專利名稱：檢測(cè)萊克多巴胺的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)萊克多巴胺的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，用于檢測(cè)動(dòng)物源性食品中如動(dòng)物組織、內(nèi)臟、血液、尿液和飼料、飼料原料中的萊克多巴胺含量或殘留量。屬于免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
萊克多巴胺(Ractopamin)屬于β -興奮劑。β -興奮劑是營(yíng)養(yǎng)重分配劑的一種， 是一類結(jié)構(gòu)和功能類似腎上腺素和去甲腎上腺素的苯乙醇胺類衍生物，它能改善脂肪型動(dòng)物的肉與脂肪的比例，降低酮體脂肪含量，提高瘦肉率，并能加速動(dòng)物生長(zhǎng)，而被添加于動(dòng)物飼料中。常見(jiàn)的β 2-興奮劑有克倫特羅、萊克多巴胺及沙丁胺醇等。隨著我國(guó)對(duì)克倫特羅(俗稱"瘦肉精")監(jiān)管力度的加大，克倫特羅的使用逐漸減少，其他β2_興奮劑的使用逐漸增加。由于萊克多巴胺有類似于克倫特羅的作用，在動(dòng)物組織中殘留，從而對(duì)人體產(chǎn)生不利影響，所以我國(guó)禁止萊克多巴胺其作為飼料添加劑使用。
在萊克多巴胺的檢測(cè)方法方面，目前最為常用的方法包括高效液相色譜法 (HPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)、毛細(xì)管電泳、酶聯(lián)免疫吸附分析法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)等方法。
I、高效液相色譜(HPLC)用于萊克多巴胺的檢測(cè)
HPLC法具有檢測(cè)精確度高、假陽(yáng)性率低的特點(diǎn)。HPLC法的主要缺點(diǎn)是儀器價(jià)格昂貴、操作比較繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，檢測(cè)費(fèi)用昂貴；且前期樣品的萃取條件的選擇也對(duì)檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確性有較大影響。
2、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)用于萊克多巴胺的檢測(cè)
GC-MS靈敏度很高，假陽(yáng)性率低。該方法的主要缺點(diǎn)是樣品需要衍生化這樣復(fù)雜的前期處理。雖然經(jīng)過(guò)衍生化處理的樣品能在質(zhì)譜中給出更多的結(jié)構(gòu)信息，但是衍生化會(huì)產(chǎn)生多個(gè)不同的產(chǎn)物并導(dǎo)致樣品的部分丟失，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差。
3、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)用于萊克多巴胺的檢測(cè)
LC-MS對(duì)樣品不需要衍生化處理，可對(duì)尿液、血液、肝臟、毛發(fā)和眼球樣品進(jìn)行檢測(cè)。LC如果與兩個(gè)串聯(lián)MS聯(lián)用，可進(jìn)一步提高信噪比。LC-MS的缺點(diǎn)與GC-MS—樣，操作步驟繁瑣，需要貴重儀器，所以一般用作對(duì)陽(yáng)性結(jié)果的確認(rèn)手段。
4、毛細(xì)管電泳用于萊克多巴胺的檢測(cè)
毛細(xì)管區(qū)帶電泳法分離效率可達(dá)幾百萬(wàn)理論塔板數(shù)，操作快速簡(jiǎn)便，所需樣品量少。但是該方法所需儀器昂貴，且可檢測(cè)出萊克多巴胺的最低殘留量達(dá)不到其它方法的靈敏度。
5、酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)用于萊克多巴胺的檢測(cè)
酶聯(lián)免疫吸附分析法是當(dāng)前應(yīng)用最廣、發(fā)展最快的免疫酶技術(shù)之一，主要優(yōu)點(diǎn)在于檢測(cè)迅速，樣品前處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)系統(tǒng)操作簡(jiǎn)單，成本低，同時(shí)便于進(jìn)行大規(guī)模檢測(cè)。 其基本原理是，將抗原(或抗體)吸附在固相載體上，酶標(biāo)記抗體(或抗原)與相應(yīng)的抗原(或抗體)反應(yīng)，結(jié)合在免疫復(fù)合物上的酶在遇到相應(yīng)底物時(shí)，可以催化底物水解、氧化或還原并產(chǎn)生有色物質(zhì)，顏色的深淺與相應(yīng)的抗體(或抗原)量成正比，故可以借助成色反應(yīng)的程度來(lái)定性或定量抗體(或抗原)。ELISA檢測(cè)方法主要包括雙抗體夾心法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法等。雙抗體夾心法主要適用于分子量較大的完全抗原，而競(jìng)爭(zhēng)法則適用于抗原決定位點(diǎn)較少的小分子量半抗原。由于萊克多巴胺是小分子化合物(相對(duì)分子質(zhì)量小于5000)，屬于半抗原，因此常用競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附法來(lái)測(cè)定。
6、化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)技術(shù)的工作原理與特點(diǎn)
化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)技術(shù)不同于酶聯(lián)免疫吸附分析法，它是化學(xué)發(fā)光法和免疫分析法結(jié)合的產(chǎn)物，因此同時(shí)具有化學(xué)發(fā)光檢測(cè)技術(shù)的高靈敏性和免疫分析技術(shù)的高特異性。
化學(xué)發(fā)光免疫分析法的基本原理與ELISA相似，不同之處在于酶標(biāo)記物的反應(yīng)體系是化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。HRP(辣根過(guò)氧化物酶)和魯米諾或其衍生物體系就是常用的反應(yīng)體系之一，在該發(fā)光體系中加入增強(qiáng)劑可增加化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，并在較長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定，從而大大提高免疫分析的靈敏度。如我國(guó)胥傳來(lái)等(胥傳來(lái)等，分析化學(xué)研究簡(jiǎn)報(bào)，2005， 33(5) =699-702)建立的間接競(jìng)爭(zhēng)化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)豬尿樣中克倫特羅，實(shí)際檢測(cè)范圍為O. 04 25. 8μ g/kg。胥傳來(lái)等人所用方法的缺點(diǎn)是需要同時(shí)使用一抗和二抗(其中二抗為酶標(biāo)記抗體)，兩種抗體加入后都需要進(jìn)行溫育反應(yīng)，延長(zhǎng)了檢測(cè)時(shí)間。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測(cè)萊克多巴胺的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，具有快速簡(jiǎn)便、靈敏度高、檢測(cè)成本低、重復(fù)性好、高通量等優(yōu)點(diǎn)，可用于動(dòng)物尿液、血樣、組織、內(nèi)臟和飼料、飼料原料等樣品中萊克多巴胺的殘留量檢測(cè)。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明主要是利用抗原與抗體的特異性免疫反應(yīng)的基本原理來(lái)實(shí)現(xiàn)的?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法是化學(xué)發(fā)光法和免疫分析法結(jié)合的產(chǎn)物，因此同時(shí)具有化學(xué)發(fā)光法的高靈敏性和免疫分析法的高特異性。在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中，樣品中萊克多巴胺含量越高，反應(yīng)體系中發(fā)光強(qiáng)度越弱；反之，樣品中萊克多巴胺含量越少，發(fā)光強(qiáng)度越高。
本發(fā)明的檢測(cè)萊克多巴胺的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒含有以下成份
I、包被有萊克多巴胺-載體蛋白交聯(lián)復(fù)合物的不透明白色酶標(biāo)板。所述萊克多巴胺-載體蛋白交聯(lián)復(fù)合物是將萊克多巴胺與載體蛋白通過(guò)混合酸酐法或直接活化蛋白法偶聯(lián)得到，所述載體蛋白為人血清白蛋白、牛血清白蛋白、雞蛋白蛋白、鼠血清蛋白或兔血清蛋白。
2、萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品。
3、萊克多巴胺-過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體。該成份為用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的萊克多巴胺抗體。所述萊克多巴胺抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
4、發(fā)光底物液。該發(fā)光底物液是以魯米諾或異魯米諾為發(fā)光劑的化學(xué)發(fā)光底物液，需要分為A液和B液保存，在臨用前按1:1混合使用，其中A液(或B液)為魯米諾 (或異魯米諾)和發(fā)光增強(qiáng)劑，B液(或A液)為過(guò)氧化氫溶液或尿素過(guò)氧化氫溶液。
5、濃縮緩沖液。該濃縮緩沖液的工作濃度(即蒸餾水稀釋后的使用濃度)為 O. 01 O. 5mol/L, pH 值為 6. O 9. O,吐溫-20 的含量為 O. 01 O. 5% (v/v)。
本發(fā)明中，所述的不透明白色酶標(biāo)板為48孔或96孔的可拆卸或不可拆卸的不透明白色酶標(biāo)板。
本發(fā)明中 ，所述的萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品，由一系列不同濃度的萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品組成，濃度范圍至少包含了 O. 02 3μ g/L的濃度區(qū)間。
本發(fā)明中，所述的萊克多巴胺-過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體為用過(guò)氧化物酶標(biāo)記的萊克多巴胺抗體，如辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的萊克多巴胺抗體。
本發(fā)明所述的發(fā)光底物液為市售的任一種以魯米諾或異魯米諾為發(fā)光劑的化學(xué)發(fā)光底物液。
所述的濃縮緩沖液，為含有吐溫-20 (Tween-20)緩沖液的2 100倍濃縮液，該緩沖液可以是磷酸緩沖液(PBST)、甘氨酸-HCl緩沖液或Tris-HCl緩沖液，使用前用蒸餾水稀釋至工作濃度后使用。
本發(fā)明的試劑盒應(yīng)用于萊克多巴胺的檢測(cè)時(shí)，檢測(cè)步驟為
I)樣品前處理。
2)將本發(fā)明的試劑盒(含酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、濃縮緩沖液、萊克多巴胺-過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體、發(fā)光底物溶液)從冰箱取出，置于室溫下，回溫10_60min。
3)工作濃度緩沖液的配制用蒸餾水將濃縮緩沖液稀釋至工作濃度，即可作為酶標(biāo)記物稀釋液、樣品稀釋液與酶標(biāo)板清洗液。
4)萊克多巴胺-過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體配制利用工作濃度緩沖液將萊克多巴胺-過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體稀釋至工作濃度，即完成該標(biāo)記抗體的配制。稀釋后的標(biāo)記抗體應(yīng)盡快使用，若保存于-20°C，保存期不超過(guò)一個(gè)月；若保存于4°C，保存期不超過(guò)一個(gè)星期。
5)于適當(dāng)微孔中分別加入萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液和待測(cè)試樣，標(biāo)準(zhǔn)和試樣至少做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。
6)加入適量稀釋好的的萊克多巴胺-過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體到每一個(gè)微孔中。使其充分混合后于室溫下避光靜置溫育30 90分鐘(min)。
7)倒出孔中的液體并甩干，將微孔架倒置在吸水紙上拍打以保證完全除去孔中的液體。
8)將工作濃度緩沖液加入每孔中，再次倒掉微孔中的液體甩干，重復(fù)洗2 3次。
9)加入發(fā)光底物液，混合好后在化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀內(nèi)檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度(RLU)。
10)檢測(cè)結(jié)果的計(jì)算用所獲得的標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液發(fā)光值與空白溶液的比值進(jìn)行計(jì)算。見(jiàn)下式
相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度=RLU/RLUmax
式中
RLU——標(biāo)準(zhǔn)(或試樣)溶液的發(fā)光強(qiáng)度值；
RLUmax——空白(濃度為O的標(biāo)準(zhǔn)溶液)的發(fā)光強(qiáng)度值。
將計(jì)算的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度值對(duì)應(yīng)萊克多巴胺濃度(μ g/L)的自然對(duì)數(shù)作半對(duì)數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖。各待測(cè)樣品的萊克多巴胺濃度根據(jù)其RLU值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出，或通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線相應(yīng)的方程計(jì)算得出。如樣品經(jīng)過(guò)了預(yù)先稀釋，應(yīng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度要再乘以其稀釋倍數(shù)。
本發(fā)明的試劑盒可用于動(dòng)物尿液、血樣、組織及內(nèi)臟等樣品中萊克多巴胺的殘留量檢測(cè)。與現(xiàn)有的其它檢測(cè)萊克多巴胺殘留量的實(shí)驗(yàn)方法比較，本發(fā)明的試劑盒有以下優(yōu)點(diǎn)1)采用化學(xué)發(fā)光免疫法的本發(fā)明試劑盒，比色譜方法(高效液相、液質(zhì)聯(lián)用、氣質(zhì)聯(lián)用)、毛細(xì)管電泳方法更為快速簡(jiǎn)便，所需儀器更為簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本更為低廉，同時(shí)具有高通量的特點(diǎn)。2)采用化學(xué)發(fā)光免疫法的本發(fā)明試劑盒，比ELISA方法更為靈敏，可以檢測(cè)出更低濃度和含量的萊克多巴胺殘留，同時(shí)線性范圍更寬。3)采用化學(xué)發(fā)光免疫法的本發(fā)明試劑盒，減少了二抗的使用環(huán)節(jié)，從而減少了溫育時(shí)間，縮短了檢測(cè)時(shí)間；不透明白色酶標(biāo)板增加了化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀靈敏度。另外，用萊克多巴胺-載體蛋白交聯(lián)復(fù)合物而非萊克多巴胺抗體來(lái)包被不透明白色酶標(biāo)板，減少了萊克多巴胺抗體的不穩(wěn)定性，保證了試劑盒的長(zhǎng)期有效性。
具體實(shí)施方式
以下通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明， 而不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例I
I)試劑盒各組分的制備
萊克多巴胺半抗原的準(zhǔn)備將萊克多巴胺酸化，在4°C無(wú)光低溫環(huán)境中與亞硝酸鈉作用，生成含重氮基正離子的中間體。重氮化的萊克多巴胺作為半抗原，用于后面合成免疫抗原與包被抗原。
牛血清白蛋白-萊克多巴胺免疫抗原的合成將萊克多巴胺與牛血清白蛋白 (BSA)采用重氮化法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫抗原。
人血清白蛋白-萊克多巴胺包被抗原的合成將萊克多巴胺與人血清白蛋白 (HSA)采用重氮化法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫抗原。
萊克多巴胺-過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體的制備將上述免疫抗原注入Balb/C小鼠體內(nèi)，經(jīng)多次加強(qiáng)免疫后，使其產(chǎn)生抗體血清。取出免疫后小鼠的脾細(xì)胞，加入離心管中混勻。 將上述脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，在含有HAT溶液的96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行C02培養(yǎng)， 篩選陽(yáng)性孔。然后利用有限稀釋法得到分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。取健康Balb/C 小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟lmL，7d后向腹腔注射上述雜交瘤細(xì)胞懸液lmL。7d后采集腹水，加等量液體石蠟稀釋，加入二氧化硅粉末混勻，離心得澄清腹水。澄清腹水用辛酸-硫酸銨法進(jìn)行純化，再經(jīng)透析得到純化的萊克多巴胺單克隆抗體。萊克多巴胺單克隆抗體與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)，從而得到萊克多巴胺-過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體。
包被有萊克多巴胺-HSA交聯(lián)復(fù)合物的不透明白色酶標(biāo)板制備用緩沖液將萊克多巴胺-HSA交聯(lián)復(fù)合物稀釋后用于包被不透明白色酶標(biāo)板的檢測(cè)孔，4°C過(guò)夜后用PBST緩沖液洗滌，然后加入200 μ L封閉液(含2% (w/v)HSA的PBST)，37°C溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后完成。
2)檢測(cè)萊克多巴胺的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的組建
組建的檢測(cè)萊克多巴胺的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，包含了以下組成部分
(6)96孔不透明白色酶標(biāo)板(12條X8孔)包被有萊克多巴胺-人血清白蛋白交聯(lián)復(fù)合物，用鋁膜真空密封包裝。
(7)萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為
O μ g/L、0. 04 μ g/L、0. 12 μ g/L、0. 36 μ g/L、1. 08 μ g/L、3. 24 μ g/L
(8)萊克多巴胺-辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體溶液。
(9)發(fā)光底物A液(魯米諾及增強(qiáng)劑)，發(fā)光底物B液(尿素過(guò)氧化氫)。
(10) 100倍濃縮緩沖液。使用前稀釋100倍成為工作濃度緩沖液，其稀釋后的工作濃度緩沖液為 O. 05mol/L PBST 緩沖液，pH 7. 4，含(λ 05% (v/v)Tween-20
3)萊克多巴胺的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒的使用
(I)樣品的前處理
a.尿液試樣
直接將尿液適當(dāng)稀釋(6-10倍)后進(jìn)行測(cè)試，如有混濁請(qǐng)先離心(3000r/ min) IOmin,取上清液適當(dāng)稀釋后分析。
b.血液試樣
抽取待測(cè)動(dòng)物血樣，離心(3000r/min) IOmin取透明上清液使用，或靜置取其透明上清液使用，注意不要有溶血。取O.1ml血清，加入0.4ml稀釋液，漩渦一分鐘，混勻。離心 10分鐘(3000r/min),取上清液IOOul,進(jìn)行分析。
c.肌肉、肝臟及腎臟試樣
取Ig已勻質(zhì)樣品置入離心管中，再加入4ml O. OlN HC1，漩渦一分鐘。以80_100°C 水浴加熱約3分鐘，離心10分鐘(5000rpm)，上清液與稀釋液進(jìn)行1: 3稀釋后，取100 μ L 進(jìn)行分析。
(2)化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒檢測(cè)
將標(biāo)準(zhǔn)和試樣所需數(shù)量的孔條插入微孔板框架中，記錄標(biāo)準(zhǔn)和試樣的位置。于適當(dāng)微孔中分別加入萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)溶液和待測(cè)試樣。加入50 μ L萊克多巴胺-辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體到每一個(gè)微孔中，充分混合后于室溫下避光靜置溫育I小時(shí)。除去孔中的液體，用工作濃度緩沖液重復(fù)清洗三次。完全除去孔中的液體，加入發(fā)光底物液混合液(Α液與B液在使用前按1:1混勻)100 μ L/孔?；旌虾煤罅⒓丛诨瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)儀內(nèi)檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度。
(3)檢測(cè)結(jié)果的計(jì)算分析
用所獲得的標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液發(fā)光值與空白溶液的比值進(jìn)行計(jì)算。見(jiàn)下式
相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度=RLU/RLUmax
式中
RLU——標(biāo)準(zhǔn)(或試樣)溶液的發(fā)光強(qiáng)度值；
RLUmax——空白(濃度為O的標(biāo)準(zhǔn)溶液)的發(fā)光強(qiáng)度值。
將計(jì)算的相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度值對(duì)應(yīng)萊克多巴胺濃度(μ g/L)的自然對(duì)數(shù)作半對(duì)數(shù)坐標(biāo)系統(tǒng)曲線圖。如樣品經(jīng)過(guò)了預(yù)先稀釋，應(yīng)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的樣品濃度要再乘以其稀釋倍數(shù)。
實(shí)施例2
檢測(cè)萊克多巴胺的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，包含了以下組成部分
(1)48孔不透明白色酶標(biāo)板(6條X 8孔)包被有萊克多巴胺-鼠血清白蛋白交聯(lián)復(fù)合物，用鋁膜真空密封包裝。
(2)萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液5瓶，濃度分別為
O μ g/L、0. 04 μ g/L、0. 36 μ g/L、3. 24 μ g/L、29. 16 μ g/L
(3)萊克多巴胺-辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體溶液。
(4)發(fā)光底物A液(魯米諾及增強(qiáng)劑)，發(fā)光底物B液(尿素過(guò)氧化氫)。
(5) 50倍濃縮緩沖液。使用前稀釋50倍成為工作濃度緩沖液，其稀釋后的工作濃度緩沖液為 O. 05mol/L Tris-HCl 緩沖液，pH6. 9，含 O. 1% (v/v) Tween-20
實(shí)施例3
檢測(cè)萊克多巴胺的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，包含了以下組成部分
(1)96孔不透明白色酶標(biāo)板(12條X8孔)包被有萊克多巴胺-雞蛋白蛋白交聯(lián)復(fù)合物，用鋁膜真空密封包裝。
(2)萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為
O μ g/L、0. 05 μ g/L、0. 25 μ g/L、1. 25 μ g/L、6. 25 μ g/L、31. 25 μ g/L。
(3)萊克多巴胺-辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體溶液。(4)發(fā)光底物A液(魯米諾及增強(qiáng)劑)，發(fā)光底物B液(尿素過(guò)氧化氫)。
(5) 10倍濃縮緩沖液。使用前稀釋10倍成為工作濃度緩沖液，其稀釋后的工作濃度緩沖液為 O. 05mol/L 甘氨酸-HCl 緩沖液，ρΗ6· 9，含 O. 02% (v/v)Tween-200
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)萊克多巴胺的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，其特征在于由以下組分組成 (1)96孔不透明白色酶標(biāo)板，12條X8孔，包被有萊克多巴胺-人血清白蛋白交聯(lián)復(fù)合物，用鋁膜真空密封包裝； (2)萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，濃度分別為 O μ g/L、0. 04 μ g/L、0. 12 μ g/L、0. 36 μ g/L、I. 08 μ g/L、3. 24 μ g/L ； (3)萊克多巴胺-辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體溶液， (4)發(fā)光底物A液為魯米諾及增強(qiáng)劑，發(fā)光底物B液為尿素過(guò)氧化氫； (5)100倍濃縮緩沖液，使用前稀釋100倍成為工作濃度緩沖液，其稀釋后的工作濃度緩沖液為 O. 05mol/L PBST 緩沖液，pH 7. 4，含 O. 05% (v/v)Tween-20 ； 所述組分的制備為 萊克多巴胺半抗原的準(zhǔn)備將萊克多巴胺酸化，在4 V無(wú)光低溫環(huán)境中與亞硝酸鈉作用，生成含重氮基正離子的中間體，重氮化的萊克多巴胺作為半抗原，用于后面合成免疫抗原與包被抗原； 人血清白蛋白-萊克多巴胺包被抗原的合成將萊克多巴胺與人血清白蛋白采用重氮化法進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫抗原； 萊克多巴胺-過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體的制備將上述免疫抗原注入Balb/C小鼠體內(nèi)，經(jīng)多次加強(qiáng)免疫后，使其產(chǎn)生抗體血清，取出免疫后小鼠的脾細(xì)胞，加入離心管中混勻，將上述脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合，在含有HAT溶液的96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行C02培養(yǎng)，篩選陽(yáng)性孔，然后利用有限稀釋法得到分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，取健康Balb/C小鼠，腹腔注射滅菌液體石蠟lmL，7d后向腹腔注射上述雜交瘤細(xì)胞懸液lmL，7d后采集腹水，加等量液體石蠟稀釋，加入二氧化硅粉末混勻，離心得澄清腹水，澄清腹水用辛酸-硫酸銨法進(jìn)行純化，再經(jīng)透析得到純化的萊克多巴胺單克隆抗體，萊克多巴胺單克隆抗體與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)，從而得到萊克多巴胺-過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體； 包被有萊克多巴胺-HSA交聯(lián)復(fù)合物的不透明白色酶標(biāo)板制備用緩沖液將萊克多巴胺-HSA交聯(lián)復(fù)合物稀釋后用于包被不透明白色酶標(biāo)板的檢測(cè)孔，4°C過(guò)夜后用PBST緩沖液洗滌，然后加入200 μ L封閉液，所述封閉液含2% (w/v)HSA的PBST，37°C溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后完成。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種檢測(cè)萊克多巴胺的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，屬于免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，本發(fā)明的試劑盒由包被有萊克多巴胺-載體蛋白交聯(lián)復(fù)合物的不透明白色酶標(biāo)板、萊克多巴胺標(biāo)準(zhǔn)品、萊克多巴胺-過(guò)氧化物酶標(biāo)記抗體、發(fā)光底物液、濃縮緩沖液組成，所述萊克多巴胺-載體蛋白交聯(lián)復(fù)合物是將萊克多巴胺與載體蛋白通過(guò)混合酸酐法或直接活化蛋白法偶聯(lián)得到，濃縮緩沖液含有吐溫-20緩沖液，本發(fā)明的試劑盒具有快速簡(jiǎn)便、靈敏度高、檢測(cè)成本低、重復(fù)性好、高通量等優(yōu)點(diǎn)，可用于動(dòng)物尿液、血樣、組織及內(nèi)臟等樣品中萊克多巴胺的殘留量檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/577GK102980999SQ20121045891
公開(kāi)日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2008年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月27日
發(fā)明者陳 峰, 盧慶鋆, 徐曉嬰, 梁曉翠, 盧永紅 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)