專利名稱：用于評估肺腺癌化療效果的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于評估肺腺癌化療效果功能的試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
肺癌是世界范圍內(nèi)常見的癌癥且是導致癌癥患者死亡的主要原因之一。在我國肺癌發(fā)病率和死亡率高居各惡性腫瘤之首。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際腫瘤研究所(TheInternational Agency for Research on Cancer, IARC)統(tǒng)計，我國 2008 年肺癌發(fā)病率為35/10萬人，并且該機構(gòu)估計至2025年，我國將每年新增肺癌100萬例。根據(jù)衛(wèi)生部2010年衛(wèi)生統(tǒng)計年鑒，截止2009年，全國肺癌死亡率為30. 83/10萬人，高于第二高死亡率的肝癌逾4/10萬人。肺癌一般分為小細胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)兩種組織學類型。非小細胞肺癌約占所有肺癌病例數(shù)的85%，并進一步分為鱗狀細胞癌、腺癌和大細胞癌等。在過去的30年中，我國肺癌組織學類型發(fā)生改變，自1970年起，腺癌發(fā)病率快速增長，并逐步取代鱗癌，成為我國肺癌最常見類型。在肺癌治療效果方面，生物標志物變得尤為重要。在肺癌患者中，目前對單次化療或抗腫瘤藥物治療的反應(yīng)率普遍低于其它疾病的治療效果。另外，化療藥物的有效濃度往往接近甚至與毒性濃度重合。因此，針對肺癌患者進行分層，同時篩選出對特定治療方案最為敏感的人群，對患者和醫(yī)生而言都具有非常重要的臨床價值。因此，探索具有化療效果評估價值的新型簡易生物標記物不僅有益于肺癌患者的個性化治療和早期干預(yù)，還會帶來巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種具有評估肺腺癌化療效果的試劑盒。
為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種用于評估肺腺癌化療效果的試劑盒，其特征在于，由細胞因子及其酶標抗體，PH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液，pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，血清蛋白稀釋液，終止液，四甲基聯(lián)苯胺底物溶液，正常人血清和陽性對照組血清組成；其中，所述的細胞因子為包括趨化因子配體21，趨化因子配體28，嗜酸性粒細胞趨化因子_3，血液濾過CC趨化因子-1，白血病抑制因子，巨噬細胞源性細胞因子，巨噬細胞炎性蛋白_3a，中性粒細胞趨化蛋白-2，人重組的巨噬細胞炎性蛋白-4，基質(zhì)細胞衍生因子-I a在內(nèi)的10種細胞因子。優(yōu)選地，所述pH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液為將I. 59克碳酸鈉和2. 93克碳酸氫鈉加至IL蒸餾水中而得。優(yōu)選地，所述pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液為將0. 2克磷酸二氫鉀，2. 9克十二水合磷酸氫二鈉，8. 0克氯化鈉，0. 2克氯化鉀，0. 5mL吐溫-20加至IL蒸餾水中而得。優(yōu)選地，所述的血清蛋白稀釋液為將0. I克牛血清、羊血清或兔血清蛋白加至IOOmL pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液而得。優(yōu)選地，所述的終止液為2M硫酸溶液。優(yōu)選地，所述的四甲基聯(lián)苯胺底物溶液為將0. 5mL溶液濃度為10mg/5mL的四甲基聯(lián)苯胺的無水乙醇溶液，IOmL pH值為5. 0的底物緩沖液與32uL體積濃度為0. 75vol %的過氧化氫水溶液混合而得；其中，所述pH值為5.0的底物緩沖液為含0.2M磷酸氫二鈉和0. IM檸檬酸的蒸餾水溶液。本發(fā)明的優(yōu)點是I、本發(fā)明首次提出包括趨化因子、炎癥相關(guān)因子，以及免疫細胞因子等多種細胞因子類別在內(nèi)的10種細胞因子或與其它臨床指標組合可成為評估肺腺癌化療效果的主要指標。 2、包括趨化因子、炎癥相關(guān)因子，以及免疫細胞因子等多種細胞因子類別在內(nèi)的10種細胞因子作為預(yù)測指標較目前用于評估肺腺癌化療效果的電子計算X射線斷層掃描指標及其它臨床指標更為客觀，而且測定此類蛋白表達水平簡單易行可靠。
具體實施例方式為使本發(fā)明更明顯易懂，茲以優(yōu)選實施例，作詳細說明如下。實施例一種用于評估肺腺癌化療效果的試劑盒，由細胞因子及其酶標抗體，pH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液，PH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，血清蛋白稀釋液，終止液，四甲基聯(lián)苯胺底物溶液，正常人血清和陽性對照血清組成；其中，所述的細胞因子是包括趨化因子配體21，趨化因子配體28，嗜酸性粒細胞趨化因子_3，血液濾過CC趨化因子-1，白血病抑制因子，巨噬細胞源性細胞因子，巨噬細胞炎性蛋白_3a，中性粒細胞趨化蛋白-2，人重組的巨噬細胞炎性蛋白-4，基質(zhì)細胞衍生因子-I a在內(nèi)的10種細胞因子。所述pH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液為將I. 59克碳酸鈉和2. 93克碳酸氫鈉加至IL蒸餾水中而得。所述PH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液為將0. 2克磷酸二氫鉀，2. 9克十二水合磷酸氫二鈉，8. 0克氯化鈉，0. 2克氯化鉀，0. 5mL吐溫-20加至IL蒸餾水中而得。所述的血清蛋白稀釋液為將0. I克牛血清、羊血清或兔血清蛋白加至IOOmL pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液而得。所述的終止液為2M硫酸溶液。所述的四甲基聯(lián)苯胺底物溶液為將0. 5mL溶液濃度為10mg/5mL的四甲基聯(lián)苯胺的無水乙醇溶液，IOmL pH值為5. 0的底物緩沖液與32uL體積濃度為0. 75V01%的過氧化氫水溶液混合而得，所述pH值為5. 0的底物緩沖液為含0. 2M磷酸氫二鈉和0. IM檸檬酸的蒸餾水溶液。上述試劑盒的使用方法如下I、包被用0. 05M pH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液將細胞因子稀釋至蛋白質(zhì)含量為l-10ug/mL。在每個聚苯乙烯的反應(yīng)孔中加0. ImL,于4°C過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液洗3次，每次3分鐘。2、加樣分別加一定血清蛋白稀釋液稀釋后的待檢樣品、正常人血清和陽性對照血清0. ImL至上述已包被的反應(yīng)孔中，置37°C孵育I小時后用pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液洗3次，每次3分鐘。3、加辣根過氧化物酶標抗體在各反應(yīng)孔中加入新鮮稀釋的辣根過氧化物酶標抗體0. ImL, 37°C孵育0. 5-1小時后用pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液洗3次，每次3分鐘。4、加底物液顯色在各反應(yīng)孔中加入四甲基聯(lián)苯胺底物溶液0. lmL，37°C下孵育10-30分鐘。5、終止反應(yīng)在各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0. 05mL。6、結(jié)果判定在ELISA檢測儀上，于450nm處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值。若大于規(guī)定的陰性對照OD值2. I倍，即為陽性。以肺腺癌化療前蛋白表達水平作為衡量標準，肺腺癌化療后患者血清蛋白譜表達量除以此標準，從而確定患者蛋白譜相對于化療前的表達比例。其中，大于或等于2. 4為增 高，小于2. 4為降低。本發(fā)明通過收集經(jīng)過臨床病理診斷確診肺腺癌有276例患者，根據(jù)首次治療方案，接受化療的有223例，通過隨機化方法抽樣了其中10例腺癌癌患者血清，并分別于化療前和化療后21天或42天采血；同時在992名健康志愿者的血清庫中，通過隨機化方法抽樣了 14例正常人血清。應(yīng)用蛋白質(zhì)芯片技術(shù)檢測血清內(nèi)40種細胞因子，同時以正常人血清中蛋白表達水平作為衡量標準，篩選肺腺癌患者在化療過程中血清蛋白譜中上調(diào)或下調(diào)的細胞因子(P < 0. 05)。最終確定腺癌患者血清蛋白譜中有10種細胞因子化療前后比較存在差異，包括7種細胞因子異向變化和3種細胞因子同向變化(如表I所示)。表I多種細胞因子在肺腺癌患者化療前、后及正常人血清中的表達變化正靈組....
___pjt_比值p 值
異向改變
嗜酸性粒細胞趨化因子-3 0.2316 0.0739 1.1110 0,0002 血液濾過 CC 趨化因子-I 0.3319 0.4599 2.8497 0.0048 巨噬細胞源性細胞因子 0.5802 0.1976 2.3380 0.0178 巨噬編胞炎性蛋白-3a0.5555 0.6164 1.7482 0.0143
中性粒鲴胞趨化蛋白-20.3557 0.1236 3.9910 ■ 0.0006
人重組的巨■細胞炎性蛋白-4 0.4056 0.1236 2.9758 0.0019 基質(zhì)細胞衍生因子-I a2.9463 0.0068 0.0407 0.0008
同向改變
趨化因子配體 21 2.7842 0.0039 1.2718 0.0074趨化因子 體 28 1.4608 0.0402 2.0579 0.0143_白血病抑制因子_1.2672 0.1137 L8894 0.014權(quán)利要求
1.一種用于評估肺腺癌化療效果的試劑盒，其特征在于，由細胞因子及其酶標抗體，PH值為9. 6的碳酸鹽緩沖液，pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液，血清蛋白稀釋液，終止液，四甲基聯(lián)苯胺底物溶液，正常人血清和陽性對照組血清組成； 其中，所述的細胞因子為包括趨化因子配體21，趨化因子配體28，嗜酸性粒細胞趨化因子_3，血液濾過CC趨化因子-1，白血病抑制因子，巨噬細胞源性細胞因子，巨噬細胞炎性蛋白_3a，中性粒細胞趨化蛋白_2，人重組的巨噬細胞炎性蛋白_4，基質(zhì)細胞衍生因子-I a在內(nèi)的10種細胞因子。
2.如權(quán)利要求I所述的用于評估肺腺癌化療效果的試劑盒，其特征在于，所述PH值為9.6的碳酸鹽緩沖液為將I. 59克碳酸鈉和2. 93克碳酸氫鈉加至IL蒸餾水中而得。
3.如權(quán)利要求I所述的用于評估肺腺癌化療效果的試劑盒，其特征在于，所述PH值為 7.4的磷酸鹽緩沖液為將0. 2克磷酸二氫鉀，2. 9克十二水合磷酸氫二鈉，8. 0克氯化鈉，0. 2克氯化鉀，0. 5mL吐溫-20加至IL蒸餾水中而得。
4.如權(quán)利要求I所述的用于評估肺腺癌化療效果的試劑盒，其特征在于，所述的血清蛋白稀釋液為將0. I克牛血清、羊血清或兔血清蛋白加至IOOmL pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液而得。
5.如權(quán)利要求I所述的用于評估肺腺癌化療效果的試劑盒，其特征在于，所述的終止液為2M硫酸溶液。
6.如權(quán)利要求I所述的用于評估肺腺癌化療效果的試劑盒，其特征在于，所述的四甲基聯(lián)苯胺底物溶液為將0. 5mL溶液濃度為10mg/5mL的四甲基聯(lián)苯胺的無水乙醇溶液，IOmLPH值為5. 0的底物緩沖液與32uL體積濃度為0. 75V01%的過氧化氫水溶液混合而得； 其中，所述pH值為5. 0的底物緩沖液為含0. 2M磷酸氫二鈉和0. IM檸檬酸的蒸餾水溶液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于評估肺腺癌化療效果功能的試劑盒，其特征在于，由細胞因子及其酶標抗體，pH值為9.6的碳酸鹽緩沖液，pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液，血清蛋白稀釋液，終止液，四甲基聯(lián)苯胺底物溶液，正常人血清和陽性對照組血清組成；所述的細胞因子為包括趨化因子，炎癥相關(guān)因子，免疫細胞因子等多種細胞因子類別在內(nèi)的10種細胞因子。本發(fā)明可協(xié)助評估肺腺癌的化療效果。
文檔編號G01N33/574GK102749448SQ20121026236
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月27日
發(fā)明者楊達偉, 王向東, 白春學 申請人:復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院