七清敗毒顆粒質(zhì)量控制方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種使用HPLC色譜法同時測定黃芪苷和大黃素含量的方法，以實現(xiàn)對七清敗毒顆粒的質(zhì)量控制，該方法包括以下步驟：分別制備黃芪苷和大黃素的標(biāo)準(zhǔn)樣品與七清敗毒顆粒的供試樣品；將上述樣品分別經(jīng)HPLC色譜層析法處理，比較計算獲得七清敗毒顆粒的供試樣品中的黃芪苷和大黃素的含量。本發(fā)明的方法是對2010版獸藥典二部中七清敗毒顆粒的質(zhì)量控制方法的改進(jìn)，本發(fā)明的方法的含量控制方法操作簡單，實現(xiàn)了對有效成分種類復(fù)雜的中藥產(chǎn)品中有效成分量化控制要求，使產(chǎn)品的質(zhì)量水平提升，可以作為新的七清敗毒顆粒的質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)方法。
【專利說明】七清敗毒顆粒質(zhì)量控制方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種七清敗毒顆粒質(zhì)量控制方法，特別是指一種對七清敗毒顆粒中黃芪苷和大黃素的含量同時進(jìn)行測定的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]七清敗毒顆粒是一種常見的獸藥方，具有清熱解毒，燥濕止瀉等功效。藥方含黃芩、虎杖、白頭翁、苦參、板藍(lán)根、綿馬貫眾、大青葉等，主要用于濕熱泄瀉，雛雞白痢，同時也用于防治豬繁殖與呼吸綜合癥、溫和性豬瘟、圓環(huán)病毒、藍(lán)耳病毒、流感病毒和禽溫和型流感、非典型新城疫、慢性呼吸道病、傳染性支氣管炎、傳染性喉氣管炎、法氏囊病、減蛋綜合癥、禽腸毒綜合癥等，還具有增強免疫、降低應(yīng)激反應(yīng)等功效，并可作為保健佳品使用。因此，七清敗毒顆粒在市場上得到普遍認(rèn)可。由于七清敗毒顆粒藥物中黃芪苷、大黃素的作用，黃芪苷、大黃素含量對七清敗毒顆粒的質(zhì)量控制非常重要?！吨腥A人民共和國獸藥典》(2010年二部)公開了一種使用薄層色譜法進(jìn)行七清敗毒顆粒質(zhì)量控制的方法，但該七清敗毒顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只對黃芩苷、虎杖、大黃素、靛藍(lán)和靛玉紅的鑒別，沒有具體的含量測定項，因此，對七清敗毒顆粒質(zhì)量控制難以達(dá)到量化的標(biāo)準(zhǔn)。
[0003]由于七清敗毒顆粒是一種含多組分復(fù)雜成分的獸藥復(fù)方中藥，由于成分復(fù)雜，造成含量不易控制，使中藥的安全性和有效性受到影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]有鑒于此，本發(fā)明的主要目的在于提供一種使用HPLC色譜法同時測定黃芪苷和大黃素含量的方法，以實現(xiàn)對七清敗毒顆粒的質(zhì)量控制。
[0005]即本發(fā)明提供了一種七清敗毒顆粒質(zhì)量控制方法，為使用HPLC色譜法同時測定黃芪苷和大黃素含量。
[0006]優(yōu)選地，本發(fā)明所述的質(zhì)量控制方法，包括以下步驟:
[0007]A、分別制備黃芪苷和大黃素的標(biāo)準(zhǔn)樣品；
[0008]B、制備七清敗毒顆粒的供試樣品；
[0009]C、將所述的黃芪苷和大黃素的標(biāo)準(zhǔn)樣品、和七清敗毒顆粒的供試樣品分別經(jīng)HPLC色譜層析法處理，比較計算獲得七清敗毒顆粒的供試樣品中的黃芪苷和大黃素的含量。
[0010]即本發(fā)明是通過將黃芪苷的標(biāo)準(zhǔn)樣品和大黃素的標(biāo)準(zhǔn)樣品、和七清敗毒顆粒的供試樣品分別經(jīng)HPLC色譜層析法處理，以獲得黃芪苷的標(biāo)準(zhǔn)樣品和大黃素的標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線后，與七清敗毒顆粒的供試樣品經(jīng)HPLC色譜層析法處理的色譜曲線對照，以獲得七清敗毒顆粒的供試樣品中的黃芪苷和大黃素的含量。
[0011]為了充分釋放七清敗毒顆粒的供試樣品，可以使用有機溶劑進(jìn)行提??；更優(yōu)選地，使用乙醇進(jìn)行提?。桓鼉?yōu)選地，使用70%的乙醇對七清敗毒顆粒的供試樣品進(jìn)行提取；也可以使用本領(lǐng)域常用的其他任何有機溶劑提取。
[0012]為了充分釋放七清敗毒顆粒的供試樣品，還可以使用機械處理的方法對七清敗毒顆粒的供試樣品進(jìn)行處理；優(yōu)選地，可以對七清敗毒顆粒進(jìn)行研磨處理；更優(yōu)選地，可以對七清敗毒顆粒進(jìn)行超聲震蕩處理；也可以使用本領(lǐng)域常用的其他機械處理的方法對七清敗毒顆粒的供試樣品進(jìn)行處理。
[0013]本發(fā)明的七清敗毒顆粒質(zhì)量控制方法中，使用了 HPLC色譜法對黃芪苷的標(biāo)準(zhǔn)樣品和大黃素的標(biāo)準(zhǔn)樣品、和七清敗毒顆粒的供試樣品進(jìn)行處理，其中，HPLC色譜法中使用的色譜柱為反相色譜柱；優(yōu)選地，HPLC色譜法中使用的色譜柱為C18柱。
[0014]優(yōu)選地，所述的HPLC色譜層析法中使用的流動相為乙腈-水-磷酸。優(yōu)選地，所述的HPLC色譜層析法中流動相比例為乙腈-水-磷酸=22:78:0.2。
[0015]優(yōu)選地，所述的HPLC色譜層析法中的流速為lml/min ;檢測波長:270nm ；柱溫:35。。。
[0016]由上可以看出，本發(fā)明提供了一種HPLC色譜法測定法，同時測定七清敗毒顆粒中的黃芪苷和大黃素含量，解決了七清敗毒顆粒的質(zhì)量控制問題。
[0017]發(fā)明效果
[0018]本發(fā)明參考2010版獸藥典二部黃芩中黃芩苷和虎杖中大黃素的含量的檢測方法，結(jié)合實際情況進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)，并經(jīng)方法學(xué)驗證。該七清敗毒顆粒的含量控制方法操作簡單，實現(xiàn)了對有效成分種類復(fù)雜的中藥產(chǎn)品中有效成分量化控制要求，使產(chǎn)品的質(zhì)量水平提升，具有商業(yè)上推廣的前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0019]圖1為黃芪苷的標(biāo)準(zhǔn)樣品和大黃素的標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖；
[0020]圖2為陰性對照的色譜圖；
[0021]圖3為七清敗毒顆粒的供試樣品的色譜圖。
【具體實施方式】
[0022]本發(fā)明實施例中使用的C18柱是指反相ODS柱(十八烷基硅烷鍵合硅膠填料，Octadecylsilyl,簡稱ODS柱),通過本發(fā)明的實施例,本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉所有的C18柱都可以用來實現(xiàn)本發(fā)明，如waters的Symmetry-R)Cl 8色譜柱等都可以實現(xiàn)本發(fā)明。
[0023]下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0024]實施例1HPLC法同時測定七清敗毒顆粒中黃芩苷和大黃素的含量
[0025]本發(fā)明實施例中HPLC色譜條件為:
[0026]色譜柱:Agilent_C18(150mm X 4.6mm, 5um)。
[0027]流動相:乙腈-水-磷酸(22:78:0.2 )
[0028]流速:lml/min;檢測波長:270nm ;柱溫:35°C。
[0029]對照品溶液制備:取60°C減壓干燥4h的黃芩苷對照品和大黃素對照品各適量，精密稱定，置同一 25ml量瓶中，加入70%的乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每毫升含黃芩苷0.3mg、大黃素20ug的對照品溶液。[0030]供試品溶液制備:取研細(xì)的供試品約0.2g，精密稱定，置25ml量瓶中，加入70%的乙醇20ml，超聲振蕩提取15min后，放冷至室溫，加70%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。
[0031]測定法:精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10ul，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以外標(biāo)法按峰面積計算，即得。
[0032]本發(fā)明的含量測定方法采用的色譜條件、樣品處理方法均為新方法。
[0033]1、儀器與試劑、樣品
[0034]儀器:WaterSe2695高效液相色譜儀；UV2489紫外檢測器。
[0035]試劑:甲醇、乙睛為色譜純；冰醋酸為分析純；水為二次重蒸水。
[0036]對照品:黃芩苷(110715-201014)、大黃素(110756-201110)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所
[0037]樣品:七清敗毒顆粒，由洛陽惠中獸藥有限公司生產(chǎn)。{[處方]黃芩IOOg虎杖IOOg白頭翁80g苦參80g板藍(lán)根IOOg綿馬貫眾60g大青葉40g ;[制法]以上7味，加水煎煮2次，第一次2小時，第二次I小時，煎液濾過，濾液合并，80°C以下減壓濃縮至相對密度為1.30?1.35 (55°C)，得清膏，加入適量的蔗糖和糊精，混勻，制成顆粒，干燥，制成560g，
即得。I
[0038]2色譜條件:
[0039]色譜柱:Agilent_C18(150mm X 4.6mm, 5um)。
[0040]流動相:乙腈-水-磷酸(22:78:0.2 )
[0041]流速:lml/min;檢測波長:270nm ;柱溫:35°C。
[0042]3溶液的制備:
[0043]①對照品溶液的制備:
[0044]a.取60°C減壓干燥4h的黃芩苷對照品適量，精密稱定，置25ml量瓶中，加入70%的乙醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成每毫升含黃芩苷0.3mg的對照品溶液。
[0045]b.取60°C減壓干燥4h的大黃素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每Iml約含大黃素20ug的對照品溶液。
[0046]②供試品溶液的制備:取研細(xì)的供試品約0.2g,精密稱定，置25ml量瓶中，加入70%的乙醇20ml，超聲振蕩提取15min后，放冷至室溫，加70%的乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。
[0047]③陰性樣品的制備:取未加黃芩和虎杖的樣品，按供試品溶液的制備方法制備，按要點2中的色譜條件測定，結(jié)果見圖2。在與對照品圖譜(圖1)比較可見，在對照品圖譜中黃芩苷、大黃素峰出現(xiàn)的位置上未見有峰出現(xiàn)。
[0048]4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:
[0049]分別取要點3中對照品溶液5，10，20，30，50ul,注入高效液相色譜儀，按照要點2的色譜條件，得到圖1的色譜圖，測定峰面積。以對照進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程黃芩苷:y=93186x+25150，R2=0.9993 ;大黃素:y=6021.2x-22.043，R2=0.9991。結(jié)果表明黃芩苷在1.5?15ug,大黃素在100?IOOOng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
[0050]5精密度試驗:[0051]取七清敗毒顆粒1份，按要點3項下②中方法制備供試液，取供試液10ul，按上述色譜條件測定，結(jié)果如圖3。連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，以外標(biāo)法計算黃芩苷和大黃素的含量，結(jié)果測得RSD分別為1.34%和2.16%。
[0052]6回收率測定:
[0053]取己知含量的七清敗毒顆粒6份，精密稱定，分別向其中加入黃芩苷對照品溶液10ml、大黃素對照品溶液IOml按3項下②中方法制備供試液，在要點2的色譜條件下測定各自含量，計算回收率。結(jié)果平均回收率分別為98.05%,97.94%, RSD分別為1.93%,2.08%。
[0054]7樣品測定:
[0055]分別取相同工藝制備的12個批號七清敗毒顆粒樣品(批號:100501、100502、100503、100504、100601、100602、100603、100604、100702、100703、100704、100801 洛陽惠
中獸藥有限公司生產(chǎn))，按3項下②中方法制備供試液，分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液10ul，按上述色譜條件，測定，計算樣品中黃芩苷和大黃素的含量。經(jīng)對12批樣品進(jìn)行黃芩苷和大黃素含量測定，結(jié)果如下表1。其中黃芩苷最高值為17.186mg/g，最低值為14.534mg/g，大黃素最高值為1.307mg/g，最低值為1.009mg/g。根據(jù)黃苗藥材中黃岑苷的限量為9.0%，虎杖藥材中大黃素的限量為0.6%，計算得本品中黃芩苷的理論含量為
16.07mg/g，大黃素為1.07mg/g。考慮到大生產(chǎn)過程中的損失，將本品中黃芩苷的含量的限度定為每克顆粒中不少于12.5mg,大黃素為0.8mg/g,以控制內(nèi)在質(zhì)量。
[0056]表1使用本發(fā)明的方法 對12批樣品的測定結(jié)果
[0057]
【權(quán)利要求】
1.一種七清敗毒顆粒質(zhì)量控制方法，其特征在于，所述方法為使用HPLC色譜法同時測定黃芪苷和大黃素含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括以下步驟: A、分別制備黃芪苷和大黃素的標(biāo)準(zhǔn)樣品； B、制備七清敗毒顆粒的供試樣品； C、將所述的黃芪苷和大黃素的標(biāo)準(zhǔn)樣品、和七清敗毒顆粒的供試樣品分別經(jīng)HPLC色譜層析法處理，比較計算獲得七清敗毒顆粒的供試樣品中的黃芪苷和大黃素的含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟B中所述的七清敗毒顆粒的供試樣品為使用超聲震蕩方法處理的。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟C中所述的HPLC色譜層析法中使用的流動相為乙腈-水-磷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述步驟C中所述的HPLC色譜層析法中流動相比例為乙腈-水-磷酸=22:78:0.2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟C中所述的HPLC色譜層析法中使用色譜柱為反相柱。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟C中所述的HPLC色譜層析法中使用色譜柱為C18柱。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟C中所述的HPLC色譜層析法中的流速為lml/min ;檢測波長:270nm;柱溫:35。。。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8所述的方法，其特征在于，所述步驟C中所述的黃芪苷的標(biāo)準(zhǔn)樣品和大黃素的標(biāo)準(zhǔn)樣品、和七清敗毒顆粒的供試樣品為使用相同的HPLC色譜條件處理。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任意一項所述的方法在七清敗毒顆粒質(zhì)量控制中的用途。
【文檔編號】G01N30/88GK103575841SQ201210257529
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月23日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月23日
【發(fā)明者】張許科, 劉興金, 張曉會 申請人:洛陽惠中獸藥有限公司