專利名稱：檢測萊克多巴胺殘留量的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型涉及檢測萊克多巴胺殘留量的化學(xué)發(fā)光試劑盒，特別是檢測動物組織、飼料和尿液中萊克多巴胺殘留量的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫(CLEIA)檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
萊克多巴胺(Ractopamin, RAC)名雷托帕明、舒喘靈、權(quán)萊克、金萊多巴、Paylean,化學(xué)成分為1- (4-羥基苯基)-2 [1-甲基-3- (4-羥基苯基)-丙氨基]-乙醇鹽酸鹽，分子式為C18H23N03C1，屬于β-興奮劑。β _興奮劑是營養(yǎng)重分配劑的一種，是一類結(jié)構(gòu)和功能類似腎上腺素和去甲腎上腺素的苯乙醇胺類衍生物，它能改善脂肪型動物的肉與脂肪的比例，降低酮體脂肪含量，提高瘦肉率，并能加速動物生長，而被添加于動物飼料中。常見的β 2-興奮劑有克倫特羅、萊克多巴胺及沙丁胺醇等。隨著我國對克倫特羅(俗稱“瘦肉精”)監(jiān)管力度的加大，克倫特羅的使用逐漸減少，其他β 2-興奮劑的使用逐漸增加。由于萊克多巴胺有類似于克倫特羅的作用，在動物組織中殘留，從而對人體產(chǎn)生不利影響。我國農(nóng)業(yè)部、衛(wèi)生部和國家藥品監(jiān)督管理局共同發(fā)布的176公告中明確規(guī)定，禁止在飼料中使用β 2-興奮劑藥物。176公告中明確規(guī)定的此類藥物除萊克多巴胺、鹽酸克侖特羅外，還有沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇、鹽酸多巴胺、西嗎特羅、硫酸特布他林等。商務(wù)部、海關(guān)總署公告2009年第110號，公布自2009年12月9日起，禁止進出口萊克多巴胺和鹽酸萊克多巴胺。因此，做好萊克多巴胺殘留檢測，對于保障食品安全至關(guān)重要。目前，檢測萊克多巴胺的方法主要有微生物法、薄層色譜法(TLC)、放射免疫法，高效液相色譜法(HPLC )、色/質(zhì)聯(lián)用分析法(LC-MS)、液/質(zhì)聯(lián)用分析法(LC-MS/MS)。微生物法的缺陷是費時而且缺乏特異性。薄層色譜法的缺陷是操作過程復(fù)雜，時間長；操作人員需要經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)； 影響分析的干擾因素較多，結(jié)果重復(fù)性差。薄層色譜法、放射免疫法，高效液相色譜法、色/質(zhì) 連用分析法、液/質(zhì)聯(lián)用分析法這些理化方法的缺陷是儀器設(shè)備昂貴，樣品前處理復(fù)雜，費時，費力，不易普及，檢測費用高，特別是放射免疫法還需要配備放射源，有一定危險性。鑒于此，建立一種有效、快速、簡單、靈敏的檢測萊克多巴胺的方法具有重要意義。

實用新型內(nèi)容本實用新型所要解決的問題是提供一種小巧輕便的萊克多巴胺殘留量檢測試劑盒，其操作簡便，檢測快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，成本低，穩(wěn)定性好，需要的技術(shù)含量不高，可進行一次連續(xù)多個樣品中萊克多巴胺殘留量的測定，減少了檢測樣本所需要的時間。本實用新型的技術(shù)方案是一種檢測萊克多巴胺殘留量的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫試劑盒，試劑盒采用直接競爭CLEIA方法，在化學(xué)發(fā)光板微孔中預(yù)包被抗萊克多巴胺抗體，樣本中殘留的萊克多巴胺和酶標(biāo)萊克多巴胺偶聯(lián)抗原競爭包被在化學(xué)發(fā)光板微孔中的抗萊克多巴胺抗體，加入化學(xué)發(fā)光液，測量各孔發(fā)光強度值，樣本發(fā)光強度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較計算出相應(yīng)濃度值再乘以其樣品前處理的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中萊克多巴胺的殘留量。[0007]本實用新型涉及的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒包括盒體和盒內(nèi)的一塊96孔的化學(xué)發(fā)光板、12瓶試劑、一個自封袋、一張蓋板膜、放置試劑的下凹瓶位、一份說明書和一份質(zhì)檢報告，其中化學(xué)發(fā)光板是采用96孔不透明的可拆卸化學(xué)發(fā)光板作為固相載體，在發(fā)光板微孔中預(yù)包被抗萊克多巴胺抗體制成的化學(xué)發(fā)光檢測板，12瓶試劑分別為6瓶萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液，酶標(biāo)萊克多巴胺抗原濃縮液，酶標(biāo)萊克多巴胺抗原稀釋液，化學(xué)發(fā)光液A、B液，濃縮洗滌液，濃縮復(fù)溶液。盒體是硬紙盒，96孔化學(xué)發(fā)光板為不透明可拆卸聚苯乙烯化學(xué)發(fā)光板，放于真空鋁鉬袋內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)萊克多巴胺抗原濃縮液、酶標(biāo)萊克多巴胺抗原稀釋液、化學(xué)發(fā)光液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液用塑料瓶盛放，下凹瓶位共12個，由塑料泡沫制成?；瘜W(xué)發(fā)光板是由外框支撐架及放置其上的可拆的12條化學(xué)發(fā)光反應(yīng)微孔條組成，每個可拆裝化學(xué)發(fā)光反應(yīng)微孔條有8個反應(yīng)孔，每個反應(yīng)孔預(yù)包被抗萊克多巴胺抗體；標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，ImL/瓶；酶標(biāo)萊克多巴胺抗原濃縮液I瓶，ImL ;酶標(biāo)萊克多巴胺抗原稀釋液I瓶，7mL ;化學(xué)發(fā)光液A液I瓶，7mL ;化學(xué)發(fā)光液B液I瓶，7mL ;濃縮洗滌液I瓶，40mL ；濃縮復(fù)溶液I瓶，50mL。經(jīng)實驗表明本試劑盒具有很高的靈敏度動物組織樣本的最低檢測限為O. 5ng/g，回收率為80 ±15% ;飼料樣本的最低檢測限為2. Ong/g,回收率為80 ±15% ;尿液樣本的最低檢測限為O.1ng/mL，回收率為90± 15%，相對于其他萊克多巴胺檢測方法，本試劑盒所需儀器較少，所需成本較低。本實用新型的有益效果是能快速、簡便、靈敏、準(zhǔn)確地用于動物組織、飼料和尿液中萊克多巴胺殘留量的檢測。

圖1為本實用新型化學(xué)發(fā)光板的側(cè)面縱剖面圖(長為8. 55cm)；圖2為本實用新型化學(xué)發(fā)光板的側(cè)面橫剖面圖(長為12. 8cm)；圖3為本實用新型化學(xué)發(fā)光板的俯視圖；圖4為本實用新型試劑瓶縱剖面平面圖；圖5為本實用新型固定泡沫模具的俯視圖；圖6為本實用新型盒體與固定泡沫模具的側(cè)視圖。參見附圖化學(xué)發(fā)光板反應(yīng)微孔條(2)預(yù)包被抗萊克多巴胺單克隆抗體(3)固定于化學(xué)發(fā)光板的外框支撐架(I)上，化學(xué)發(fā)光板反應(yīng)微孔條(2)可隨要求拆卸；半透明塑料試劑瓶(4)分別用于封裝40mL濃縮洗滌液和50mL濃縮復(fù)溶液；白色塑料試劑瓶(5)分別用于封裝7mL顯色液A液和7mL顯色液B液；白色塑料試劑瓶(6)分別用于封裝ImL酶標(biāo)萊克多巴胺偶聯(lián)抗原濃縮液和酶標(biāo)萊克多巴胺偶聯(lián)抗原稀釋液；白色塑料試劑瓶(7)分別用于封裝ImL/瓶的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；泡沫塑料模具(15)有12個瓶位，放置位置依次為40mL濃縮洗滌液瓶位(8)，50mL濃縮復(fù)溶液(9)，7mL化學(xué)發(fā)光液A液瓶位(10)，7mL化學(xué)發(fā)光液B液瓶位(11)，ImL酶標(biāo)萊克多巴胺偶聯(lián)抗原濃縮液瓶位(12)，7mL酶標(biāo)萊克多巴胺偶聯(lián)抗原稀釋液瓶位(13)，6瓶ImL/瓶各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液瓶位(14)，盒體為(16)是硬紙盒。
具體實施方式
[0018]具體實施例一樣本的前處理1、配液配液1:復(fù)溶工作液用去離子水將2X濃縮復(fù)溶液按1:1體積比進行稀釋(I份2X濃縮復(fù)溶液+1份去離子水)用于提取樣本的復(fù)溶，復(fù)溶工作液在4°c環(huán)境可保存一個月。配液2:洗滌工作液用去離子水將20 X濃縮洗滌液按1:19體積比進行稀釋(I份20X濃縮洗滌液+19份去離子水)用于化學(xué)發(fā)光板的洗滌，洗滌工作液在4°C環(huán)境可保存一個月。配液3:O.1M鹽酸溶液量取4. 15mL濃鹽酸加入去離子水定容至500mL。配液4 5%三氯乙酸溶液稱取5g三氯乙酸加去離子水100mL。配液5:6%三氯乙酸溶液稱取6g三氯乙酸加去離子水100mL。2、樣本處理步驟尿液取50L清亮尿樣直接測定(如尿樣渾濁必須通過過濾或3000g以上，15°C離心IOmin直至清亮)，暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存。豬肉稱取2. 0±0. 05g勻漿樣本至50mL聚苯乙烯離心管中；分別加入ImL 5%三氯乙酸，I mL O.1M HCL, ImL甲醇，振蕩5min ;稱取2g酸性氧化鋁，加入到振蕩均勻的樣品中；繼續(xù)振蕩5min ；3000g以上，室溫(20_25°C )離心5min ;取上清液O. 5mL加入O. 5mL復(fù)溶工作液混勻；取50 μ L用于分析。羊肉、牛肉、肝臟稱取2. 0±0. 05g勻漿樣本至50mL聚苯乙烯離心管中；分別加Λ ImL 6%三氯乙酸，I mL O.1M HCL, I mL甲醇，振蕩5min ;稱取2g酸性氧化鋁，加入到振蕩均勻的樣品中；繼續(xù)振蕩5min ；3000g以上，室溫(20_25°C )離心5min ;取上清液O. 5mL加入O. 5mL復(fù)溶工作液混勻；取50 μ L用于分析。飼料稱取1. 0±0. 05g樣本至50mL聚苯乙烯離心管中；稱取1. 0±0. 05g酸性氧化鋁加入到樣品中；再加入4mL丙酮，6mL甲醇，振蕩5min ；3000g以上，室溫(20_25°C )離心5min ;移取ImL上層有機相至IOmL干凈玻璃試管中，于50_60°C水浴氮氣/空氣流下吹干；加入ImL復(fù)溶工作液,潤動3min ;取50 μ L用于分析。具體實施例二 使用試劑盒的操作步驟1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫(20_25°C)平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2_8°C。3、編號將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。4、酶標(biāo)抗原工作液配制將酶標(biāo)抗原稀釋液和酶標(biāo)抗原濃縮液按10:1體積比混合并混勻。5、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本/酶標(biāo)抗原工作液加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50L到對應(yīng)的微孔中，再加入酶標(biāo)抗原工作液50L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)15min。[0041]6、洗板小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250L/孔，充分洗滌7次，每次間隔10s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)。8、底物配制根據(jù)底物的使用量，將A液和B液按1:1混合并混勻，每孔加入新配制的發(fā)光底物100L，震蕩約30秒左右，用蓋板膜蓋板后室溫放置3min。9、測定直接放入微孔板發(fā)光分析儀內(nèi)測量讀數(shù)。具體實施例三結(jié)果判定(I)發(fā)光百分比的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的發(fā)光百分比等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的發(fā)光強度值的平均值(雙孔)除以O(shè)濃度標(biāo)準(zhǔn)品的發(fā)光強度度值，再乘以100%，即RLU—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均發(fā)光強度值RLU0—0濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均發(fā)光強度值(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算以標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)光百分比為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/mL)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的發(fā)光百分比代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中萊克多巴胺實際濃度。具體實施例四注意事項1、室溫低于20°C或試劑及樣本沒有回到室溫(20_25°C)會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的光子計數(shù)值偏低。2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。3、每加一種試劑前需要將其搖勻。4、不要使用過了有效期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試齊U，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。5、儲存條件保存試劑盒于2_8°C，不要冷凍，將不用的微孔板放進自封袋重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)光劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。6、該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25°C，溫度過高或過低將導(dǎo)致光子計數(shù)值和靈敏度發(fā)生變化。
權(quán)利要求1.一種檢測萊克多巴胺殘留量的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，包括盒體和盒內(nèi)的一塊96孔的化學(xué)發(fā)光板、12瓶試劑，其特征在于化學(xué)發(fā)光板是采用96孔不透明的可拆卸化學(xué)發(fā)光板作為固相載體，在發(fā)光板微孔中預(yù)包被抗萊克多巴胺抗體制成的化學(xué)發(fā)光檢測板，12瓶試劑分別為6瓶萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液，酶標(biāo)萊克多巴胺抗原濃縮液，酶標(biāo)萊克多巴胺抗原稀釋液，化學(xué)發(fā)光液A、B液，濃縮洗滌液，濃縮復(fù)溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，其特征在于還包括一個自封袋、一張蓋板膜、放置試劑的下凹瓶位、一份說明書和一份質(zhì)檢報告，盒體是硬紙盒；96孔化學(xué)發(fā)光板為不透明可拆卸聚苯乙烯化學(xué)發(fā)光板，放于真空鋁鉬袋內(nèi)；標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)萊克多巴胺抗原濃縮液、酶標(biāo)萊克多巴胺抗原稀釋液、化學(xué)發(fā)光液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液用塑料瓶盛放，下凹瓶位共12個，由塑料泡沫制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒，其特征在于化學(xué)發(fā)光板是由外框支撐架及放置其上的可拆的12條化學(xué)發(fā)光反應(yīng)微孔條組成，每個可拆裝化學(xué)發(fā)光反應(yīng)微孔條有8個反應(yīng)孔，每個反應(yīng)孔預(yù)包被抗萊克多巴胺抗體；標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，ImL/瓶；酶標(biāo)萊克多巴胺抗原濃縮液I瓶，ImL ;酶標(biāo)萊克多巴胺抗原稀釋液I瓶，7mL ;化學(xué)發(fā)光液A液I瓶，7mL ;化學(xué)發(fā)光液B液I瓶，7mL ;濃縮洗滌液I瓶，40mL ;濃縮復(fù)溶液I瓶，50mL。
專利摘要本實用新型涉及一種檢測萊克多巴胺殘留量的化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒。該試劑盒組成包括96孔化學(xué)發(fā)光板、RAC6個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)抗原濃縮液、酶標(biāo)抗原稀釋液、化學(xué)發(fā)光液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液、自封袋、蓋板膜、說明書和質(zhì)檢報告。采用直接競爭CELIA方法，在發(fā)光板微孔中預(yù)包被抗RAC抗體，樣本中含有的RAC將和酶標(biāo)RAC偶聯(lián)抗原競爭結(jié)合抗RAC抗體，加入發(fā)光液，測量各孔發(fā)光強度值，樣本發(fā)光強度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較計算出相應(yīng)濃度值再乘以其樣品前處理的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中RAC的殘留量。與儀器分析技術(shù)相比具有使用方便、高靈敏度等特點，可在動物組織中RAC的殘留量檢測中發(fā)揮重要作用。
文檔編號G01N33/545GK202903793SQ20122038478
公開日2013年4月24日 申請日期2012年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月3日
發(fā)明者馮才偉, 陶光燦, 羅貴昆, 馮月君, 石潔, 趙赫, 田甜, 常平平 申請人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司