tmmunol.Lett.2003 ；85 (3):275-278)；Brattegaard K 等，AIDS1995 ；9 (6):656-657 ；Beristain C 等，J.Clin.Lab.Anal.1995 ；9:347-350 ； Mo dr ow S 等 ，J.Acquir.1mmune Defic.Syndr.1989 ；2: 141-148 ；Gueye-NdiayeA 等，AIDS1993 ；7:475-481 ；Sabatier J 等，AIDS1989 ；3:215-220 ;Sommerfelt M 等，Expert Opin.Biol.Ther.2004 ；4:349-361 ；Alcaro M 等，Curr.Protein Pept.Sc1.2003 ；4:285-290 ；Smith R 等，Arch.Pathol.Lab.Med.1990 ；114:254-258 ；Petrov R 等，Biomed.Sc1.1990 ；1:239-244 ;Zolla_Pazner S, Nat.Rev.1mmunol.2004 ；4: 199-210 ；Baillou A等，J.Clin.Microbiol.1991 ；29:1387-1391 和 McGaughey G 等，Curr.HIV Res.2004 ；2:193-204。
[0154]多相(Heterogeneous)免疫測定技術(shù)通常包括使用反應產(chǎn)物與之結(jié)合的固相材料，但是也可調(diào)整成包括非固定抗原與抗體的結(jié)合(即，溶液相免疫測定)。通過將固相從反應混合物中移除(例如，通過洗滌)使反應產(chǎn)物與過量的樣品、測定試劑和其他物質(zhì)分離。可根據(jù)本發(fā)明使用的固相免疫測定的一種類型是夾心免疫測定(sandwichimmunoassay)。在夾心測定中,樣品中存在的分析物越多，固相上存在的標記量就越多。一般優(yōu)選該類型的測定形式，尤其是對于低分析物濃度的觀察，原因是固相上標記的出現(xiàn)更容易被檢測到。
[0155]根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，與抗HIV抗體特異性反應的本發(fā)明之肽結(jié)合(即固定)至固相支持物，并且在與被測試抗HIV抗體是否存在的生物樣品的接觸下進行孵育?？商砑臃忾]劑以減少非特異性結(jié)合。
[0156]如所理解的，肽可與生物樣品以未結(jié)合狀態(tài)孵育，然后結(jié)合(即固定)至固體支持物。然后，優(yōu)選對支持物進行徹底處理(例如，通過洗滌)以基本上移除可存在但未與結(jié)合肽結(jié)合的非HIV抗體。這種處理的結(jié)果是，在肽與抗HIV抗體之間形成免疫復合物。
[0157]然后，優(yōu)選地添加可檢測標記的第二抗體(能夠與初始抗體(例如，抗人IgG抗體)結(jié)合)，并且在足以允許第二抗體與可存在的任何抗HIV抗體結(jié)合的條件下孵育支持物。然后優(yōu)選對支持物進行徹底處理(例如，通過洗滌)以基本上移除任何未結(jié)合的第二抗體。如果測試樣品中存在抗HIV抗體，則兩種抗體與固定化肽會形成免疫復合物(即，第二抗體/抗HIV抗體/固定化肽三明治夾心)。在這樣的測定中，檢測與支持物結(jié)合的第二抗體是被測試樣品中抗HIV抗體的指示。參見Schuurs A等，US3, 791，932和US4, 016，043 ；以及Pankratz T等,US5, 876，935。第二抗體可以是分離自非人物種的天然免疫球蛋白(例如，抗人IgG鼠抗體、抗人IgG山羊抗體、抗人IgM山羊抗體)，或者其可通過重組或合成產(chǎn)生。第二抗體可以是完整的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段(例如，F(xiàn)Ab、F[Ab]2)。如期望，可采用其他結(jié)合分子(能夠與抗HIV抗體結(jié)合)與這種第二抗體配合或代替這種第二抗體。例如，抗HIV抗體可被生物素化并且第二抗體可被替代為標記的親和素或鏈霉親和素。
[0158]為了省略未結(jié)合分離步驟并減少化學結(jié)合測定所需的時間和設(shè)備，可替代性地采用均相測定形式。在這樣的測定中，結(jié)合對中的一種組分仍可被固定；但是，在不進行未結(jié)合分離的情況下檢測結(jié)合對中第二組分的存在。均相光學方法的實例包括EMIT方法(Syva, Sunnyvale, CA, US),其通過檢測突光淬滅來運行；Behringwerke的激光池度測定乳膠顆粒凝集法(laser nephelometry latex particle agglutination method, Marburg,DE)，其通過檢測光散射的改變來運行；LPIA乳膠顆粒凝集法(Mitsubishi ChemicalIndustries, Tokyo, JP) ;TDX 突光去極化法(Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, US)以及突光能量轉(zhuǎn)移法(Cis Bio International, Paris, FR)。任意這樣的測定可適用于根據(jù)本發(fā)明的目的。
[0159]本發(fā)明的結(jié)合測定可配置成競爭性測定。在競爭性測定中，測試樣品中存在的抗HIV抗體越多，固相上存在的標記的量就越低。
`[0160]通過與夾心測定類似的方式，競爭性測定可通過以下方法進行:提供限定量的經(jīng)標記抗HIV抗體，并確定被測試流體中是否包含與經(jīng)標記抗體競爭與支持物結(jié)合的抗HIV抗體。在這樣的競爭性測定中，捕獲的經(jīng)標記抗體的量與測試樣品中存在的分析物的量成反比。本領(lǐng)域中已描述了這種類型的幾種測定。參見Smith D等，US4, 401，764 ;ClagettJ 等，US4, 746，631 ；Li C 等，US4, 661，444 ；Chieregatt E 等，GB2084317 ；Mochida E 等，US4, 185，084 ；Sadeh D 等，US4, 243，749 ；Lucas F 等，US5, 698，411 ；Landrum(見上文)，Leuvering J，US4, 313，734 ；Gribnau T 等，US4, 373，932 和 Baugher B 等，US5, 501，985。優(yōu)選使用酶(例如，堿性磷酸酶、半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶或脲酶)作為可檢測標記(即，酶免疫測定或EIA)。
[0161]可通過使用響應于酶標記催化的顯色底物(包括放出或吸收熒光、UV、可見光的那些底物)來檢測酶標記的存在。更優(yōu)選地，可采用化學標記(例如，膠體金、乳膠珠標記)。
[0162]可使用多重檢測器、多通道濾波器、光柵或光譜特性不同的螢石來完成標記的檢測。參見Ward D等，US5，759，781。特別優(yōu)選的是采用過氧化物酶作為酶標記，特別是與顯色底物3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)、(PD或ABTS配合使用。在用過氧化物酶作為酶標記抗體的情況下，可使用高碘酸鹽法或報道的其中伴侶與異雙功能試劑連接的方法。參見 Nakane P 等,J.Histochem.Cytochem.1974 ;22:1084_1090。在本發(fā)明的免疫測定中可采用多種的任意固相支持物。對于固相支持物合適的材料是合成物，例如聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚酰胺或其他合成聚合物；天然聚合物，例如纖維素；以及衍生化天然聚合物，例如醋酸纖維素或消極纖維素；以及玻璃，尤其是玻璃纖維。支持物可采用球、棒、管和微測定或微滴定板的形式。片狀結(jié)構(gòu)例如紙條、小板和膜同樣是合適的。載體的表面對于水性溶液是可滲透的和不可滲透的。
[0163]雖然上述描述涉及測定是作為流體的生物樣品(例如，血清、血液、尿、唾液、胰液、腦脊液、精液)中抗HIV抗體的存在，但是應理解，任何流體生物樣品(例如，組織或活檢提取物、排泄物提取物、痰)可同樣地用于本發(fā)明的測定。更優(yōu)選地，被測定的生物樣品是血清或血楽.。
[0164]因為根據(jù)本發(fā)明的免疫原能夠引起廣泛中和抗體的產(chǎn)生，所以這些免疫原也可用于檢測響應于患者中病原體的中和抗體。因此，在另一方面中，本發(fā)明涉及一種用于檢測針對對象中病毒感染的中和抗體應答的方法，其包括使用根據(jù)本發(fā)明的用于檢測中和抗體的方法在所述對象中檢測中和抗體的存在，其中相對于對照對象，所述對象中中和抗體的存在指示所述對象中響應于所述病毒感染的中和抗體。
[0165]在一個優(yōu)選實施方案中，病毒是HIV并且其中所述多肽是根據(jù)本發(fā)明的gpl20變體多肽或其片段。在一個更優(yōu)選的實施方案中，樣品來自HIV-1感染患者或者來自AIDS疫苗受體。
[0166]一般方法
[0167]1.試劑
[0168]使用以下試劑:
[0169](a)質(zhì)粒。pNL4.3 質(zhì)粒得自于 National Institutes of Health AIDS Researchand Reference Reagent Program(NIH ARRRP,NIH,Bethesda,MD,US)。pcDNA3.1 質(zhì)粒得自于 Invitrogen(Carslbad, CA, US)。
[0170](b)HIV-l 分離株。使用 B 分支 HIV-1 原代分離株 AC-10 (NeutNet consortium,Milan,IT)。
[0171](c)細胞系。TZM-bl 細胞(CD4+CXCR4+CCR5+)得自于 NIH 庫(NIH, Bethesda,Mary I and, US) ο在包含10%胎牛血清、20mM L-谷氨酰胺、IOOU盤尼西林/ ml和IOOyg鏈霉素/ ml的杜氏改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中維持293T和TZM_bl細胞。
[0172](d)抗體。使用具有廣泛中和活性的抗EnV-HIV-1單克隆抗體(MAb)(括號中給出表位特異性)(NIH ARRRP, NIH, Bethesda, MD, US ；PoIymun AG, Vienna, AT)。這些包括:4E10 (近膜端外部區(qū)；MPER)、2F5 (MPER)、bl2 (CD4結(jié)合位點)、2G12 (gpl20高甘露糖糖原)和PG16(gpl20病毒刺突)。
[0173]2.體外隨機誘變
[0174]使用Genemorph II 隨機誘變試劑盒(Stratagene, La Jolla, CA, US)將突變引入HIV AC-1Oenv中。通過將隨機突變包膜轉(zhuǎn)移到pNL4_3和pcDNA3.1質(zhì)粒中來產(chǎn)生嵌合HIV病毒體的文庫。轉(zhuǎn)移通過引入保留病毒序列的限制性位點并用酶XbaI和NotI (New EnglandBiolabs, Ipswich, MA, US)消化來介導。
[0175]3.克隆和文庫產(chǎn)生[0176]使用快速DNA 連接試劑盒(Roche Applied Science, Indianapolis, IN)根據(jù)制造商說明書將PCR產(chǎn)物克隆到載體pNL4.3和pcDNA3.1中。將pNL4.3和pcDNA3.1的
重組載體分別引入到MAX Efficiency" stbi2?感受態(tài)細胞和MAX EfficiencyH
DH5 α ?感受態(tài)細胞((Invitrogen，Carslbad, CA，US)中，并在30°C下攪拌擴增過夜(ON)，體積為3mL。同時進行幾個轉(zhuǎn)化以避免丟失可變性，并在擴大規(guī)模的擴增中將其混合在一起(250mL，30°C，攪拌過夜)。孵育后，鋪板 20 μ L 并使用 PureYield? Plasmid MaxiprepSystem(Promega, Madison, WI, US)純化質(zhì)粒DNA。兩種產(chǎn)物均用XbaI和NotI進一步消化以證明env基因的存在。如果是陽性的，則對克隆進行測序和/或用于轉(zhuǎn)染。通過使用PNL4.3構(gòu)建體瞬時共轉(zhuǎn)染293T細胞產(chǎn)生病毒。在轉(zhuǎn)染后兩天收集包含病毒體的細胞培養(yǎng)
物上清液并使用Amicon? ultra離心過濾器單元濃縮病毒體。將病毒體重懸于磷酸鹽
緩沖鹽水(PBS)中。
[0177]4.病毒捕獲測定
[0178]在4°C下用多克隆抗Fc(100y IPBS中5μ g / mL)包被微滴定孔過夜。在37°C用PBS中的3%牛血清白蛋白(BSA)將孔封閉I小時。向微滴定孔中添加100μ I來源于文庫的病毒(IOOOng / mL)。向?qū)字刑砑? μ I捕獲的MAb (100ng / mL)并將板在37 °C攪拌(450rpm)孵育。孵育2小時后，用PBS將孔洗滌六次，并且通過p24酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)定量病毒等同物，或者用 High Pure Viral RNA Kit (Roche Applied Science,Indianapolis, IN, US)根據(jù)制造商說明書提取RNA。
[0179]5.巢式 PCR HIV-1env RNA 擴增
[0180]使用RT-PCR 試劑盒(The GeneAmp⑩ Gold RNA PCR Reagent Kit !AppliedBiosystems, Carlsbad, CA, US)和 Expand High Fidelity PCR System(Roche AppliedScience, Indianapolis, IN)通過逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)擴增分離的HIV-1envRNA。對于RT-PCR反應使用8 μ L的RNA模板體積，并且在50°C下用引物102 (反向)使RNA逆轉(zhuǎn)錄20分鐘。用引物101(正向)和104(反向)由5 μ L體積的cDNA擴增env區(qū)域，然后使用2μ L體積的模板用引物179 (正向)和180 (反向)進行巢式PCR。參見表I。兩種env PCR擴增的條件是:i)94°C下2分鐘，I個循環(huán)；ii)94°C下2分鐘，55°C下I分鐘和75°C下3分鐘，35個循環(huán)；iii)72°C下7分鐘，I個循環(huán)以及iv)4°C下終止。所得擴增子
(2583bp)與IKb分子量標志物一起在用SYIiRK Safe DNA凝膠染色劑進行染色的1.0%
瓊脂糖凝膠中進行電泳。
[0181 ] 6.env基因的克隆和測序
[0182]如上所述將先前步驟的PCR產(chǎn)物克隆到pNL4.3和pcDNA3.1載體中。如先前所述用這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)化Stbl2和DH5 α感受態(tài)細胞。質(zhì)粒DNA使用QIAprep Spin MiniprepKit (Qiagen, Valencia, CA,US)進行純化并用XbaI and NotI進一步消化以證明env基因的
存在。使用Big丨),ye? Terminator v3.1以及引物183 (正向)、185 (正向)、186 (正向)、
190 (反向)、192 (反向)和193 (反向)對env陽性克隆進行測序。參見表I。
[0183]7.序列分析
[0184]通過使用CLUSTAL W 程序(EMBL-EBI, http: / / www.eb1.ac.uk / FTP / , 2011年2月)和合并到BioEdit7.0.9.0版本中的Contig Assembly Program(CAP)應用程序進行核苷酸序列的比對，然后進行手動編輯。參見Thompson J等，Nucl.Acids Res.1994 ；22(22):673-4680 和 Huang X，Genomicsl992 ;14(1):18_25。
【權(quán)利要求】
1.能夠引發(fā)抗病毒的中和抗體的多肽，其包含Hiv-lgpl20的變體或其免疫原性片段，其中相對于SEQ ID NO:2的編號，所述多肽包含C131Y、T132N、D138G和N160Y突變或者所述多肽包含N203S和G604E突變。
2.能夠引發(fā)抗病毒的中和抗體的多肽，其中所述多肽包含變體HIV-lgpl20或其免疫原性片段，其中所述變體gpl20或其免疫原性片段選自這樣的多肽，其相對于SEQ ID NO:2的編號至少包含選自第88、131、132、138、160、191、203、226、479、507、604和647位的位置上的突變。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽，其中所述突變選自N88D、C131Y、T132N、D138G、N160Y、N191D、N203S、A226V、M4791、R507W、G604E 和 Y647N。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的多肽或免疫原性片段，其中所述多肽或其免疫原性片段包含選自以下的序列:SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29 和 SEQ ID NO:310
5.抗體，其特異性結(jié)合根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的多肽。
6.多核苷酸 ，其編碼根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的多肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多核苷酸，其具有SEQID NO:3的序列。
8.表達載體,其包含根據(jù)權(quán)利要求7所述的多核苷酸。
9.宿主細胞,其包含根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的多肽、根據(jù)權(quán)利要求5所述的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達載體。
10.免疫原性組合物或疫苗，其包含根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的多肽、根據(jù)權(quán)利要求5所述的多核苷酸或根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達載體。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的多肽、根據(jù)權(quán)利要求6所述的多核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求7所述的表達載體或者根據(jù)權(quán)利要求10所述的免疫原性組合物或疫苗，其用于醫(yī)學。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的多肽、根據(jù)權(quán)利要求6所述的多核苷酸、根據(jù)權(quán)利要求7所述的表達載體或者根據(jù)權(quán)利要求10所述的免疫原性組合物或疫苗，其用于治療或預防由HIV感染引起的疾病。
13.用于檢測樣品中對給定病原體特異的中和抗體的方法，其包括: (i)使所述樣品與根據(jù)權(quán)利要求1至4所述的多肽相接觸，以及 (?)檢測所述多肽與所述中和抗體之間免疫復合物的形成。
14.用于檢測對象中抗病毒感染的中和抗體應答的方法，其包括使用根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法檢測所述對象中中和抗體的存在，其中相對于對照對象，所述對象中中和抗體的存在指示所述對象中對病毒感染的中和抗體應答。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法，其中所述病毒是HIV，并且其中所述多肽是根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的gpl20變體多肽或其片段。
16.權(quán)利要求15所限定的方法，其中所述樣品來自HIV-1感染患者，或者其中所述樣品來自AIDS疫苗接受者。
17.用于鑒定能夠引發(fā)針對多肽之中和抗體的免疫原的方法，其包括: (i)使對所述多肽特異的中和抗體與重組病毒的文庫相接觸，每一種所述重組病毒包含編碼所述多肽之變體的隨機化基因并表達所述多肽； (?)基于它們與所述中和抗體結(jié)合的能力，將所述重組病毒的文庫中結(jié)合所述中和抗體的那些成員與不發(fā)生此結(jié)合的成員相分離；以及 (iii)確定在步驟(ii)中選定的所述重組病毒文庫的成員中發(fā)現(xiàn)的所述變體多肽的序列。
18.權(quán)利要求17所限定的方法，其中所述中和抗體是固定化的。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的方法，其中步驟(ii)中選定的那些文庫成員中病毒表面上展示的所述變體多肽的序列測定如下所述進行:通過對來自所述文庫中與所述中和抗體結(jié)合的成員的遺傳物質(zhì)進行測序。
20.權(quán)利要求17至19中任一項所限定的方法，其中那些文庫成員的分離如下所述來確定:通過對來自結(jié)合成員之群體的病毒的至少一種多肽進行定量。
21.權(quán)利要求20所限定的方法，其中所述病毒多肽是所述病毒衣殼的多肽。
22.權(quán)利要求17至21中任一項所限定的方法，其中步驟(ii)中選定的那些文庫成員中病毒表面上展示的所述變體多肽的序列測定如下所述進行:通過對來自所述文庫中與所述中和抗體結(jié)合的成員的遺傳物質(zhì)進行測序。
23.根據(jù)權(quán)利要求17至22中任一項所述的方法，其中所述病毒是逆轉(zhuǎn)錄病毒。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述隨機化基因是env基因。
25.根據(jù)權(quán)利要求23或24所述的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒是HIV。
26.權(quán)利要求25所限 定的方法，其中在步驟(ii)中確定的所述病毒衣殼的多肽是p240
27.根據(jù)權(quán)利要求25或26中任一項所述的方法，其中所述中和抗體選自4E10mAb、2F5mAb、bl2mAb、2G12mAb 和 PG16mAb。
【文檔編號】G01N33/569GK103459410SQ201280016904
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月25日
【發(fā)明者】瑪麗亞·埃洛伊薩·尤斯特埃蘭斯, 維克托·桑切斯梅里諾, 卡羅琳娜·費雷拉 申請人:埃斯特韋實驗室有限公司, 私人艾滋病研究基金會-銀行