專利名稱：一種蝦類胚胎的細胞核染色方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種胚胎的細胞核染色方法，具體涉及一種蝦類胚胎的細胞核染色方法。
背景技術(shù)：
DAPI即4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚，可以穿透細胞膜與細胞核中的雙鏈DNA結(jié)合而發(fā)揮標(biāo)記作用，常用于細胞核染色以及某些特定情況下的雙鏈DNA染色。蝦屬節(jié)肢動物，體外由甲殼覆蓋，種類繁多，具有很好的養(yǎng)殖效益和產(chǎn)業(yè)前景。在水產(chǎn)苗種繁育領(lǐng)域，常常需要對胚胎的發(fā)育過程進行檢測和監(jiān)控，觀察胚胎發(fā)育的實時進展。目前，蝦類的胚胎發(fā)育觀測主要是利用顯微鏡對胚胎外部形態(tài)變化和發(fā)育情況進行觀察，還未有合適的檢測手段對胚胎細胞的分裂和分化情況進行檢測。其主要原因是蝦類胚胎外部包裹的初級卵黃膜干擾了染料穿透，從而妨礙了其對細胞核及雙鏈DNA的染色效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種蝦類胚胎的細胞核染色方法，實現(xiàn)蝦類胚胎發(fā)育各個階段的細胞分裂和分化的觀測要求。本發(fā)明為解決其技術(shù)問題所采取的技術(shù)方案是
步驟(I).取蝦類胚胎，置于3 5倍胚胎體積的A溶液中，常溫條件下振蕩20 40分鐘，得到第一次處理后的胚胎液；
所述的A溶液為體積比為1:1的正庚烷和多聚甲醛溶液的混合液，其中多聚甲醛溶液中多聚甲醛的質(zhì)量含量為4 % ；
步驟(2).待第一次處理后的胚胎液靜置分層后用移液槍移除上層液相，得到的固相為第一次處理后的胚胎；
此時的液相包括水相和正庚烷；
步驟(3).將第一次處理后的胚胎重新加入2倍胚胎體積的正庚烷和4倍胚胎體積的甲醇，充分混合后得到第二次處理后的胚胎液；
步驟(4).待第二次處理后的胚胎液靜置分層后用移液槍移除上層溶液和中間層膜狀組織，得到第二次處理后的胚胎；
步驟(5).將第二次處理后的胚胎加入3 5倍胚胎體積的甲醇進行洗滌，靜置分層后用移液槍移除液相，重復(fù)洗滌3 5次，得到第三次處理后的胚胎；
此時的液相為甲醇；
步驟￠).將第三次處理后的胚胎加入3 5倍胚胎體積的緩沖液進行洗滌，靜置分層后用移液槍移除液相，重復(fù)洗滌3 5次，得到第四次處理后的胚胎；
所述的緩沖液為含有曲拉通X-100的磷酸緩沖液，緩沖液中曲拉通X-100的體積含量為 0. 3 % ；
此時的液相為緩沖液；
步驟(7).將第四次處理后的胚胎避光浸泡在I 2倍胚胎體積的濃度為5 lOug/ml的DAPI溶液中15 30分鐘，進行細胞核染色，得到染色后的胚胎液；
步驟(8).待染色后的胚胎液靜置分層后用移液槍移除液相，得到染色后的胚胎； 此時的液相為DAPI溶液；
步驟(9).將染色后的胚胎加入3 5倍胚胎體積的磷酸緩沖液進行洗滌，靜置分層后用移液槍移除液相，重復(fù)洗滌3 5次，得到最終的胚胎；
此時的液相為磷酸緩沖液。
本發(fā)明方法解決了水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域蝦類胚胎發(fā)育過程中細胞分裂和分化觀察時遇到的技術(shù)難題。通過有機溶劑的預(yù)處理作用，去除蝦類胚胎外部的初級卵黃膜，再結(jié)合DAPI對細胞核的染色方法，實現(xiàn)蝦類胚胎細胞核物質(zhì)的快速簡便染色。本發(fā)明操作方法簡單，實施步驟快捷，染色效果清晰。
具體實施例方式實施例I
步驟(I).取蝦類胚胎，置于3倍胚胎體積的A溶液中，常溫條件下振蕩20分鐘，得到第一次處理后的胚胎液；
所述的A溶液為體積比為1:1的正庚烷和多聚甲醛溶液的混合液，其中多聚甲醛溶液中多聚甲醛的質(zhì)量含量為4 % ；
步驟(2).待第一次處理后的胚胎液靜置分層后用移液槍移除上層液相，得到的固相為第一次處理后的胚胎；
步驟(3).將第一次處理后的胚胎重新加入2倍胚胎體積的正庚烷和4倍胚胎體積的甲醇，充分混合后得到第二次處理后的胚胎液；
步驟(4).待第二次處理后的胚胎液靜置分層后用移液槍移除上層溶液和中間層膜狀組織，得到第二次處理后的胚胎；
步驟(5).將第二次處理后的胚胎加入3倍胚胎體積的甲醇進行洗滌，靜置分層后用移液槍移除液相，重復(fù)洗滌3次，得到第三次處理后的胚胎；
步驟￠).將第三次處理后的胚胎加入3倍胚胎體積的緩沖液進行洗滌，靜置分層后用移液槍移除液相，重復(fù)洗滌3次，得到第四次處理后的胚胎；
所述的緩沖液為含有曲拉通X-100的磷酸緩沖液，緩沖液中曲拉通X-100的體積含量為 0. 3 % ；
步驟(7).將第四次處理后的胚胎避光浸泡在I倍胚胎體積的濃度為5ug/ml的DAPI溶液中30分鐘,進行細胞核染色,得到染色后的胚胎液；
步驟(8).待染色后的胚胎液靜置分層后用移液槍移除液相，得到染色后的胚胎；
步驟(9).將染色后的胚胎加入3倍胚胎體積的磷酸緩沖液進行洗滌，靜置分層后用移液槍移除液相，重復(fù)洗滌3次，得到最終的胚胎。實施例2
步驟(I).取蝦類胚胎，置于5倍胚胎體積的A溶液中，常溫條件下振蕩30分鐘，得到第一次處理后的胚胎液；
所述的A溶液為體積比為1:1的正庚烷和多聚甲醛溶液的混合液，其中多聚甲醛溶液中多聚甲醛的質(zhì)量含量為4 % ；
步驟(2).待第一次處理后的胚胎液靜置分層后用移液槍移除上層液相，得到的固相為第一次處理后的胚胎；
步驟(3).將第一次處理后的胚胎重新加入2倍胚胎體積的正庚烷和4倍胚胎體積的甲醇，充分混合后得到第二次處理后的胚胎液；
步驟(4).待第二次處理后的胚胎液靜置分層后用移液槍移除上層溶液和中間層膜狀組織，得到第二次處理后的胚胎；
步驟(5).將第二次處理后的胚胎加入5倍胚胎體積的甲醇進行洗滌，靜置分層后用移液槍移除液相，重復(fù)洗滌5次，得到第三次處理后的胚胎；
步驟￠).將第三次處理后的胚胎加入5倍胚胎體積的緩沖液進行洗滌，靜置分層后用移液槍移除液相，重復(fù)洗滌5次，得到第四次處理后的胚胎；
所述的緩沖液為含有曲拉通X-IOO的磷酸緩沖液，緩沖液中曲拉通X-100的體積含量為 0. 3 % ；
步驟(7).將第四次處理后的胚胎避光浸泡在2倍胚胎體積的濃度為lOug/ml的DAPI溶液中15分鐘，進行細胞核染色，得到染色后的胚胎液；
步驟(8).待染色后的胚胎液靜置分層后用移液槍移除液相，得到染色后的胚胎；
步驟(9).將染色后的胚胎加入5倍胚胎體積的磷酸緩沖液進行洗滌，靜置分層后用移液槍移除液相，重復(fù)洗滌5次，得到最終的胚胎。 實施例3
步驟(I).取蝦類胚胎，置于4倍胚胎體積的A溶液中，常溫條件下振蕩40分鐘，得到第一次處理后的胚胎液；
所述的A溶液為體積比為1:1的正庚烷和多聚甲醛溶液的混合液，其中多聚甲醛溶液中多聚甲醛的質(zhì)量含量為4 % ；
步驟(2).待第一次處理后的胚胎液靜置分層后用移液槍移除上層液相，得到的固相為第一次處理后的胚胎；
步驟(3).將第一次處理后的胚胎重新加入2倍胚胎體積的正庚烷和4倍胚胎體積的甲醇，充分混合后得到第二次處理后的胚胎液；
步驟(4).待第二次處理后的胚胎液靜置分層后用移液槍移除上層溶液和中間層膜狀組織，得到第二次處理后的胚胎；
步驟(5).將第二次處理后的胚胎加入4倍胚胎體積的甲醇進行洗滌，靜置分層后用移液槍移除液相，重復(fù)洗滌4次，得到第三次處理后的胚胎；
步驟￠).將第三次處理后的胚胎加入4倍胚胎體積的緩沖液進行洗滌，靜置分層后用移液槍移除液相，重復(fù)洗滌4次，得到第四次處理后的胚胎；
所述的緩沖液為含有曲拉通X-100的磷酸緩沖液，緩沖液中曲拉通X-100的體積含量為 0. 3 % ；
步驟(7).將第四次處理后的胚胎避光浸泡在I. 5倍胚胎體積的濃度為7ug/ml的DAPI溶液中20分鐘,進行細胞核染色,得到染色后的胚胎液；步驟(8).待染色后的胚胎液靜置分層后用移液槍移除液相，得到染色后的胚胎；
步驟(9).將染色后 的胚胎加入4倍胚胎體積的磷酸緩沖液進行洗滌，靜置分層后用移液槍移除液相，重復(fù)洗滌4次，得到最終的胚胎。
權(quán)利要求
1. 一種蝦類胚胎的細胞核染色方法，其特征在于該方法的具體步驟 步驟(I).取蝦類胚胎，置于3 5倍胚胎體積的A溶液中，常溫條件下振蕩20 40分鐘，得到第一次處理后的胚胎液； 所述的A溶液為體積比為1:1的正庚烷和多聚甲醛 溶液的混合液，其中多聚甲醛溶液中多聚甲醛的質(zhì)量含量為4 % ； 步驟(2).待第一次處理后的胚胎液靜置分層后用移液槍移除上層液相，得到的固相為第一次處理后的胚胎； 步驟(3).將第一次處理后的胚胎重新加入2倍胚胎體積的正庚烷和4倍胚胎體積的甲醇，充分混合后得到第二次處理后的胚胎液； 步驟(4).待第二次處理后的胚胎液靜置分層后用移液槍移除上層溶液和中間層膜狀組織，得到第二次處理后的胚胎； 步驟(5).將第二次處理后的胚胎加入3 5倍胚胎體積的甲醇進行洗滌，靜置分層后用移液槍移除液相，重復(fù)洗滌3 5次，得到第三次處理后的胚胎； 步驟￠).將第三次處理后的胚胎加入3 5倍胚胎體積的緩沖液進行洗滌，靜置分層后用移液槍移除液相，重復(fù)洗滌3 5次，得到第四次處理后的胚胎； 所述的緩沖液為含有曲拉通X-100的磷酸緩沖液，緩沖液中曲拉通X-100的體積含量為 0. 3 % ； 步驟(7).將第四次處理后的胚胎避光浸泡在I 2倍胚胎體積的濃度為5 lOug/ml的DAPI溶液中15 30分鐘，進行細胞核染色，得到染色后的胚胎液； 步驟(8).待染色后的胚胎液靜置分層后用移液槍移除液相，得到染色后的胚胎； 步驟(9).將染色后的胚胎加入3 5倍胚胎體積的磷酸緩沖液進行洗滌，靜置分層后用移液槍移除液相，重復(fù)洗滌3 5次，得到最終的胚胎。
全文摘要
本發(fā)明公布了一種蝦類胚胎的細胞核染色方法。本發(fā)明方法首先取蝦類胚胎置于3～5倍胚胎體積的A溶液中,靜置分層后移除上層液相；加入2倍胚胎體積的正庚烷和4倍胚胎體積的甲醇，靜置分層后移除上層溶液和中間層膜狀組織；加入3～5倍胚胎體積的甲醇進行洗滌，重復(fù)洗滌3～5次；加入3～5倍胚胎體積的緩沖液進行洗滌，重復(fù)洗滌3～5次；避光浸泡在1～2倍胚胎體積的濃度為5～10μg/ml的DAPI溶液中進行細胞核染色，靜置分層后移除液相；加入3～5倍胚胎體積的磷酸緩沖液進行洗滌，重復(fù)洗滌3～5次，得到最終的胚胎。本發(fā)明操作方法簡單，實施步驟快捷，染色效果清晰。
文檔編號G01N1/30GK102749243SQ201210245038
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月16日
發(fā)明者俞炎琴, 莊浩瀚, 楊勁樹, 楊衛(wèi)軍, 楊帆, 錢葉青, 馬文明 申請人:浙江大學(xué)舟山海洋研究中心