一種檢測(cè)熱毒寧注射液中高分子物質(zhì)的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于藥品檢測(cè)領(lǐng)域，公開了一種檢測(cè)熱毒寧注射液中高分子物質(zhì)的方法。本發(fā)明采用分子排阻色譜法，并結(jié)合熱毒寧注射液生產(chǎn)工藝的特點(diǎn)，建立了以胸腺肽α1為對(duì)照的熱毒寧注射液高分子物質(zhì)檢測(cè)方法。被測(cè)樣品中組分將按照分子量由大到小的順序被洗脫下來(lái)，將先于對(duì)照品出峰時(shí)間的峰視為高分子物質(zhì)，按面積歸一化法計(jì)算其含量。通過(guò)重復(fù)性、分離度、檢出限、精密度、分子量對(duì)數(shù)-保留時(shí)間曲線、溶液穩(wěn)定性考察，證明本發(fā)明建立的熱毒寧注射液高分子物質(zhì)檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、重復(fù)性好，可作為熱毒寧注射液質(zhì)量?jī)?nèi)控方法，對(duì)中藥注射劑質(zhì)量控制具有指導(dǎo)意義。
【專利說(shuō)明】一種檢測(cè)熱毒寧注射液中高分子物質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屈于藥品檢測(cè)領(lǐng)域，涉及一種檢測(cè)熱毒寧注射液中高分子物質(zhì)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]中藥注射劑是我國(guó)中醫(yī)藥創(chuàng)新的重要成果，其生物利用度高、作用迅速，在治療急重癥方面具有優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于臨床。隨著我國(guó)藥品不良反應(yīng)監(jiān)測(cè)工作的發(fā)展，中藥注射劑的安全性問(wèn)題也逐漸顯現(xiàn)。引起不良反應(yīng)的因素很多，有學(xué)者認(rèn)為大分子物質(zhì)的存在亦是其因素之一。熱毒寧注射液(國(guó)藥準(zhǔn)字Z20050217，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn))處方由桅子、金銀花、青蒿三味藥材組成，具有清熱、疏風(fēng)、解毒等功效，其除有效成分外，也可能含有導(dǎo)致不良反應(yīng)的大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、聚合物等。為保證臨床用藥的安全，更好地控制藥品質(zhì)量，增加中藥注射劑高分子物質(zhì)檢測(cè)十分必要。
[0003]王一博等人《HPSEC法檢測(cè)中藥注射液中的高分子量物質(zhì)》建立高效分子排阻色譜法(HPSEC)檢測(cè)中藥注射液中的高分子量物質(zhì)，該文獻(xiàn)方法的流速偏低，致使保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，且易造成峰形展寬等現(xiàn)象；賴宇紅等人《注射用丹參分子排阻色譜及指紋圖譜差減分析》分別應(yīng)用凝膠分子排阻色譜、碳十八反相液相色譜進(jìn)行指紋圖譜分析，通過(guò)綜合差減分析揭示非小分子酚酸類成分信息。該文獻(xiàn)采用的流動(dòng)相為三氟醋酸-乙腈-水(0.05: 10: 90)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明采用此種流動(dòng)相測(cè)定，高分子物質(zhì)的色譜行為為非理想排阻行為。王新彤《清開靈注射液中大分子蛋白的檢測(cè)研究》公開了尺寸排阻色譜法可用于清開靈注射劑中大分子蛋白分析，該文獻(xiàn)的線性關(guān)系考察只采用了 3個(gè)對(duì)照品進(jìn)行考察，數(shù)據(jù)可靠性偏低。
[0004]CN102411033A中公開了一種檢測(cè)中藥注射液中高分子物質(zhì)的方法，以胸腺肽α和人生長(zhǎng)激素釋放抑制因子為對(duì)照品，采用TSK G2000SWXL型凝膠柱對(duì)中藥注射液中的高分子物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在進(jìn)樣體積20 μ 1，檢出限為0.08 μ g下未能檢出大分子物質(zhì)。但是該方法的流動(dòng)相為乙腈-0.83%三氟乙酸溶液(40: 60)，根據(jù)《中國(guó)藥典2010年版二部》分子排阻色譜法的要求:流動(dòng)相中有機(jī)相比例不應(yīng)超過(guò)30%，且溶液的pH值不宜超出色譜柱的耐受力，該方法有機(jī)相比例超出30%，且酸度過(guò)高，超出色譜柱的耐受范圍，不符合《中國(guó)藥典》的技術(shù)要求，其檢測(cè)結(jié)果的可信度不高。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種檢測(cè)熱毒寧注射液中高分子物質(zhì)的方法。
[0006]本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0007]一種檢測(cè)熱毒寧注射液中高分子物質(zhì)的方法，包含如下步驟:
[0008](I)對(duì)照溶液的制備:配制胸腺肽α I標(biāo)準(zhǔn)品溶液；
[0009](2)供試品溶液的制備:用流動(dòng)相稀釋熱毒寧注射液，配制成供試品溶液；
[0010](3)檢測(cè):分別吸取供試品溶液和對(duì)照溶液注入高效液相色譜儀，按照高效液相色譜法測(cè)定各溶液的色譜將先于胸腺肽α I出峰時(shí)間的峰視為高分子物質(zhì)，按面積歸一化法計(jì)算其含量。
[0011]步驟(1)所述的配制胸腺肽α I標(biāo)準(zhǔn)品溶液優(yōu)選取胸腺肽α I標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并稀釋制成胸腺肽α I濃度為25-50 μ g/ml的溶液，搖勻，即得。
[0012]步驟(2)所述的供試品溶液的制備優(yōu)選:精密量取熱毒寧注射液適量，加流動(dòng)相稀釋5-10倍，搖勻，即得供試品溶液。
[0013]所述的步驟(3)中，高效液相色譜條件優(yōu)選為:色譜柱:凝膠色譜柱；以乙腈-0.1 %三氟乙酸體積比為30: 70為流動(dòng)相；流速為每分鐘0.5-0.7ml ;柱溫25_30°C ；檢測(cè)器:VWD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為214±lnm ;理論板數(shù)按胸腺肽α I計(jì)算應(yīng)不低于10000。
[0014]所述的步驟(3)中，高效液相色譜條件進(jìn)一步優(yōu)選為:色譜柱:凝膠色譜柱；以乙腈-0.1 %三氟乙酸體積比為30: 70為流動(dòng)相；流速為每分鐘0.7ml ;柱溫30°C ;檢測(cè)器:VffD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm ;理論板數(shù)按胸腺肽α I計(jì)算應(yīng)不低于10000。
[0015]步驟(3)中高效液相色譜檢測(cè)的進(jìn)樣量?jī)?yōu)選10 μ I。
[0016]所述的檢測(cè)熱毒寧注射液中高分子物質(zhì)的方法，優(yōu)選包含如下步驟:
[0017](I)對(duì)照溶液的制備:
[0018]取胸腺肽α I標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，用水溶解并稀釋制成胸腺肽α I濃度為25 μ g/ml的溶液，搖勻，即得，所述的胸腺肽α I標(biāo)準(zhǔn)品分子量為3108 ；
[0019](2)供試品溶液的制備:
[0020]精密量取熱毒寧注射液1ml，加流動(dòng)相稀釋至10ml，搖勻，即得；
[0021](3)檢測(cè):
[0022]分別吸取供試品溶液和對(duì)照溶液各10 μ I注入高效液相色譜儀，按照高效液相色譜法測(cè)定，各溶液的色譜圖中將先于胸腺肽α I出峰時(shí)間的峰視為高分子物質(zhì)，按面積歸一化法計(jì)算其含量。
[0023]有益效果:
[0024]本發(fā)明采用分子排阻色譜法，并結(jié)合熱毒寧注射液生產(chǎn)工藝的特點(diǎn)，通過(guò)對(duì)色譜條件的優(yōu)化，建立了熱毒寧注射液高分子物質(zhì)檢測(cè)方法。根據(jù)分子排阻色譜理論，溶質(zhì)分子的保留是由于小分子化合物進(jìn)入填滿溶劑的填料孔，而較大的分子根據(jù)它們體積的大小而被排阻，大分子優(yōu)先于小分子被洗脫出來(lái)。被測(cè)樣品中組分將按照分子量由大到小的順序被洗脫下來(lái)，將先于對(duì)照品出峰時(shí)間的峰視為高分子物質(zhì)，按面積歸一化法計(jì)算其含量。通過(guò)重復(fù)性、分離度、檢出限、精密度、分子量對(duì)數(shù)-保留時(shí)間曲線、溶液穩(wěn)定性考察，證明本發(fā)明建立的熱毒寧注射液高分子物質(zhì)檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、重復(fù)性好，可作為熱毒寧注射液質(zhì)量?jī)?nèi)控方法，對(duì)中藥注射劑的質(zhì)量控制具有指導(dǎo)意義。
[0025]本發(fā)明較之CN102411033A中公開的一種檢測(cè)中藥注射液中高分子物質(zhì)的方法存在以下優(yōu)點(diǎn):
[0026]1、首次應(yīng)用在熱毒寧注射液產(chǎn)品上。
[0027]2、符合2010年版《中國(guó)藥典》的技術(shù)要求，可信度高。
[0028] 3、準(zhǔn)確度，精密度，穩(wěn)定性均較好。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】[0029]圖1五種蛋白質(zhì)對(duì)照品色譜圖，A到E圖分別對(duì)應(yīng)牛血清白蛋白、胰蛋白酶、核糖核酸酶A、人胰島素、胸腺肽α I色譜圖。
[0030]圖2蛋白分子量對(duì)數(shù)-保留時(shí)間曲線。
[0031]圖311批熱毒寧注射液高分子物質(zhì)測(cè)定色譜圖-以胸腺肽α I為對(duì)照。
【具體實(shí)施方式】
[0032]以下實(shí)施例中所涉及的樣品來(lái)源如下:
[0033]1、熱毒寧注射液:江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，規(guī)格:10ml/支
[0034]批號(hào):100919、100906、101011、110702、110703、110704、110705、110708、110710、110711、110712、110714。
[0035]2、胸腺肽 α 1:分子量 3108Amresco99.10% ;批號(hào):110321050_201106。
[0036]3、人胰島素:分子量 5800Amresco27.5u/mg ;批號(hào):11070738_201106。
[0037]4、牛血清白蛋白:分子量66446，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；批號(hào)BSA081110。
[0038]5、胰蛋白酶:分子量 23463，Sigma ;批號(hào) 1997B017。
[0039]6、核糖核酸酶A:分子量13700，中國(guó)食品藥品檢定研究院；批號(hào)140635-200802。
[0040]實(shí)施例1以蛋白質(zhì)為對(duì)照品HPLC方法的建立
[0041]1.1色譜條件優(yōu)選
[0042]1.1.1檢測(cè)波長(zhǎng)的確定
[0043]因蛋白質(zhì)在低波長(zhǎng)處有較好吸收，故選擇214nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。
[0044]1.1.2流動(dòng)相優(yōu)選
[0045]儀器:AgilentllOO(VWD);
[0046]凝膠柱:TSKG2000SWxl，300mmX7.8mm，5ym ;
[0047]柱溫:30°C;
[0048]檢測(cè)波長(zhǎng):214nm；
[0049]流動(dòng)相一:以0.lmol/L硫酸鈉為流動(dòng)相,流速為0.5ml/min ；
[0050]流動(dòng)相二:以乙腈-0.05%三氟乙酸(乙腈與0.05%三氟乙酸體積比為30: 70)為流動(dòng)相，流速為0.7ml/min ；
[0051]流動(dòng)相三:以乙腈-0.08%三氟乙酸(乙腈與0.08%三氟乙酸體積比為30: 70)為流動(dòng)相，流速為0.7ml/min ；
[0052]流動(dòng)相四:以乙腈-0.1%三氟乙酸(乙腈與0.1%三氟乙酸體積比為30: 70)為流動(dòng)相，流速為0.7ml/min ；
[0053]流動(dòng)相五:以乙腈-0.83%三氟乙酸(乙腈與0.83%三氟乙酸體積比為40: 60)為流動(dòng)相(CN102411033A中流動(dòng)相)，流速為0.7ml/min。
[0054]結(jié)果表明:在流動(dòng)相一條件下，牛血清白蛋白、核糖核酸酶A、人胰島素、胸腺肽α I四種蛋白呈現(xiàn)非理想排阻行為；在流動(dòng)相二至流動(dòng)相五條件下，隨著三氟乙酸濃度的增大，牛血清白蛋白、核糖核酸酶Α、人胰島素、胸腺肽α I四種蛋白的色譜行為由非理想排阻行為逐漸呈現(xiàn)理想的排阻行為，流動(dòng)相三至流動(dòng)相五條件下四種蛋白的分子量對(duì)數(shù)-保留時(shí)間曲線相關(guān) 系數(shù)大小順序?yàn)?流動(dòng)相五>流動(dòng)相四>流動(dòng)相三，流動(dòng)相四雖然線性關(guān)系不如流動(dòng)相五，但根據(jù)《中國(guó)藥典2010年版二部》分子排阻色譜法的要求，流動(dòng)相四有機(jī)相的比例及pH均符合其要求，而流動(dòng)相五有機(jī)相比例超過(guò)30%且酸度過(guò)高，超出色譜柱的耐受范圍，綜合考慮故以乙腈-0.1%三氟乙酸(30: 70)為流動(dòng)相。結(jié)果見表1。
[0055]表1五種流動(dòng)相下對(duì)照品溶液的保留時(shí)間考察
[0056]
【權(quán)利要求】
1.一種檢測(cè)熱毒寧注射液中高分子物質(zhì)的方法，其特征在于包含如下步驟: (1)對(duì)照溶液的制備:配制胸腺肽α1標(biāo)準(zhǔn)品溶液； (2)供試品溶液的制備:用流動(dòng)相稀釋熱毒寧注射液，配制成供試品溶液； (3)檢測(cè):分別吸取供試品溶液和對(duì)照溶液注入高效液相色譜儀，按照高效液相色譜法測(cè)定各溶液的色譜將先于胸腺肽α 1出峰時(shí)間的峰視為高分子物質(zhì)，按面積歸一化法計(jì)算其含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)熱毒寧注射液中高分子物質(zhì)的方法，其特征在于步驟(1)所述的配制胸腺肽α1標(biāo)準(zhǔn)品溶液是取胸腺肽α 1標(biāo)準(zhǔn)品，用水溶解并稀釋制成胸腺肽α1濃度為25-50 μ g/ml的溶液，搖勻，即得。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)熱毒寧注射液中高分子物質(zhì)的方法，其特征在于步驟(2)所述的供試品溶液的制備:精密量取熱毒寧注射液適量，加流動(dòng)相稀釋5-10倍，搖勻，即得供試品溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)熱毒寧注射液中高分子物質(zhì)的方法，其特征在于所述的步驟(3)中，高效液相色譜條件為:色譜柱:凝膠色譜柱；以乙腈-0.1 %三氟乙酸體積比為30: 70為流動(dòng)相；流速為每分鐘0.5-0.7ml ;柱溫25_30°C;檢測(cè)器:VWD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為214±lnm ;理論板數(shù)按胸腺肽α1計(jì)算應(yīng)不低于10000。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)熱毒寧注射液中高分子物質(zhì)的方法，其特征在于所述的步驟(3)中，高效液相色譜條件為:色譜柱:凝膠色譜柱；以乙腈-0.1%三氟乙酸體積比為30: 70為流動(dòng)相；流速為每分鐘0.7ml ;柱溫30°C;檢測(cè)器:VWD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm ;理論板數(shù)按胸腺肽α I計(jì)算應(yīng)不低于10000。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)熱毒寧注射液中高分子物質(zhì)的方法，其特征在于步驟(3)中高效液相色譜檢測(cè)的進(jìn)樣量為10μ1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)熱毒寧注射液中高分子物質(zhì)的方法，其特征在于包含如下步驟: (1)對(duì)照溶液的制備: 取胸腺肽α I標(biāo)準(zhǔn)品適量，精密稱定，用水溶解并稀釋制成胸腺肽α I濃度為25 μ g/ml的溶液，搖勻，即得，所述的胸腺肽α1標(biāo)準(zhǔn)品分子量為3108 ； (2)供試品溶液的制備: 精密量取熱毒寧注射液1ml，加流動(dòng)相稀釋至10ml，搖勻，即得； (3)檢測(cè):分別吸取供試品溶液和對(duì)照溶液各10μ 1注入高效液相色譜儀，按照高效液相色譜法測(cè)定各溶液的色譜將先于胸腺肽αI出峰時(shí)間的峰視為高分子物質(zhì)，按面積歸一化法計(jì)算其含量。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK103901123SQ201210584857
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2012年12月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月28日
【發(fā)明者】蕭偉, 王振中, 畢宇安, 王雪, 李家春, 王永香, 徐豐果, 章晨峰, 徐海娟, 付小環(huán) 申請(qǐng)人:江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司