專利名稱：食品輻照標(biāo)志物DiHT類通用半抗原、人工抗原及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫檢測及生物化工技術(shù)領(lǐng)域，涉及ー種食品輻照標(biāo)志物DiHT類通用半抗原、人工抗原及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
輻照技術(shù)經(jīng)過幾十年的研究，作為ー種高效、生態(tài)、安全的高新技術(shù)，對確保食品的衛(wèi)生安全、減少產(chǎn)后損失、促進(jìn)貿(mào)易與消費(fèi)起著不可替代的作用。其應(yīng)用已經(jīng)被越來越多的國家所認(rèn)可，據(jù)初步統(tǒng)計，全球已有38個國家和地區(qū)批準(zhǔn)了 548種食品和調(diào)味品可用輻照處理。但是鑒于輻照食品的特殊性，CAC輻照食品的通用標(biāo)準(zhǔn)和很多國家的法規(guī)都規(guī)定對 輻照食品要進(jìn)行標(biāo)識，CAC輻照食品的通用規(guī)則中規(guī)定，輻照食品的最大吸收劑量不應(yīng)超過IOkGy,即使最終產(chǎn)品的輻照成分構(gòu)成小于1%，也必須強(qiáng)制在標(biāo)簽上注明該產(chǎn)品已輻照。目前為止，CAC已經(jīng)頒布了十種輻照食品的鑒定方法，如熱釋光(TL)法、電子自旋共振(ESR)法和光釋光(PSI)法、DNA彗星法等，為輻照食品的監(jiān)管提供技術(shù)支撐，但這些鑒定方法檢測的時間長、前處理繁瑣、需要昂貴的儀器設(shè)備和需要專業(yè)人員操作。隨著輻照食品國際貿(mào)易的正常進(jìn)行，各國對輻照食品鑒定技術(shù)的要求愈加迫切，在國際貿(mào)易中，尤其是海關(guān)和商檢部門，需要鑒定的樣品越來越多，急需建立簡便、快速、特異、靈敏的鑒定方法。酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme-linkedimmunsorbent assay,簡稱 ELISA)是一種結(jié)合免疫特異反應(yīng)和酶促反應(yīng)的快速檢測方法，它基于抗原與抗體的特異性反應(yīng)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、分析量大、安全快速等優(yōu)點(diǎn)，在檢測食品中藥物殘留及真菌毒素等危害物等方面得到廣泛應(yīng)用。酶聯(lián)免疫分析在輻照食品鑒定中的應(yīng)用探索已有ー些報道，如食品福照特異產(chǎn)物2-十二燒基環(huán)丁酮的測定方法研究等(Christopher T. Elliott, LynneHamilton. Detection of Irradiated ChicKen Meat Dy Analysis of Lipid Extracts for2-Substituted Cyclobutanones Using an Enzyme Linked Immunosorbent[J]. Analyst,1995,120 :2337-2341 ；Lynne Hamilton，M. Hilary Stevenson, Derek R. Boyd. Detectionof 2-substituted eyelobutanes as irradiation products of lipid-containingfoods synthesis and applications of cis-and trans_2_(tetradec-5 ! -enyl)cyclobutanones andll-(2/ -oxocyclobutyl)undecanoic acid[J]. J. Chem. Soc. , PerkinTrans. 1，1996，139—146 ；Anne L. Tyreman，Graham A. Bonwick，Christopher J. Smith.Detection of irradiated food by immunoassay-development and optimizationof an ELISA for dihydrothymidine in irradiated prawns [J]. InternationalJournal of Food Science&Technology. 2004,39 :533-540 ；Williams, J.HH. Tyreman,AL.Immunological detection of modified DNA bases in irradiated food[J]. In Detection Methods for Irradiated Food Current Status，1996. 367-374.)。人工抗原的合成是食品免疫檢測中抗體制備和建立免疫分析方法最關(guān)鍵的步驟，半抗原的合成是人工抗原合成的基礎(chǔ)。大多數(shù)半抗原是分子量小于1000的小分子化合物，本身不具備免疫原性，因此，必須先小分子與載體蛋白子偶聯(lián)制備出完全抗原。如果小分子半抗原不能直接通過雙功能交聯(lián)劑與載體蛋白共價偶聯(lián)，則需先通過衍生過程在小分子上產(chǎn)生活性功能團(tuán)，以此作為半抗原，再與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)。DiHT是ー種小分子，相對分子量為244. 24，為半抗原，無法為免疫T細(xì)胞提供識別位點(diǎn)，不具備免疫原性，所以在制備人工抗原前，要對其末端基團(tuán)進(jìn)行改造，由于DiHT本身上沒有與蛋白質(zhì)偶聯(lián)的活性基團(tuán)，必須對半抗原進(jìn)行修飾，修飾上合適的連接臂。半抗原設(shè)計的關(guān)鍵是盡可能的保留原待測物質(zhì)的特征結(jié)構(gòu)，并在適當(dāng)?shù)奈恢靡牒线m的連接臂和與載體蛋白偶聯(lián)的活性基團(tuán)。不同結(jié)構(gòu)的連接臂、不同的偶聯(lián)方法或連接臂的引入位置，都影響后續(xù)建立的ELISA檢測的靈敏度和特異性。目前，以ニ氫脫氧胸腺嘧啶(DiHT)衍生物為半抗原制備合成抗體和人工抗原進(jìn)行酶聯(lián)免疫分析(ELISA)鮮有報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明根據(jù)上述領(lǐng)域的需求和空白，提供ー種食品輻照標(biāo)志物DiHT通用半抗原、人工抗原及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明以ニ氫脫氧胸腺嘧啶(DiHT)為初始反應(yīng)物，應(yīng)用琥珀酸酐法合成ニ氫脫氧胸腺嘧啶的衍生物，即半抗原DiHT-COOH ;采用混合酸酐法與活化酯法分別將半抗原與載體蛋白BSA、OVA進(jìn)行偶聯(lián)，制備ニ氫脫氧胸腺嘧啶的人工抗原和包被原，該人工抗原免疫BALB/c小鼠制備多抗血清，間接非競爭ELISA方法檢測效價達(dá)I 2. 56 X IO4,多抗血清對DiHT的IC5tl為191. 8669ng/mL，表明所獲DiHT抗血清對DiHT類物質(zhì)具有較高的親和性，而且本發(fā)明產(chǎn)率高效果好，簡便快捷，為建立基于食品特異輔解產(chǎn)物DiHT的食品輻照免疫鑒定技術(shù)提供基礎(chǔ)。ー種ニ氫脫氧胸腺嘧啶類通用半抗原，具有如下分子結(jié)構(gòu)
權(quán)利要求
1.一種二氫脫氧胸腺嘧啶類通用半抗原，具有如下分子結(jié)構(gòu)O
2.一種二氫脫氧胸腺嘧啶類人工通用抗原，其特征在于使用如下結(jié)構(gòu)的分子，
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人工通用抗原，所述載體蛋白指牛血清白蛋白BSA或卵白蛋白0VA，制備得到的抗原分別為免疫原和包被原。
4.權(quán)利要求2或3所述人工通用抗原的制備方法，包括如下制備步驟 (1)合成通用半抗原； (2)所述通用半抗原與載體蛋白偶聯(lián)； 所述半抗原DiHT-COOH與載體蛋白質(zhì)BSA偶聯(lián)的合成路線為
5.權(quán)利要求4所述人工通用抗原的制備方法，所述通用半抗原的制備步驟為 (1)稱取DiHT5mg和琥拍酸酐16. 4mg,溶于5mL無水卩比卩定中，6(TC加熱，攪拌，回流IOh ； (2)反應(yīng)結(jié)束后，向溶液中加入IOmL二氯甲烷，收集下層混合物，然后用IOmL 5% (v/v)鹽酸洗3次，棄掉二氯甲烷層，殘留物用IOmL乙醚溶解，用IOmL去離子水洗3次，純化得半抗原。
6.權(quán)利要求4或5所述的制備方法，采用混合酸酐法將所述通用半抗原與載體蛋白BSA偶聯(lián)制備免疫原或包被原，步驟如下 A,HT-COOH粉末6. 68mg溶于3mL無水DMF中，振蕩攪拌，加入40 μ L三正丁胺，冰浴下加入氯甲酸異丁酯40yL，4°C攪拌反應(yīng)lh，后升至室溫lh，得溶液1， B、稱120mgBSA溶于12mL O. 2mol/L的硼酸鹽緩沖液(pH = 8. 7)中，得溶液2， C、將溶液I于室溫攪拌下逐滴加入到溶液2中去，于15°C下攪拌過夜，混合液4°C蒸餾水?dāng)嚢柰肝觯?h換水一次，共換6次，直到透析液中測不出半抗原紫外吸收為止，冷凍干燥，得 DiHT-COOH-BSA ； 或采用活化酯法制備將所述通用半抗原與載體蛋白OVA偶聯(lián)制備免疫原或包被原，步驟如下 A、稱取DiHT-COOH粉末6.68mg溶于ImL無水DMF中，然后將80mg DCC加熱溶解于3mL無水DMF中，將DCC溶解冷卻至室溫加到MBC溶液中，加入28mg NHS,室溫下攪拌反應(yīng)5h，然后置4°C冰箱中密閉靜置2h以上，離心取上清液，得溶液3，B、稱取OVA 40mg，分別溶于 4mL、0. 05mol/L、pH = 8· O 的 PB 中，得溶液 4， C、將溶液3拌加入至溶液4，然后逐漸升至室溫攪拌反應(yīng)lh，于4°C下緩慢攪拌反應(yīng)過夜，次日，將反應(yīng)液分別裝入透析袋內(nèi)，于O. 01mol/L、pH = 7. 4的PBS和4°C條件下透析，每6h換一次透析液，共換6次，直至透析液中檢不出半抗原紫外吸收為止，得DiHT-C00H-0VA。
7.權(quán)利要求2或3所述的人工通用抗原作為免疫原在制備用于檢測二氫脫氧胸腺嘧啶類的抗體或抗血清中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求2或3所述的人工通用抗原在采用間接Elisa法檢測二氫脫氧胸腺嘧啶類中作為包被原的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求2或3所述的人工通用抗原作為免疫原免疫動物制備得到的抗血清、多克隆抗體、抗體或雜交瘤細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明提供一種食品輻照標(biāo)志物DiHT通用半抗原、人工抗原及其制備方法與應(yīng)用。本發(fā)明以二氫脫氧胸腺嘧啶(DiHT)為初始反應(yīng)物，應(yīng)用琥珀酸酐法合成二氫脫氧胸腺嘧啶的衍生物，即半抗原DiHT-COOH；采用混合酸酐法與活化酯法分別將半抗原與載體蛋白BSA、OVA進(jìn)行偶聯(lián)，制備二氫脫氧胸腺嘧啶的人工抗原和包被原，該人工抗原免疫BALB/c小鼠制備多抗血清，間接非競爭ELISA方法檢測效價達(dá)1∶2.56×104，多抗血清對DiHT的IC50為191.8669ng/mL，表明所獲DiHT抗血清對DiHT類物質(zhì)具有較高的親和性，而且本發(fā)明產(chǎn)率高效果好，簡便快捷，為建立基于食品特異輔解產(chǎn)物DiHT的食品輻照免疫鑒定技術(shù)提供基礎(chǔ)。
文檔編號G01N21/33GK102659883SQ201210047848
公開日2012年9月12日 申請日期2012年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日
發(fā)明者李淑榮, 李秉超, 潘家榮, 王志東, 王志偉, 王磊, 睢珂, 高美須 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所, 中國計量學(xué)院