專利名稱：葡萄球菌腸毒素c化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種超抗原檢測的試劑盒，特別是一種葡萄球菌腸毒素C化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析檢測試劑盒，該試劑盒利用雙抗體夾心化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法來定量檢測食品中尤其是牛奶中的金黃色葡萄球菌腸毒素C含量。
背景技術(shù)：
食品安全與人類健康密切相關(guān)，食品安全問題已成為社會關(guān)注的熱點問題。借助于免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建完善的食源性疾病監(jiān)控體系，實施全方位的食品安全監(jiān)控，將有助于提髙食品工業(yè)的產(chǎn)品質(zhì)量，從而保障公眾的健康。金黃色葡萄球菌是一種人畜共患病的重要致病菌，該菌廣泛存在于空氣、水、塵埃及人和動物等溫血動物的皮膚和鼻腔中。金黃色葡萄球菌腸毒素(staphylococcal enterotoxins, SEs)是由金黃色葡萄球菌(Staphylococcus, aureus)產(chǎn)生的細(xì)菌性外毒素。依據(jù)SEs的血清型不同，可分為SEA到SEIV等23個血清型，其中SEA到SEI以及SER、SES和SET具有引起以嘔吐為主要癥狀的中毒。SEs可溶于水，具有很強的熱穩(wěn)定性，被金黃色葡萄球菌污染的食物經(jīng)過加熱處理后，即使細(xì)菌被殺死，其產(chǎn)生的SE仍然具有生物活性。同時SEs可抵抗外源性蛋白酶比如胃蛋白酶及胰蛋白酶的消化作用，一旦攝入，可引發(fā)中毒。據(jù)歐洲食品安全委員會統(tǒng)計報告，由SEs引起的食物中毒約占總發(fā)病例數(shù)的4. 1%，但由于檢驗方法缺乏較好的靈敏度，比例被嚴(yán)重低估。美國疾病預(yù)防控制中心報告，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒僅次于大腸埃希菌，居第二位，占細(xì)菌性食物中毒的33%。加拿大報告的發(fā)生率更高，占細(xì)菌性食物中毒的45%。我國每年發(fā)生此類中毒事件也非常多，全國各地均有報告，是疾病預(yù)防控制部門重點監(jiān)測的疾病之一。絕大多數(shù)的牛皮毛和粘膜中攜帶有大量的金黃色葡萄球菌，人手皮膚也常攜帶有金黃色葡萄球菌，在食品生產(chǎn)中，這些細(xì)菌可在烹調(diào)不當(dāng)?shù)氖澄镏写罅糠敝巢a(chǎn)生SEs。因此，在食品衛(wèi)生檢測中，SEs的檢出是確定食物是被金黃色葡萄球菌污染的決定因素。由于SEs分子量較小(22-kDa到29-kDa)，難以與食物蛋白相區(qū)分，檢測主要依賴于免疫學(xué)檢測方法，比如酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)。牛乳腺炎是嚴(yán)重影響乳品質(zhì)量的多發(fā)病，流行病學(xué)調(diào)查顯示，其發(fā)病率可高達56. 5%，其中金黃色葡萄球菌是牛乳腺炎主要的致病菌。據(jù)國外文獻報道，從患有隱性感染或有癥狀乳腺炎的牛乳腺分泌物中，均可檢出多種金黃色葡萄球菌腸毒素，其中以檢測到金黃色葡萄球菌腸毒素C最為常見，且濃度與牛乳腺炎嚴(yán)重程度相關(guān)。因此，對牛奶等進行金黃色葡萄球菌腸毒素C等毒素的檢測，對食品安全具有十分重要的意義，開發(fā)靈敏的檢測和定量手段，可以做為食品安全監(jiān)控的重要手段。金黃色葡萄球菌腸毒素C中毒劑量極低，僅需ng水平即可引起明顯中毒癥狀。目前，檢測金黃色葡萄球菌腸毒素C主要通過免疫學(xué)方法，有免疫瓊脂擴散法、反向間接血凝法、免疫芯片法和酶聯(lián)免疫吸附法等。免疫瓊脂擴散法和反向間接血凝法的缺點是費時、影響分析的干擾因素較多、靈敏度低，特異性差。免疫芯片法存在價格昂貴，操作人員需要經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)，影響分析的干擾因素較多，靈敏度低等不足。酶聯(lián)免疫吸附法雖然操作簡便，適合大通量檢測，但是檢測敏感性較差。鑒于此，建立一種葡萄球菌腸毒素C化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析檢測試劑盒，對于在食品中快速、特異、靈敏的檢測金黃色葡萄球菌腸毒素C具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于，提供一種葡萄球菌腸毒素C化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析檢測試劑盒，該試劑盒具備了酶聯(lián)免疫法的特異性強、重復(fù)性好便于大通量檢測的特點，同時還具有極高的靈敏度，非常適合于快速定量食品特別是牛奶中的金黃色葡萄球菌腸毒素C。為了實現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)解決方案一種葡萄球菌腸毒素C化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析檢測試劑盒，其特征在于，該試劑 盒的內(nèi)容物包括有抗金黃色葡萄球菌腸毒素C的單克隆抗體，辣根過氧化酶標(biāo)記的抗金黃色葡萄球菌腸毒素C檢測抗體溶液，金黃色葡萄球菌腸毒素C系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，包被溶液、封閉溶液、洗滌液、化學(xué)發(fā)光液，以及化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)板，其中所述化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫板的各孔包被有抗金黃色葡萄球菌腸毒素C的單克隆抗體；其中所述包被抗體濃度優(yōu)選2. 5 μ g/mL。所述辣根過氧化酶標(biāo)記的抗金黃色葡萄球菌腸毒素C檢測抗體溶液，是由辣根過氧化酶標(biāo)記的小鼠抗金黃色葡萄球菌腸毒素C單克隆抗體；使用時用封閉溶液配制成1:16000的工作濃度；所述金黃色葡萄球菌腸毒素C系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度分別是0.003125ng/mL、O. 00625ng/mL、0. 0125ng/Ml、0. 025ng/mL、0. 05ng/mL、0. Ing/mL和 0. 4ng/mL。所述包被溶液是I. 59g碳酸鈉和2. 53g碳酸氫鈉溶于IL去離子水中的混合液，pH為 9.5 ;所述封閉溶液是每升溶液中含體積分?jǐn)?shù)為O. 05的小牛血清、pH7. 5,0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液；所述洗滌溶液是含有體積分?jǐn)?shù)O. 05吐溫-20，pH7. 5,0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液；所述化學(xué)發(fā)光溶液選擇ELISA超級發(fā)光液，A液與B液體積比為I: I的混合液。在制備抗金黃色葡萄球菌腸毒素C單克隆抗體的基礎(chǔ)上，經(jīng)過配對抗體的篩選，建立化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法，用來定量檢測食品及牛奶中的金黃色葡萄球菌腸毒素C。本發(fā)明采用的定量檢測方法包括抗金黃色葡萄球菌腸毒素C的單克隆抗體的制備和配對抗體的篩選，以及化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法的建立?？菇瘘S色葡萄球菌腸毒素C單克隆抗體的制備和配對抗體的篩選方法是將金黃色葡萄球菌腸毒素C作為免疫原，采用常規(guī)雜交瘤技術(shù)得到一組抗金黃色葡萄球菌腸毒素C的單克隆抗體，將未標(biāo)記的單克隆抗體作為包被抗體，將辣根過氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體作為檢測抗體，采用陣列法兩兩配對篩選檢測金黃色葡萄球菌腸毒素C特異性強、敏感性最高的配對抗體。按照上述抗金黃色葡萄球菌腸毒素C包被抗體溶液濃度和檢測抗體溶液濃度制備的試劑盒可以達到很好的線性范圍，檢測金黃色葡萄球菌腸毒素C標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍可以達至Ij O. 003125ng/mL O. 4ng/mL，靈敏度達到 O. 003125ng/mL。
本發(fā)明的葡萄球菌腸毒素C化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析檢測試劑盒，具有特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好的特點。與傳統(tǒng)的ELISA法比較，靈敏度可以提髙8-10倍?？稍诃h(huán)境、食品和體液中金黃色葡萄球菌腸毒素C含量檢測中發(fā)揮重要作用。


圖I為魯米諾化學(xué)發(fā)光體系作用機理圖。圖中，(A)是魯米諾在過氧化物酶、氫氧化鈉和雙氧水的作用下，發(fā)生氧化還原反應(yīng)，由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定再回到基態(tài)時釋放能量發(fā)射光的過程。(B)是玻璃纖維管將化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中產(chǎn)生的光收集起來，傳遞給光電倍增管(photomultiplier，PMT), PMT將光信號轉(zhuǎn)化為模擬信號，經(jīng)甄別電路轉(zhuǎn)化成數(shù)字信號傳遞給計算機分析系統(tǒng)的過程。圖2為球菌腸毒素A化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析檢測試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖中，金黃色葡萄球菌腸毒素 A 系列稀釋濃度為 0ng/mL、0. 003125ng/mL、0. 00625ng/mL、0. 0125ng/mL、0. 025ng/mL、0. 05ng/mL、0. Ing/mL 和 0. 4ng/mL 時，獲得線性回歸方程為 Y=3199. 1X+42. 998(其中Y為相對發(fā)光單位，X代表金黃色葡萄球菌腸毒素A濃度)。R2=O. 9965，表明線性關(guān)系良好。以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的詳細(xì)說明。
具體實施例方式申請人:在制備抗金黃色葡萄球菌腸毒素C單克隆抗體的基礎(chǔ)上，經(jīng)過配對抗體的篩選和建立雙抗體夾心化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法，制備了一種葡萄球菌腸毒素C化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析檢測試劑盒，來定量檢測金黃色葡萄球菌腸毒素C。葡萄球菌腸毒素C化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析檢測試劑盒的內(nèi)容物包括有抗金黃色葡萄球菌腸毒素C的單克隆抗體，辣根過氧化酶標(biāo)記的抗金黃色葡萄球菌腸毒素C檢測抗體溶液，金黃色葡萄球菌腸毒素C系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，包被溶液、封閉溶液、洗滌液、化學(xué)發(fā)光液，以及化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)板。上述試劑盒涉及的金黃色葡萄球菌腸毒素C標(biāo)準(zhǔn)溶液，辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗金黃色葡萄球菌腸毒素C檢測抗體溶液，抗金黃色葡萄球菌腸毒素C包被抗體溶液，化學(xué)發(fā)光溶液和洗滌液及其配方，對檢測的靈敏度影響很大。其中各溶液的主要成分及其配制方法是:I、金黃色葡萄球菌腸毒素C標(biāo)準(zhǔn)品溶液金黃色葡萄球菌腸毒素C標(biāo)準(zhǔn)品溶液為以常規(guī)方法配制濃度分別為 O. 003125ng/mL、0. 00625ng/mL、0. 0125ng/ML、0. 025ng/mL、
0.05ng/mL、0. Ing/mL和0. 4ng/mL的金黃色葡萄球菌腸毒素C標(biāo)準(zhǔn)品溶液。2、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗金黃色葡萄球菌腸毒素C檢測抗體溶液抗金黃色葡萄球菌腸毒素C檢測抗體溶液為辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗金黃色葡萄球菌腸毒素C單克隆抗體原液，使用時用封閉溶液配制成I :16000的工作濃度。3、包被溶液1. 59g碳酸鈉和2. 53g碳酸氫鈉溶于IL去離子水中的混合液，pH為
9.5。4、抗金黃色葡萄球菌腸毒素C包被抗體溶液抗金黃色葡萄球菌腸毒素C包被抗體用封閉溶液稀釋成I :1000的工作濃度，即2. 5 μ g/mL·
5、封閉溶液是每升溶液中含體積分?jǐn)?shù)為O. 05的新生牛血清pH 7. 50. lmol/L的磷酸鹽緩沖液。6、洗滌溶液指含有體積分?jǐn)?shù)O. 0005吐溫-20的pH7. 5,0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液。7、化學(xué)發(fā)光溶液選擇Pierce公司生產(chǎn)的ELISA超級發(fā)光液，其中A液與B液體積比為1:1的混合液。其中，化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)板選擇乳白色不透明聚苯乙烯96孔化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫板，化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫板的包被是將抗金黃色葡萄球菌腸毒素C包被抗體置于設(shè)定的包被溶液中，加入到96孔化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)板，以設(shè)定的濃度在4°C中包被過夜。化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)板所包被的抗金黃色葡萄球菌腸毒素C包被抗體在堿性環(huán)境下可以很好的結(jié)合在檢測板塑料表面上，可以經(jīng)受多次洗滌，采用的包被抗體濃度為2. 5yg/
mLo包被好的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)板用封閉溶液封閉?？菇瘘S色葡萄球菌腸毒素C包被抗體溶液和檢測抗體溶液的制備抗金黃色葡萄球菌腸毒素C包被抗體溶液和檢測抗體溶液的濃度是決定化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析試劑盒測定金黃色葡萄球菌腸毒素C范圍及靈敏度的重要因素。本實施例中，抗金黃色葡萄球菌腸毒素C包被抗體溶液可以用封閉液稀釋成I :1000的工作濃度?？菇瘘S色葡萄球菌腸毒素C檢測抗體溶液優(yōu)選用封閉液配制的濃度為I :16000?？菇瘘S色葡萄球菌腸毒素C單克隆抗體的制備方法是將純化的金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的金黃色葡萄球菌腸毒素C作為免疫原，采用常規(guī)雜交瘤技術(shù)得到一組抗金黃色葡萄球菌腸毒素C的單克隆抗體。配對抗體的篩選方法是將得到的一組單克隆抗體逐一常規(guī)標(biāo)記辣根過氧化物酶，分別將未標(biāo)記的單克隆抗體作為包被抗體，將辣根過氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體作為檢測抗體，采用陣列法兩兩配對挑選最佳的配對抗體，建立雙抗體夾心化學(xué)發(fā)光酶免疫分析的方法。最佳的配對抗體的挑選方法是選擇敏感性最高，即檢測相同濃度的金黃色葡萄球菌腸毒素C的光吸收值最高，且特異性高，即檢測無關(guān)蛋白的光吸收值最低，(即非特異本底最低)的配對抗體?；瘜W(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析試驗的方法是，在化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)板96孔中，加入2. 5μ g/mL包被抗體，4°C孵育過夜后用含4%新生牛血清的緩沖液封閉，洗滌后加入經(jīng)系列稀釋的金黃色葡萄球菌腸毒素C標(biāo)準(zhǔn)品，孵育及洗滌后加入檢測抗體，再次孵育及洗滌后加入化學(xué)發(fā)光底物液，用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定每孔的發(fā)光強度，以金黃色葡萄球菌腸毒素C標(biāo)準(zhǔn)品的光吸收值為縱坐標(biāo)，相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測標(biāo)本的光吸收值，經(jīng)曲線擬合或換算，得出檢測樣本中金黃色葡萄球菌腸毒素C的濃度。以下是發(fā)明人給出的實施例實施例I :金黃色葡萄球菌腸毒素C單克隆抗體的制備與包被抗體和檢測抗體配對的篩選(I)抗金黃色葡萄球菌腸毒素C單克隆抗體的制備純化的天然金黃色葡萄球菌腸毒素C抗原標(biāo)準(zhǔn)品由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所提供。采用8周齡BALB/c小鼠作為免疫動物，以金黃色葡萄球菌腸毒素C為免疫原，首次免疫劑量為50 μ g/mL，將免疫原溶于生理鹽水和等體積福氏完全佐劑制成乳化劑，皮下多點注射。間隔3周后進行第二次免疫，劑量和途徑同第一次免疫，佐劑為福氏不完全佐劑。廣3周后進行第三次免疫，劑量同上，不加佐劑，腹腔免疫，腹腔注射7 10天后尾靜脈采血測其效價，如小鼠血清效價達到要求加強免疫一次，劑量同上，不加佐劑。加強免疫3天后取脾制備成單個細(xì)胞懸液，采用常規(guī)雜交瘤技術(shù)與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)篩選及克隆化，共得到26株抗金黃色葡萄球菌腸毒素C的單克隆抗體，分別命名為FMU-SECl FMU-SEC26。(2)用于雙抗體夾心ELISA單克隆抗體的配對篩選將得到的一組抗金黃色葡萄球菌腸毒素C單克隆抗體，逐一常規(guī)標(biāo)記辣根過氧化物酶，分別將該組中未標(biāo)記的單克隆抗體作為包被抗體，用包被緩沖液稀釋至2. 5 μ g/mL，將辣根過氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體作為檢測抗體，采用雙抗體夾心ELISA兩兩配對方陣法確定最佳抗體配對。最佳配對抗體的挑選方法是選擇敏感性最高，即檢測相同濃度的金黃色葡萄球菌腸毒素C的光吸收值最高，且特異性強(即檢測無檢測抗原或無關(guān)抗原的光吸收值最低，也即非特異本底最低)的配對抗體。具體步驟為
A. 96孔酶聯(lián)板分別包被26株金黃色葡萄球菌腸毒素C單克隆抗體，4°C孵育過夜。B.洗滌液充分洗板3次，分別加入用封閉溶液稀釋的金黃色葡萄球菌腸毒素C標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為濃度為O. 01ng/mL，只加封閉溶液的孔設(shè)為空白對照孔，37°C孵育lh。C.洗滌液充分洗板3次，按照方陣法排列分別加入26株辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體，100 μ I/孔，形成26X26方陣，37°C孵育lh。D.洗滌液充分洗板后，加入2,2’ -連氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-磺酸)底物顯色液，100 μ I/孔，37°C孵育15min，用酶標(biāo)儀檢測405nm下的吸光度(OD)值。經(jīng)過抗體的配對篩選后，將FMU-SEC4單克隆抗體作為包被抗體，F(xiàn)MU-SEC8單克隆抗體作為檢測抗體。實施例2 :化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫方法的建立( I)最佳包被抗體濃度的選擇包被抗體按I. 25 μ g/mL、2. 5 μ g/mL、5 μ g/mL、10 μ g/mL>20 μ g/mL 和 40 μ g/mL 的系列稀釋度包被化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)板，100 μ L/孔，4°C孵育過夜，用洗滌液洗板3次；250μ L/孔封閉溶液封閉，室溫放置I小時，洗板3次；加入O. Olng/mL的金黃色葡萄球菌腸毒素C標(biāo)準(zhǔn)抗原，100 μ L/孔，同時每種包被抗體濃度均做空白對照孔，37°C孵育I小時，洗板3次；分別加入I :16000稀釋的抗金黃色葡萄球菌腸毒素C檢測抗體，37°C孵育I小時，洗板5次；加入100 μ L/孔的化學(xué)發(fā)光液，測定發(fā)光值。根據(jù)測定的不同包被抗體濃度與相應(yīng)空白孔的發(fā)光值比值的大小篩選出最佳包被抗體的濃度為2. 5 μ g/mL。(2)檢測抗體濃度的確定包被抗體按2. 5 μ g/mL濃度包被化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板，100 μ L/孔，4°C孵育過夜，用洗滌溶液洗板3次；250 μ L/孔封閉溶液封閉，室溫放置I小時,洗板3次；加入O. Olng/mL的金黃色葡萄球菌腸毒素C標(biāo)準(zhǔn)品，100 μ L/孔，37°C孵育I小時，洗板3次，每次拍干；分別加入倍比稀釋的抗金黃色葡萄球菌腸毒素C酶標(biāo)抗體1:500-1:64000于各反應(yīng)孔中，100 μ L/孔，同時每種酶標(biāo)抗體濃度均做空白對照孔，37°C孵育I小時，洗滌。加入ΙΟΟμ L/孔的化學(xué)發(fā)光液，測定發(fā)光值。根據(jù)測定的不同酶標(biāo)抗體濃度與相應(yīng)空白孔的發(fā)光值比值的大小篩選出最佳酶標(biāo)抗體的濃度為1:16000。(3)檢測下限的確定根據(jù)對包被抗體及檢測抗體最佳濃度的篩選，申請人選擇并確定包被抗體濃度為
2.5 μ g/mL,抗金黃色葡萄球菌腸毒素C檢測抗體濃度為I : 16000,確定化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫檢測方法的檢測下限A.包被用O. 05M pH9. 5碳酸鹽包被溶液將包被抗體配成2. 5 μ g/mL的溶液，化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)板每孔中加100 μ L，4°C過夜。次日棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌液洗3次，300 μ L/孔，每次5分鐘，拍干。(此步驟簡稱洗滌，下同)。B.封閉用封閉溶液封閉上述已包被的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)板,250 μ L/孔,室溫孵育I小時，洗滌。 C.加樣加入倍比稀釋的金黃色葡萄球菌腸毒素C標(biāo)準(zhǔn)品于上述已封閉的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)板中，100 μ L/孔，37°C孵育I小時，洗滌。D.加檢測抗體分別加1:16000稀釋的檢測抗體于化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)板中，IOOyL/孔，37°C孵育I小時，洗滌。E.發(fā)光化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)板中加入發(fā)光溶液100 μ L/孔，反應(yīng)5min后用酶標(biāo)儀檢測
發(fā)光值。實施例3 :檢測葡萄球菌腸毒素C化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析檢測試劑盒在不同基質(zhì)中的應(yīng)用該實施例用來評價本發(fā)明的葡萄球菌腸毒素C化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析檢測試劑盒在不同基質(zhì)中檢測金黃色葡萄球菌腸毒素C的準(zhǔn)確性和實用性。將金黃色葡萄球菌腸毒素C標(biāo)準(zhǔn)品分別用環(huán)境基質(zhì)河水、食品基質(zhì)牛奶、體液基質(zhì)人血清或人尿液稀釋成不同濃度，用化學(xué)發(fā)光酶免疫法檢測金黃色葡萄球菌腸毒素C含量，計算所測量濃度與實際加入濃度的比值，即回收率。( I)用包被抗體預(yù)包被化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)板用包被溶液將包被抗體稀釋成2. 5 μ g/mL加入化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)板，100 μ L/孔，4°C過夜，棄掉包被液，每孔加入250 μ L洗滌液，洗滌3次，加入封閉液250 μ L/孔，37°C孵育lh，傾去孔內(nèi)液體，洗滌液洗滌3次，用錫箔紙真空密封4 °C保存?zhèn)溆谩?2)樣品預(yù)處理A.河水將河水樣品在4°C、10000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心15分鐘，棄去沉淀。B.牛奶將購買的純牛奶樣品在4°C、10000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心15分鐘，去掉脂肪層。C.尿樣；將收集的尿液樣品在4°C、10000轉(zhuǎn)/分鐘條件下離心15分鐘，去掉沉淀。D.血清將收集的血液樣品在4°C靜置過夜，30000轉(zhuǎn)/分鐘，離心15分鐘，取血清。E.分別用上述液體將金黃色葡萄球菌腸毒素C標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成高(2. Ong/ml)、中(O. 8ng/ml)、低(O. 2ng/ml) 3個濃度,分別摻入到相應(yīng)基質(zhì)中，在最佳包被抗體和檢測抗體優(yōu)化條件下，用化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法測定10次回收率，計算平均回收率。回收率計算方法為
回收率=(測定濃度/實際濃度)X 100%。(3)檢測步驟A.加樣向預(yù)先包被有包被抗體的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)板中加金黃色葡萄球菌腸毒素C標(biāo)準(zhǔn)品溶液或樣品溶液，100 μ L/孔，37°C孵育I小時。B.洗滌傾出孔中液體，每孔加入洗滌溶液250 μ L，洗滌3次。C.加檢測抗體加入抗金黃色葡萄球菌腸毒素C檢測抗體溶液，100 μ L/孔，370C孵育I小時。D.洗滌傾出孔中液體，每孔加入洗滌溶液250 μ L，洗滌3次。Ε.加發(fā)光溶液加入發(fā)光溶液，100 μ L/孔。 F.檢測用化學(xué)發(fā)光免疫分析儀測定每孔的發(fā)光強度。(4)結(jié)果判斷用所獲得的標(biāo)準(zhǔn)品發(fā)光值作出工作曲線和方程式，根據(jù)樣品的發(fā)光值計算出基質(zhì)中的金黃色葡萄球菌腸毒素C濃度，依據(jù)公式計算回收率。結(jié)果見下表
權(quán)利要求
1.一種葡萄球菌腸毒素C化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒的內(nèi)容物包括 1)化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)板，該化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)板的各孔包被有抗金黃色葡萄球菌腸毒素C的單克隆抗體； 2)辣根過氧化酶標(biāo)記的抗金黃色葡萄球菌腸毒素C檢測抗體溶液，是由辣根過氧化酶標(biāo)記的小鼠抗金黃色葡萄球菌腸毒素C單克隆抗體；使用時用封閉溶液配制成1:16000的工作濃度； 3)金黃色葡萄球菌腸毒素C系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，該金黃色葡萄球菌腸毒素C系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度分別為 3. 125pg/mL、6. 25pg/mL、12. 5pg/mL、25pg/mL、50pg/mL、100pg/mL、200pg/mL和 400pg/mL ； 4)包被溶液、封閉溶液、洗滌液和化學(xué)發(fā)光液；其中 所述包被溶液是I. 59g碳酸鈉和2. 53g碳酸氫鈉溶于IL去離子水中的混合液，pH為9. 5 ； 所述封閉溶液是每升溶液中含體積分?jǐn)?shù)為O. 05的小牛血清、pH 7. 50. lmol/L的磷酸鹽緩沖液； 所述洗滌溶液是含有體積分?jǐn)?shù)O. 05吐溫-20，pH 7. 5,0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液； 所述化學(xué)發(fā)光溶液選擇Pierce公司生產(chǎn)的ELISA超級發(fā)光液，A液與B液體積比為I: I的混合液。
2.如權(quán)利要求I所述的葡萄球菌腸毒素C化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析檢測試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)板為乳白色不透明聚苯乙烯96孔板。
3.如權(quán)利要求I所述的葡萄球菌腸毒素C化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析檢測試劑盒，其特征在于，所述化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫板的各孔包被的抗金黃色葡萄球菌腸毒素C的單克隆抗體的濃度為2. 5 μ g/mL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種葡萄球菌腸毒素C化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析檢測試劑盒，該試劑盒的內(nèi)容物包括有抗金黃色葡萄球菌腸毒素C的單克隆抗體，辣根過氧化酶標(biāo)記的抗金黃色葡萄球菌腸毒素C檢測抗體溶液，金黃色葡萄球菌腸毒素C系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，包被溶液、封閉溶液、洗滌液、化學(xué)發(fā)光液，以及化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)板，具有特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好的特點，適合于疾病監(jiān)控及快速定量檢測食品及血液中金黃色葡萄球菌腸毒素C。
文檔編號G01N33/577GK102944678SQ20121045826
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月14日
發(fā)明者李琦, 劉志佳, 黃業(yè)青, 楊琨, 張春梅, 宋朝君, 李永明, 徐竹蔚, 劉飛, 陳麗華, 張赟, 方亮, 孫元杰, 易靜, 周幸春, 馬櫻, 劉蓓, 張宇絲, 劉蓉蓉, 金伯泉 申請人:中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)