專利名稱：一種人體液真菌(1,3)-β-D葡聚糖檢測試劑盒及其應用方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種人體液真菌(1，3) -β -D葡聚糖檢測試劑盒及其應用方法。
背景技術：
近年來，臨床上侵襲性真菌感染(invasive fungal infections, IFI)的患病率明顯上升。IFI也日益成為導致骨髓及器官移植受者、接受化療的惡性血液病和惡性腫瘤患者、AIDS以及其他危重病患者的嚴重并發(fā)癥及重要死亡原因之一。對深部真菌感染治療成敗的關鍵在于早期診斷，當真菌進入人體血液或深部組織后，經(jīng)吞噬細胞的吞噬、消化代謝后，(1，3)- β -D葡聚糖可從胞壁中釋放出來，從而使血液或其它體液中的β -D葡聚糖含量增高，它在體液中的存在可以很大程度上視為IFI (深部真菌感染)的標志。臨床常用的檢 測方法是微生物鑒別基質培養(yǎng)法，這種方法培養(yǎng)陽性率低，易誤診，且耗時長(3-7天)，不能為臨床及時提供診療依據(jù)。專利號為4970152 的美國專利〈reagents for determing peptidoglycanand^ -I, 3-glucan> (《肽聚糖和β _1，3-葡聚糖的診斷試劑》)中，提出了一種通過使用組合物，測定肽聚糖或β_1，3-葡聚糖的方法，所述組合物包含蠶幼蟲血漿的部分，其能夠與β_1，3-葡聚糖或者肽聚糖特異性反應，但不與內(nèi)毒素反應。在該專利中，能夠與β_1，3-葡聚糖特異性反應的組合物通過用親和色譜除去與肽聚糖反應的物質而獲得。該方法的反應組合物，是從蠶幼蟲抽取血漿為原料，產(chǎn)品生產(chǎn)要實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，存在較大局限性。公告日為2005年6月15日、公告號為CN1206365C的中國發(fā)明專利《用于檢測(1，3) - β -D-葡聚糖的組合物，其制備方法和檢測(1，3) - β D-葡聚糖你試劑盒的》提出了一種用于檢測(1，3) - β D-葡聚糖的組合物，利用能夠螯合鈣離子的螯合劑或緩沖液從步行蟲科或金龜子科昆蟲的血漿細胞中粗提取組合物，再用鈣離子、葡聚糖或乙烯基的樹脂色譜柱從粗提取組合物中分離獲得在鈣離子存在下通過(1，3) -β -D-葡聚糖顯示酚氧化酶活性的部分。該方法從昆蟲血漿中提取所需原料，量少且來源有限，難以產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)；其通過柱色譜法分離有效成分，容易受微生物污染，因這種生物試劑不能高溫消毒或滅菌，其產(chǎn)品標準可控性差。該方法，是利用酚氧化酶的活性來定量計算β_1，3-葡聚糖，因脂多糖、肽聚糖等物質也可以激活酚氧化酶，其特異性不強，影響測定結果。公布日為2012年I月4日，公布號為102305787的中國發(fā)明專利申請《真菌(1-3)_β -D葡聚糖比色檢測試劑盒的制備及其使用方法》公開了一種通過利用(1-3)-β -D葡聚糖來激活鱟血G因子，進一步水解顯色基質后，通過分光光度計進行吸光度檢測來達到檢測(l-3)-i3_D葡聚糖的目的。該方法的問題在于所需配置顯色試劑較多，操作繁瑣，且中間過程中容易有外界細菌污染介入，影響檢測結果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是要提供一種可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的，準確、快速、特異性高的人體液真菌(I, 3) - β -D匍聚糖檢測試劑盒及其應用方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案一種人體液真菌(1，3) _β -D-葡聚糖檢測試劑盒，其特征在于包括反應主劑、體液處理劑、堿性稀釋液、酸性稀釋液、無菌水、凍干血清和(1，3)-β -D-葡聚糖質控品，所述反應主劑含有東方鱟血細胞G因子、凝固酶凝固酶原和促活劑。進一步的，所述反應主劑通過包括以下步驟的方法制備(1)將活體鱟用酒精消毒心門采血加抗凝劑后離心收集鱟血細胞，所述抗凝劑與鱟血的體積比為I :6 I :10 ;
(2)加裂解液裂解所收集的鱟血細胞，獲得鱟血細胞溶解物；(3)分離細胞壁，用有機溶媒氯仿(CHCl3)提取鱟血細胞溶解物，按體積比加入1:0. 8 I: I. 2的氯仿和聚乙二醇8000，使每毫升含聚乙二醇I. 5 3mg,隨即混合45 60分鐘，然后1500r/min-3000r/min離心30 40分鐘，制得反應主劑G因子、凝固酶、凝固酶原活性成分；(4)加入促活劑，按鱟血細 胞提取物體積與促活劑體積比為1:0. 3 1:0. 5的比例加入，攪拌均勻，得到反應主劑半成品，所述促活劑是在純化水中加入KCl、MgSO4溶液或者KCl、CaCl2溶液，使得每毫升促活劑含KCl O. 15 O. 30M,含MgSO4O. 15 O. 30M或含CaCl2O. 20 O. 40M,過濾分裝，用流通蒸汽消毒30 40分鐘即可；(5)將配制的反應主劑半成品攪拌均勻-45°C _55°C真空冷凍干燥后20 25°C封口，制得反應主劑成品。進一步的，體液處理劑含有氯化鈉、緩血酸銨和稀鹽酸，所述體液處理劑的PH值在5. 5 7. 5之間。氯化鈉濃度為8. 5mg/ml 15mg/ml,含緩血酸銨濃度為O. 25mg/ml lmg/ml，混合均勻后，過濾分裝，用流通蒸汽消毒30 40分鐘即可。進一步的，堿性稀釋液的PH值在10. 5 13. 5之間。按處方用量分別稱取緩血酸銨化學試劑，置投料容器內(nèi)，添加水至配制量，使得每毫升溶液含緩血酸銨O. 5-1. Omg，混合均勻后，用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH值為10. 5 13. 5，過濾分裝，用流通蒸汽消毒30 40分鐘即可。進一步的，酸性稀釋液的PH值在2. O 4. O之間。按處方用量，用稀鹽酸或冰醋酸溶液將新鮮蒸餾水的PH值調(diào)為2. O 4. 0，混合均勻后，過濾分裝，用流通蒸汽消毒30 40分鐘即可。進一步的，無菌水為注射用水的重蒸餾水。不含有細菌內(nèi)毒素或(1，3)-β-D-葡聚糖。進一步的，凍干血清為人血白蛋白或小牛血清。一種人體液真菌(1，3) -β -D-葡聚糖檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于東方鱟血細胞中G因子被待檢測樣本中的(1，3)-β-D-葡聚糖激活，形成凝固蛋白膠，(I, 3)-β-D-葡聚糖的含量越高，則形成凝固蛋白膠反應時間越短，通過采集在不同時間的透光率,進行回歸分析(Lgt=a+bIgc )實現(xiàn)對待檢測樣本中(I，3 ) - β -D-葡聚糖含量的檢測，具體實現(xiàn)步驟包括標準曲線制作、體液(1，3) - β -D-葡聚糖的提取純化、樣本陽性液的制備、上機檢測。進一步的，在血液基質中，(1，3)-β-D-葡聚糖的線性檢測范圍為10pg/ml 640pg/mlο進一步的，人體液外加(1，3)-β D-葡聚糖標準溶液的檢測回收率為80% 140%。一種人體液真菌(1，3 )_ β -D-葡聚糖檢測試劑盒，其特征在于主要用于人血液或其它體液中真菌(1，3) - β -D-葡聚糖含量的測定。
通過本人體液真菌(1，3) - β -D-葡聚糖檢測試劑盒建立的標準曲線的線性系數(shù)r ^ O. 99 ;在血液基質中線性檢測范圍達10pg/ml 640pg/ml ;可實現(xiàn)對(1，3) - β -D-葡聚糖的定性、定量檢測；通過在體液樣本外加細菌內(nèi)毒素標準溶液和(1，3)-β-D-葡聚糖標準溶液進行檢測回收率試驗，內(nèi)毒素回收率< 5%，證明整個檢測試驗過程，內(nèi)毒素對本廣品檢測(1，3) - β -D-匍聚糖沒有影響，同時實現(xiàn)(1，3) - β -D-匍聚糖的回收率達80% 140%，比國際標準要求的50% 200%更加準確。本發(fā)明的檢測方法簡便、快速、安全，80分鐘內(nèi)可完成10人份的體液樣本的(1，3)-β -D-葡聚糖檢測，鑒別符合率達100%，且特異性高，可在同一反應時間內(nèi)鑒別真 菌(1，3) -β -D葡聚糖與細菌內(nèi)毒素(圖I)。


圖I為細菌內(nèi)毒素與真菌(1，3)_β -D葡聚糖同一時間反應曲線，曲線a為細菌內(nèi)毒素反應曲線，曲線b為(1，3) - β -D葡聚糖反應曲線。圖2為標準曲線圖3為標準曲線各濃度點反應光密度曲線圖曲線A為濃度為200pg/ml葡聚糖反應光密度曲線；曲線B為濃度為100pg/ml葡聚糖反應光密度曲線；曲線C為濃度為50pg/ml葡聚糖反應光密度曲線；曲線D為濃度為25pg/ml葡聚糖反應光密度曲線；曲線E為濃度為12. 5pg/ml葡聚糖反應光密度曲線；曲線F為陰性對照光密度反應曲線。圖4為檢測樣本動態(tài)反應曲線圖G為血液樣本反應光密度曲線圖；H為樣本陽性液反應光密度曲線圖為陽性對照反應光密度曲線圖；J為陰性對照反應光密度曲線圖。
具體實施例以下結合附圖以血液(1，3) _β -D葡聚糖檢測應用為例對本發(fā)明做進一步說明。人體液真菌(1，3) - β -D-葡聚糖檢測試劑盒的生產(chǎn)制造I.人體液真菌(1，3) - β -D-葡聚糖檢測試劑盒的構成包括動態(tài)濁度法反應主齊IJ、體液處理劑I號(體液處理劑)、真II號稀釋液(堿性稀釋液)、真III號稀釋液(酸性稀釋液)、(1，3) - β -D-葡聚糖質控品、細菌內(nèi)毒素檢查用水、凍干血清。2.動態(tài)濁度法反應主劑的制備工藝，主要是通過使用抗凝劑、細胞裂解液、促活劑對鱟血細胞溶解物的提取制備，具體包括以下步驟2. I采血將新鮮活鱟用酒精消毒心門采血，抗凝劑與鱟血的體積比為1:6 I :10之間為宜。2. 2抗凝劑是用純化水適量，加入預配好的輔料溶液，使其稀釋，每IOOml溶液中含咖啡因或茶堿O. 015Μ O. 04Μ,含NaClO. 25Μ O. 55Μ，過濾分裝，用流通蒸汽消毒30 40分鐘即可。2. 3分離細胞將鱟血移置適宜的離心瓶內(nèi)，在750-850轉/分的速度下離心分
離，棄血清。2. 4裂解細胞將鱟血細胞移置潔凈的收集瓶內(nèi)，按體積比加入40% 50%細胞裂解液，裂解細胞，得鱟血細胞溶解物。2. 5裂解液是用純化水適量，加入O. 05M/ml的tris-HCl溶液，調(diào)PH值為6. O
8.0，用流通蒸汽消毒30 40分鐘即可。
2. 6分離細胞壁，用有機溶媒氯仿(CHCl3)提取鱟血細胞溶解物，按體積比加入I: O. 8 I: I. 2的氯仿和聚乙二醇8000,使每毫升含聚乙二醇I. 5 3mg,隨即混合45 60分鐘，然后移置離心機離心30-40分鐘(2000 2500轉/分)分離提取物，制得反應主劑G因子、凝固酶、凝固酶原活性成分。2. 7加入促活劑，配制半成品按鱟血細胞提取物體積與促活劑體積比為1:0. 3 1:0. 5的比例加入預先調(diào)配好的促活劑攪拌均勻，制成反應主劑半成品。2. 8促活劑是在適量的純化水中加入KCUMgSO4或CaCl2溶液，使得每毫升粗活劑含KCl O. 15 O. 30M,含MgSO4O. 15 O. 30M或含CaCl2O. 20 O. 40M,過濾分裝，用流通蒸
汽消毒30 40分鐘即可。2. 9灌裝、冷凍干燥與封口 將配制的反應主劑半成品攪拌均勻，按生產(chǎn)指令要求進行分裝，在零下45°C 55°C真空冷凍干燥，在20 25°C封口，制得反應主劑成品。
3.體液處理劑I號的制備方法按處方用量分別稱取氯化鈉、緩血酸銨化學試齊IJ，置投料容器內(nèi)，添加水至配制量，使得每毫升溶液含氯化鈉8. 5mg 15mg，含緩血酸銨
O.25mg Img,用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH值5. 5 7. 5,混合均勻后,過濾分裝,用流通蒸汽消毒30 40分鐘即可。4.真II號稀釋液的制備方法按處方用量分別稱取緩血酸銨化學試劑，置投料容器內(nèi)，添加水至配制量，使得每毫升溶液含緩血酸銨O. 5-1. Omg，混合均勻后，用稀鹽酸調(diào)節(jié)PH值為10. 5 13. 5，過濾分裝，用流通蒸汽消毒30 40分鐘即可。5.真III號稀釋液的制備方法按處方用量，用稀鹽酸或冰醋酸溶液將新鮮蒸餾水的PH值調(diào)為2. O 4. 0，混合均勻后，過濾分裝，用流通蒸汽消毒30 40分鐘即可。6. (1，3)-β-D-匍聚糖質控品的制備方法用(1，3)-β-D-匍聚糖國家標準品稀釋到需要的濃度，混合均勻后分裝，零下45°C 55°C凍干，35°C —以下封口即得成品。每支質控品按標示量稀釋使用。7.檢查用水為注射用水的重蒸餾水，分裝2ml/支，封口、滅菌后，檢測不得有細菌內(nèi)毒素或(1，3)-β-D-葡聚糖，合格，用作反應主劑或凍干血清的復溶劑。8.凍干血清的制備方法將人血白蛋白或小牛血清稀釋后，加入一定的賦形劑混勻、分裝，零下45 °C 55 °C凍干，35 °C —以下封口即得成品。每支凍干品按標示量加入檢查用水復溶后使用。體液真菌(1，3) _β -D-葡聚糖檢測試劑盒的應用實現(xiàn)步驟包括標準曲線制作、體液(1，3)-β -D-葡聚糖的提取純化、樣本陽性液的制備、上機檢測，以血液(1，3)-β -D葡聚糖檢測應用為例，其具體步驟如下I.標準曲線的制作I. I標準液的準備取β -D-葡聚糖標準品I支，用75%酒精消毒后，開啟，加入Iml血清溶液溶解，置漩渦混合器混合lOmin，然后將葡聚糖標準品用血清溶液稀釋到1280pg/ml，其余稀釋方法參照表I進行操作。表I :標準溶液的制備
權利要求
1.一種人體液真菌(1，3)-β -D-葡聚糖檢測試劑盒，其特征在于包括反應主劑、體液處理劑、堿性稀釋液、酸性稀釋液、無菌水、凍干血清和(1，3)-β -D-葡聚糖質控品，所述反應主劑含有東方鱟血細胞G因子、凝固酶、凝固酶原和促活劑。
2.如權利要求I所述的一種人體液真菌(1，3)-β-D-葡聚糖檢測試劑盒，其特征在于所述反應主劑通過包括以下步驟的方法制備(1)將活體鱟用酒精消毒心門，加抗凝劑后采血，離心收集鱟血細胞，所述抗凝劑與鱟血的體積比為I :6 I : 10 ;(2)加裂解液裂解所收集的鱟血細胞，獲得鱟血細胞溶解物；(3)分離細胞壁，用有機溶媒氯仿(CHCl3)提取鱟血細胞溶解物，按體積比加入I: O. 8 1:1.2的氯仿和聚乙二醇8000，使每毫升含聚乙二醇I. 5 3mg,隨即混合45 60分鐘，然后1500r/min-3000r/min離心30 40分鐘，制得反應主劑G因子、凝固酶、凝固酶原活性成分；(4)加入促活劑，按鱟血細胞提取物體積與促活劑體積比為1:0. 3 1:0. 5的比例加入，攪拌均勻，得到反應主劑半成品，所述促活劑是在純化水中加入KCUMgSO4溶液或者KCl、CaCl2溶液，使得每毫升促活劑含KCl O. 15 O. 30M,含MgSO4O. 15 O. 30M或含CaCl2O. 20 O. 40M,過濾分裝，用流通蒸汽消毒30 40分鐘即可；(5)將配制的反應主劑半成品攪拌均勻_45°C _55°C真空冷凍干燥后20 25°C封口，制得反應主劑成品。
3.如權利要求1-2所述的一種人體液真菌(1，3)-βD-葡聚糖檢測試劑盒，其特征在于體液處理劑含有氯化鈉、緩血酸銨和稀鹽酸，所述體液處理劑的PH值在5. 5 7. 5之間。
4.如權利要求3所述的一種人體液真菌(1，3)-β-D-葡聚糖檢測試劑盒，其特征在于堿性稀釋液的PH值在10. 5 13. 5之間。
5.如權利要求4所述的一種人體液真菌(1，3)-β-D-葡聚糖檢測試劑盒，其特征在于酸性稀釋液的PH值在2. O 4. O之間。
6.如權利要求5所述的一種人體液真菌(1，3)-β-D-葡聚糖檢測試劑盒，其特征在于無菌水為注射用水的重蒸餾水。
7.如權利要求6所述的一種人體液真菌(1，3)-β-D-葡聚糖檢測試劑盒，其特征在于凍干血清為人血白蛋白或小牛血清。
8.如權利要求1-2所述的一種人體液真菌(1，3)- β -D-葡聚糖檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于東方鱟血細胞中G因子被待檢測樣本中的(1，3)- β -D-葡聚糖激活，形成凝固蛋白膠，采集其在不同時間的透光率做回歸分析，得到檢測樣本中(1，3)-β-D-葡聚糖含量，具體實現(xiàn)步驟包括標準曲線制作、體液(1，3) -β -D-葡聚糖的提取純化、樣本陽性液的制備、上機檢測。
9.如權利要求1-2所述的一種人體液真菌(1，3)- β -D-葡聚糖檢測試劑盒，其特征在于主要用于人血液或其它體液中真菌(1，3)-β-D-葡聚糖含量的測定。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種可產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的，準確、快速、特異性高的人體液真菌(1,3)-β-D葡聚糖檢測試劑盒，其特征在于包括反應主劑、體液處理劑、堿性稀釋液、酸性稀釋液、無菌水、凍干血清和(1,3)-β-D-葡聚糖質控品,所述反應主劑含有東方鱟血細胞G因子、凝固酶凝固酶原和促活劑。本發(fā)明的檢測方法簡便、快速、安全，80分鐘內(nèi)可完成10人份的體液樣本的(1,3)-β-D-葡聚糖檢測，鑒別符合率達100%，且特異性高，可在同一反應時間內(nèi)鑒別真菌(1,3)-β-D葡聚糖與細菌內(nèi)毒素。
文檔編號G01N21/59GK102866255SQ20121033880
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月13日 優(yōu)先權日2012年9月13日
發(fā)明者莫水晶, 莫世文, 莫世君 申請人:莫水晶, 莫世文, 莫世君