專利名稱：非標(biāo)記熒光pcr結(jié)合hrma檢測副溶血弧菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種非標(biāo)記熒光PCR結(jié)合高分辨率熔解曲線(HRM)分析檢測副溶血弧菌的方法，屬于微生物檢測領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
副溶血弧菌(Bibrio Parahemolyticus),是一種嗜鹽性細(xì)菌,系弧菌科弧菌屬，革蘭染色陰性，為多形態(tài)桿菌或稍彎曲弧菌。進(jìn)食含有該菌的食物致可食物中毒，也稱嗜鹽菌食物中毒，主要來自海產(chǎn)品。臨床上以急性起病、腹痛、嘔吐、腹瀉及水樣便為主要癥狀。副溶血性弧菌是一種海洋細(xì)菌，主要來源于魚、蝦、蟹、貝類和海藻等海產(chǎn)品。本病多在夏秋季發(fā)生于沿海地區(qū)，常造成集體發(fā)病。近年來由于海鮮空運(yùn)，內(nèi)地城市病例也漸增多。熒光PCR檢測技術(shù)大致分為兩大類:熒光探針法(標(biāo)記熒光PCR)和通用型的熒光染料法(非標(biāo)記熒光PCR)。前者則利用熒光標(biāo)記的特異性探針或者引物來識(shí)別模版，優(yōu)點(diǎn)是特異性更高，適用于擴(kuò)增序列專一檢測，不過檢測成本要高很多。而后者主要是利用熒光染料與雙鏈DNA分子結(jié)合發(fā)光的特性來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，其優(yōu)點(diǎn)是:無需另外設(shè)計(jì)熒光探針，簡便易行，成本較低。其中，熒光染料又分為非飽和染料(如Sybr Green)和飽和染料(如 LC Green 等)。相對Sybr Green等非飽和染料來說，Eva Green、LC Green、SYT09等飽和染料具有以下優(yōu)點(diǎn):①飽和的染料對PCR反應(yīng)沒有任何抑制作用，因此可以在PCR反應(yīng)之前加入，而其它非飽和熒光染料若較多加入到反應(yīng)液中會(huì)抑制PCR反應(yīng)，因此只能限量加入，從而對熒光PCR反應(yīng)的指示收到限制。② DNA高溫變性時(shí)，非飽和熒光染料加入則會(huì)造成DNA雙鏈高溫變性時(shí)，單鏈部分的熒光染料分子發(fā)生遷移，熒光染料分子重新結(jié)合到雙鏈DNA的空置位點(diǎn)，造成熒光信號沒有變化，因此出現(xiàn)假陰性，特異性下降，而飽和染料則不會(huì)出現(xiàn)此類情況。③高溫穩(wěn)定，對于高GC含量的PCR產(chǎn)物，Tm值較高，在DNA雙鏈高溫熔解時(shí)，飽和突光染料結(jié)合核酸更穩(wěn)定。高分辨熔解曲線分析(high-resolution melt analysis, HRMA)技術(shù)是近幾年來在國外興起的一種用于物種鑒定的最新遺傳學(xué)分析方法。它是一種高效穩(wěn)健的PCR技術(shù)，不受突變堿基位點(diǎn)與類型局限，無需序列特異性探針，在PCR結(jié)束后直接運(yùn)行高分辨熔解曲線分析，即可完成對物種鑒定、基因分型等的分析。因操作簡便快速，使用成本低，結(jié)果準(zhǔn)確，實(shí)現(xiàn)了真正的閉管操作。HRMA利用了特定的染料可以插入DNA雙鏈中的特性，通過實(shí)時(shí)監(jiān)測升溫過程中雙鏈DNA熒光染料與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)合情況記錄熔解曲線，從而對樣品進(jìn)行檢測。雖然帶HRM模塊的熒光PCR儀與普通熒光PCR儀購買價(jià)格相差不大，但其溫度均一性要高很多。如普通定量PCR儀溫度均一性±0.25 °C，溫度分辨率為0.1 °C，而Rotor-Gene 6000溫度均一性為±0.01° C，溫度分辨率為0.02° C。其極高的溫度均一性和溫度分辨率使分辨精度可以達(dá)到對單個(gè)堿基差異的區(qū)分，加上飽和性染料(LC Green、Eva Green等)的出現(xiàn),使得HRM這一技術(shù)的普及使用成為可能。
目前，副溶血弧菌的檢測方法主要有傳統(tǒng)的培養(yǎng)后分離鑒定方法和分子檢測方法。其中傳統(tǒng)的副溶血弧菌分離檢測方法，依賴于生化和形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，國際上通常以美國FDA頒布的“細(xì)菌學(xué)分析手冊”作為經(jīng)典方法。我國也參照制定頒布了副溶血弧菌檢驗(yàn)國家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T4789.7-2008)，規(guī)范了副溶血弧菌傳統(tǒng)培養(yǎng)檢測方法和分子檢測方法。但傳統(tǒng)的檢測方法存在操作繁瑣、耗時(shí)長、易漏檢等缺點(diǎn)。分子檢測方法中，包括了常規(guī)PCR方法，但是常規(guī)PCR需要擴(kuò)增后進(jìn)行電泳，操作復(fù)雜而且極易引起污染。而探針法PCR則存在檢測成本很高，試劑保存期短等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種操作簡便、快速，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，使用成本低的非標(biāo)記熒光PCR結(jié)合HRMA檢測副溶血弧菌的方法。為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下方案:一種非標(biāo)記熒光PCR結(jié)合HRMA檢測副溶血弧菌的方法，其特征在于包括以下步驟:A、根據(jù)副溶血弧菌TLH基因設(shè)計(jì)引物對；B、提取樣本DNA后，利用設(shè)計(jì)的引物對進(jìn)行非標(biāo)記熒光PCR擴(kuò)增；C、應(yīng)用軟件對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增曲線和HRMA分析。進(jìn)一步地，本發(fā)明按以下反應(yīng)步驟進(jìn)行:(I)采用PRMER等軟件，根據(jù)GeneBank發(fā)布的序列，針對副溶血弧菌TLH基因設(shè)計(jì)的引物對， 設(shè)計(jì)非標(biāo)記熒光PCR擴(kuò)增副溶血弧菌上游引物序列為:5 ‘-GGTGAAGGAITTAACCGTGAACTT-3’序列，其下游引物為:5 ‘-GCGCCTCGTTATCATCCAAAT-3’。(2)標(biāo)準(zhǔn)品模板的制備以常規(guī)PCR方法擴(kuò)增副溶血弧菌TLH基因。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳分析，采用PCR產(chǎn)物回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，將純化后的PCR產(chǎn)物與載體pMD18-T連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，篩選得到單菌落，挑選單菌落至含抗生素的液體培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，以提取的重組質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行PCR鑒定，并對重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定。提取驗(yàn)證正確的陽性重組質(zhì)粒，并測定其濃度，將其10倍倍比稀釋。(3)非標(biāo)記熒光PCR擴(kuò)增和HRM分析提取副溶血弧菌樣本DNA后，利用設(shè)計(jì)的引物對進(jìn)行非標(biāo)記熒光PCR擴(kuò)增；應(yīng)用帶HRMA模塊的熒光定量PCR儀(包括Corbett Rotor公司的Gene 6000、Roche公司LightCycler 480等)對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析，確定擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值和基因型。在所述突光定量PCR反應(yīng)中所采用的反應(yīng)液,包含下列成分:
PCR 反應(yīng)液(IOX)2 UL
dNTPs混合液(各2.5禮) 1.5 2.5 μ L

權(quán)利要求
1.一種非標(biāo)記熒光PCR結(jié)合HRMA檢測副溶血弧菌的方法，其特征在于包括以下步驟: A、根據(jù)副溶血弧菌不耐熱溶血毒素基因設(shè)計(jì)引物對； B、提取樣本DNA后，利用設(shè)計(jì)的引物對進(jìn)行非標(biāo)記熒光PCR擴(kuò)增； C、應(yīng)用帶HRM模塊的熒光PCR儀軟件對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高分辨率熔解曲線分析，確定擴(kuò)增產(chǎn)物的Tm值熔解曲線圖譜。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述非標(biāo)記熒光PCR結(jié)合HRMA檢測副溶血弧菌的方法，其特征在于所述引物對的上游引物序列為:5 ‘-AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG-3’，所述引物對的下游引物序列為:5 ‘-TGTGCCTTGATGAACTCGTTC-3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述非標(biāo)記熒光PCR結(jié)合HRMA檢測副溶血弧菌的方法，其特征在于步驟B中所述非標(biāo)記熒光PCR擴(kuò)增過程是在反應(yīng)液中進(jìn)行的，其中制備20 μ L的反應(yīng)液由以下組分組成:PCR 反應(yīng)液(IOX)2 PL(INTPs 混合液(各 2.SmM) 1.5 2.5 μ ITaq 聚合酶(511/μ L)O i O 6 uL上游引物(ΙΟμΜ)0.5 1.0 PL下游引物(ΙΟμΜ)0.5 1.0 μ LDNA模版I μ L熒光染料(20 X)I uL水補(bǔ)齊至A PL 。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述非標(biāo)記熒光PCR結(jié)合HRMA檢測副溶血弧菌的方法，其特征在于所述的熒光染料為DNA飽和性染料。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述非標(biāo)記熒光PCR結(jié)合HRMA檢測副溶血弧菌的方法，其特征在于所述的DNA飽和性染料為Eva Green染料、LC Green PLUS染料、SYTO 9染料中的一種或兩種以上的混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述非標(biāo)記熒光PCR結(jié)合HRMA檢測副溶血弧菌的方法，其特征在于所述 dNTP 混合液由 IOmM dATPUOmM dCTPUOmM dTTPUOmM dGTP 組成的混合液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述非標(biāo)記熒光PCR結(jié)合HRMA檢測副溶血弧菌的方法，其特征在于步驟B中非標(biāo)記熒光PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增反應(yīng)按以下步驟進(jìn)行: (1)921: 961:預(yù)變性308； (2)92°C 96°C變性 10 30s, 55-63°C退火 10 30s, 72°C 10 30s,共進(jìn)行 40 50個(gè)循環(huán)； (3)72°C延伸 10 30s。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述非標(biāo)記熒光PCR結(jié)合HRMA檢測副溶血弧菌的方法，其特征在于步驟C中對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物高分辨率熔解曲線分析，按以下步驟進(jìn)行:(1)92°C 96°C變性 Imin ； (2)40°C復(fù)性Imin ； (3)然后初始熔解溫度60 65°C，開始程序升溫熔解至95°C，并在熔解過程中實(shí)時(shí)檢測突光信號， 15 25次/秒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種非標(biāo)記熒光PCR結(jié)合HRMA檢測副溶血弧菌的方法，其特征在于包括以下步驟根據(jù)副溶血弧菌TLH基因設(shè)計(jì)引物對；提取樣本DNA后，利用設(shè)計(jì)的引物對進(jìn)行非標(biāo)記熒光PCR擴(kuò)增；應(yīng)用軟件對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增曲線和HRMA分析。本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，提供一種操作簡便、快速，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，使用成本低的非標(biāo)記熒光PCR結(jié)合HRMA檢測副溶血弧菌的方法。
文檔編號G01N21/64GK103184279SQ20121037679
公開日2013年7月3日 申請日期2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者蔡先全, 邱德義, 柏建山, 鄧艷, 伍朝暉, 簡志華, 張憲臣, 蔡仁杰 申請人:中山出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心